公猪精液带毒与精液净化技术进展课件

公猪精液带毒公猪精液带毒与精液净化技术进展与精液净化技术进展 况况 洪洪 第九届全国第九届全国AIAI关键技术研讨会关键技术研讨会 2015/06/03 2015/06/03 北京雁栖湖北京雁栖湖公猪精液带毒与精液净化技术进展 1两个主题两个主题n养猪业精液污染问题探讨养猪业精液污染问题探讨n精液净化技术研究进展精液净化技术研究进展两个主题养猪业精液污染问题探讨“精液精液”在疾病传播中在疾病传播中 扮演什么角色？扮演什么角色？AI AI 是一种将优秀基因引入母猪群是一种将优秀基因引入母猪群的非常有效的工具。的非常有效的工具。“精液”在疾病传播中AI 是一种将优秀基因引入母猪群的非常有 猪垂直传播疾病猪垂直传播疾病母猪母猪仔猪：仔猪：1 1、经胎盘血液直接感染 2、分娩时直接或间接接触感染 3、乳汁（如：仔猪流行性腹泻）种公猪种公猪精液精液母猪：母猪：垂直传播垂直传播：病原体经母体卵巢、子宫或胎盘、初 乳等传给子代的过程。人工授精自然交配精液精液 猪垂直传播疾病母猪仔猪：1、经胎盘血液直接感染种公公猪公猪精液精液中能检出的病毒中能检出的病毒-国外报导国外报导引自引自Viruses in boar semen:detection and clinical as well as epidemiological consequences regarding disease transmission by artificial insemination Theriogenology 63(2005)556572传播播风险最大，最大，感染后感染后750d精液精液排毒，持排毒，持续期期长；对精子精子产生生过程程有有显著影响，降著影响，降低精子量和精子低精子量和精子活力。活力。能感染公猪睾丸，能感染公猪睾丸，从精液排毒，并从精液排毒，并能通能通过人工受精人工受精感染母猪，病毒感染母猪，病毒能通能通过胎胎盘屏障屏障感染仔猪，胚胎感染仔猪，胚胎仔猪仔猪间能互相能互相传染。染。公猪精液中能检出的病毒-国外报导引自Viruses in 公猪公猪精液精液中能检出的细菌中能检出的细菌p其他：芽孢杆菌、放线杆菌、黄杆菌、克雷伯菌、柠檬酸杆菌、变形杆菌、其他：芽孢杆菌、放线杆菌、黄杆菌、克雷伯菌、柠檬酸杆菌、变形杆菌、肠杆菌、沙雷氏菌、产检杆菌、棒状杆菌、绿脓杆菌、肠球菌、念珠菌、波肠杆菌、沙雷氏菌、产检杆菌、棒状杆菌、绿脓杆菌、肠球菌、念珠菌、波氏菌、产气杆菌氏菌、产气杆菌p非猪病原体，但可以杀死精子：非猪病原体，但可以杀死精子：木糖氧化产碱菌、洋葱假单胞菌、阴沟肠杆木糖氧化产碱菌、洋葱假单胞菌、阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌、嗜麦芽糖黄单胞菌。菌、黏质沙雷菌、嗜麦芽糖黄单胞菌。来自美来自美国和瑞国和瑞典人工典人工授精中授精中心数据心数据公猪精液中能检出的细菌其他：芽孢杆菌、放线杆菌、黄杆菌、克雷公猪公猪精液精液中能检出的病毒中能检出的病毒国内数据国内数据公猪精液中能检出的病毒国内数据10有很确切的证据表明欧洲型蓝耳是引种来的有很确切的证据表明欧洲型蓝耳是引种来的11王军一，金扩世，徐敬龙.山东种公猪精液携带主要病原的检测J.动物医学进展，2012,33（8）：108-111.冯迎春，黄攀，颜其贵.四川部分猪场公猪精液带毒情况的PCR和RT-PCR检测J.养猪.2010,（5）：71-72.覃芳芸，黄夏，陈义祥等.广西部分种猪场公猪精液中猪瘟和PRRS带毒情况的调查J.畜牧与兽医，2007,39（12）:52-53.黄夏，陈义祥等.公猪精液CSFV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV的PCR检测J.广西农业科学,2008,39（2）.云南省种公猪精液中乙型脑炎病毒的监测-畜牧与兽医-2012,44(2).雷湘兰，马乃祥，沈振国.海南种公猪精液中的病毒调查研究J.养猪，2012，（4）：40.孙泉云，周锦萍，张维谊等.种公猪精液中与繁殖障碍有关的6种病毒的检测J.动物医学进展，2007,28（11）：30-33.周斌，吴增坚.种公猪精液中猪瘟和蓝耳病病毒混合感染的快速检测J.畜牧与兽医，2005,37（5）.参考文献：参考文献：王军一，金扩世，徐敬龙.山东种公猪精液携带主要病原的检测J12从国内外数据看出，多种病毒能从公猪精液中检出；从国内外数据看出，多种病毒能从公猪精液中检出；公猪精液中可能存在蓝耳、猪瘟、伪狂犬、圆环、细小等公猪精液中可能存在蓝耳、猪瘟、伪狂犬、圆环、细小等病毒；病毒；精液中可能存在多病原混合污染现象；精液中可能存在多病原混合污染现象；蓝耳病、猪瘟、伪狂犬、细小、圆环等已证明可通过精液蓝耳病、猪瘟、伪狂犬、细小、圆环等已证明可通过精液传播；传播；在考虑疫病防控和净化时，必须重视种公猪精液在考虑疫病防控和净化时，必须重视种公猪精液污染和疫病传播风险问题。污染和疫病传播风险问题。公猪公猪精液精液中能检出的病毒中能检出的病毒 小结小结从国内外数据看出，多种病毒能从公猪精液中检出；在考虑疫病防控病毒感染的病毒感染的危险性危险性 病毒的排毒可能出现在出现临床症状前病毒的排毒可能出现在出现临床症状前就开始。就开始。临床症状为温和型或无症状。临床症状为温和型或无症状。排毒在症状消失后还会持续很长时间。排毒在症状消失后还会持续很长时间。间歇排毒。间歇排毒。病毒感染的危险性 病毒的排毒可能出现在出现临床症状前就开始。15 病原污染公猪精液的方式病原污染公猪精液的方式（内源、外源）（内源、外源）精液精液精液采集、加工、精液采集、加工、贮存、运输贮存、运输公猪生殖、泌尿系统感染公猪生殖、泌尿系统感染（睾丸、附腺、包皮排毒）（睾丸、附腺、包皮排毒）血源性感染血源性感染污染的水、饲料、污染的水、饲料、空气、器具、人空气、器具、人粪便污染粪便污染包皮污染包皮污染内源性污染内源性污染外源性污染外源性污染 病原污染公猪精液的方式（内源、外源）精液精液采集、加工、16精液污染病原体的危害精液污染病原体的危害n影响精子活性影响精子活性-由于营养物质减少、由于营养物质减少、pHpH值降低、毒素产生值降低、毒素产生n生存能力、运动能力、繁殖能力下降，导致精子细胞生存能力、运动能力、繁殖能力下降，导致精子细胞 不成熟，精子凝集、死亡。如不成熟，精子凝集、死亡。如E.coliE.coli、PRRSVPRRSV（顶体异常，畸形增顶体异常，畸形增加，一次射精新鲜精液含加，一次射精新鲜精液含700TCID50/ml700TCID50/ml）n降低精子保存时间降低精子保存时间n导致母猪不育和繁殖障碍导致母猪不育和繁殖障碍-由于公猪精子浆膜上有对卵子由于公猪精子浆膜上有对卵子 透明带的接受器，可将病原传给卵子透明带的接受器，可将病原传给卵子n受胎率下降、胚胎早期死亡、母猪子宫内膜炎受胎率下降、胚胎早期死亡、母猪子宫内膜炎n怀孕早期发生子宫内感染，胚胎被吸收、返情；怀孕早期发生子宫内感染，胚胎被吸收、返情；怀孕中后期感染导致流产、产死胎怀孕中后期感染导致流产、产死胎/木乃伊胎木乃伊胎n仔猪隐性带毒仔猪隐性带毒n疫病扩散疫病扩散精液污染病原体的危害影响精子活性-由于营养物质减少、pH值n引种及疫病检测（引种及疫病检测（PCR/RT-PCRPCR/RT-PCR的灵敏度）的灵敏度）n科学的饲养管理和良好的舍饲条件科学的饲养管理和良好的舍饲条件n严格的严格的生物安全措施（疫苗接种的风险）生物安全措施（疫苗接种的风险）n病原监测（间歇排毒的风险）病原监测（间歇排毒的风险）、及时淘汰病猪、及时淘汰病猪n建立建立SPFSPF的人工授精中心的人工授精中心n精液采集、精液采集、加工处理加工处理、检测、储存、运输过程的控制、检测、储存、运输过程的控制n正确的人工授精操作。正确的人工授精操作。精液质量的控制精液质量的控制供体公猪供体公猪精液采集、精液采集、加工和贮存加工和贮存母猪母猪评估各环节疾病传播的风险评估各环节疾病传播的风险引种及疫病引种及疫病监测监测加入广谱抗菌加入广谱抗菌素素。？引种及疫病检测（PCR/RT-PCR的灵敏度）精液质量的控精液净化技术最新进展精液净化技术最新进展 靓精靓精靓精靓精 让您不再对精液污染束手无策。让您不再对精液污染束手无策。精液净化技术最新进展靓精 让您不再对精液污染束手无策。22精液净化技术进展精液净化技术进展 靓精靓精n能快速抑制和杀灭精液中多数细菌及其他微生物；能快速抑制和杀灭精液中多数细菌及其他微生物；n能彻底杀灭能彻底杀灭CSFVCSFV、PRRSVPRRSV（经典株及变异株）、（经典株及变异株）、PRVPRV、PPVPPV、PCV-2PCV-2；n对精子、受精卵、胚胎发育安全，且能显著减低精子畸形率，延长精对精子、受精卵、胚胎发育安全，且能显著减低精子畸形率，延长精液保存时间；液保存时间；n能显著减少因人工授精操作不当引起的母猪产道疾病，降低母猪返情能显著减少因人工授精操作不当引起的母猪产道疾病，降低母猪返情率、提高妊娠率，降低仔猪畸形率、提高健仔率和窝产子猪头数。率、提高妊娠率，降低仔猪畸形率、提高健仔率和窝产子猪头数。精液净化技术进展 靓精能快速抑制和杀灭精液中多数细菌及其靓精靓精 对精子活力的影响（对精子活力的影响（四川省种猪性能测定中心四川省种猪性能测定中心)靓精 对精子活力的影响（四川省种猪性能测定中心)24靓精靓精 对精子活力的影响（对精子活力的影响（四川省种猪性能测定中心四川省种猪性能测定中心)靓精 对精子活力的影响（四川省种猪性能测定中心)25靓精靓精 对精子活力的影响对精子活力的影响 添加终浓度为0.5%和1%靓精组的精子总体活力和前进式活力在同一时间均高于对照组，而快速前进活力在前五天各项指标均比对照组低，从第六天起，各项指标均高于对照组。添加终浓度为0.75%靓精的精液精子的三项活力指标在试验的同一时间均高于对照组及其他试验组；与对照组相比，添加终浓度为2%的靓精会降低精子总体活力、精子前进式活力及快速前进式活力，缩短精液保存时间。即终浓度低于1.0%为靓精安全使用浓度。由表由表1 1、表、表2 2、表、表3 3可以看出：可以看出：靓精 对精子活力的影响 添加终浓度为0.5%和1%靓26 精子稀释液中添加靓精对精子的影响精子稀释液中添加靓精对精子的影响 来源于中国农大试验报告来源于中国农大试验报告 精子稀释液中添加靓精对精子的影响27 精液稀释液中添加不同浓度靓精，6 h进行首次检测，之后间隔12 h检测一次。从表中可以发现在30 h时0.75%组的直线运动精子活率显著高于1%组，而与其他两组间无显著差异。42 h时0.75%组的精子活率显著高于对照组，而与0.5%及1%两组间没有显著差异；并且0.75%组的A+B级精子比例显著高于对照组和0.5%组；而0.75%组的直线运动精子活率显著高于其他三组。精液稀释液中添加靓精对精子的影响精液稀释液中添加靓精对精子的影响结论结论 精液稀释液中添加不同浓度靓精，6 h进行首次检测，之28 本实验中添加靓精至精液稀释液中，使用计算机辅助精液分析系统（CASA）检测精子指标，如精子活率、A级+B级精子比例、直线运动精子比例、平均曲线运动速度（Curvilinear velocity，VCL）、平均直线运动速度（Straight line velocity，VSL）、精子平均侧摆幅度（Amplitude of lateral head displacement，ALH）以及运动的直线性（Linearity，LIN）等10。通过实验结果发现，当精液保存一定时间时，靓精添加浓度为0.75%的实验组的精子活率和直线运动性比其他组效果都好。精液稀释液中添加靓精对精子的影响精液稀释液中添加靓精对精子的影响结论结论精液稀释液中添加靓精对精子的影响结论29上海畜牧兽医通讯2015年4月刊出上海畜牧兽医通讯2015年4月刊出30表一 M199中添加靓精对卵母细胞成熟率的影响 表二 M199中添加靓精对卵母细胞孤雌后发育能力的影响注：组间没有显著差异（P0.05）注：组间没有显著差异（P0.05）以上数据来源中国农大试验报告表一 M199中添加靓精对卵母细胞成熟率的影响 表二 M131 结果如表1和表2所示，添加靓精培养组卵母细胞成熟率与对照组间没有显著差异。同时对后期发育结果统计发现所有组间卵裂率和囊胚率都没有显著差异，然后对囊胚进行TUNEL染色统计囊胚总细胞数和凋亡细胞数，均未发现显著差异。以上数据来源中国农大试验报告M199M199中添加靓精对卵母细胞成熟的影响中添加靓精对卵母细胞成熟的影响 结果如表1和表2所示，添加靓精培养组卵母细胞成熟率与对照32PZM-3PZM-3中添加靓精对卵母细胞孤雌后期发育的影响中添加靓精对卵母细胞孤雌后期发育的影响卵母细胞电激活后，放入含有靓精和正常的化学辅助激活药物的培养液滴中，4 h后全部换至正常胚胎培养液中培养。结果显示对照组的卵裂率（61.22%）和囊胚率（35.54%）与添加靓精的实验组间均无显著差异，四组囊胚染色后总细胞数和凋亡细胞数间同样没有显著差异。注：组间没有显著差异（P0.05）。以上数据来源中国农大试验报告PZM-3中添加靓精对卵母细胞孤雌后期发育的影响卵母细胞电激33精液稀释液中添加靓精对精液稀释液中添加靓精对IVFIVF的影响的影响注：组间没有显著差异（P0.05）。精子经添加不同浓度靓精的精液稀释液稀释后放置一天，用于体外受精。结果如表所示，含不同浓度靓精的精液稀释液稀释的精液用于体外受精后，观察结果发现对照组卵裂率（61.08%）和囊胚率（21.62%）与其他三组间没有显著差异；进一步进行囊胚凋亡染色，发现囊胚细胞数和凋亡细胞数间也都没有显著差异。以上数据来源中国农大试验报告精液稀释液中添加靓精对IVF的影响注：组间没有显著差异（P34经过一系列实验证明：在卵母细胞成熟液、胚胎培养液和精子稀释液中添加靓精观察卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数及凋亡细胞数。结果显示添加靓精的实验组的所有指标与对照组间均无显著差异，这表明靓精不会危害卵母细胞的成熟及后期发育，并且精液稀释液中靓精浓度为0.75%时，精子的保存效果更好。靓精对卵母细胞及精子毒害作用研究靓精对卵母细胞及精子毒害作用研究总结总结以上数据来源中国农大试验报告经过一系列实验证明：在卵母细胞成熟液、胚胎培养液和精子稀释液35 靓精靓精 对细菌效果试验数据对细菌效果试验数据（四川华派生物制药有限公司（四川华派生物制药有限公司)靓精 对细菌效果试验数据（四川华派生物制药有限公司36靓精靓精 对细菌效果对细菌效果试验数据试验数据不同来源的精液中菌落总数差异较大。在精液采集后12h和144h，添加1.0%靓精的各试验组菌落总数均比同一时间对照组精液菌落总数低。因此，添加1.0%靓精能有效控制精液中的细菌总数。靓精 对细菌效果试验数据不同来源的精液中菌落总数差异较大。37靓精靓精 对细菌效果试验数据对细菌效果试验数据(四川华派生物制药有限公司四川华派生物制药有限公司)靓精 对细菌效果试验数据(四川华派生物制药有限公司)从表从表5 5中可以看出中可以看出:2%靓精对实验中所示全部病原菌在1分钟内能达到100%的杀灭率；1%靓精对实验中所示全部病原菌在10分钟内的杀灭率能到达到100%，作用5分钟能对所有病原菌达到98%以上的杀灭率；0.5%靓精在10分钟内对两株大肠杆菌的杀灭率能达到100%，而对另外四株病原菌的杀灭率在10分钟内不能完全杀灭。靓精靓精 对细菌效果试验数据对细菌效果试验数据从表5中可以看出:靓精 对细菌效果试验数据靓精靓精 对病毒试验数据对病毒试验数据由表由表6 6可以看出，靓精可以看出，靓精对五种病毒的完全杀灭浓度均远低于安全浓度对五种病毒的完全杀灭浓度均远低于安全浓度1.0%1.0%。(四川华派生物制药有限公司四川华派生物制药有限公司)靓精 对病毒试验数据由表6可以看出，靓精对五种病毒的公猪精液带毒与精液净化技术进展课件41靓精靓精 实验数据总结实验数据总结结合以上报告可以看出：结合以上报告可以看出：使用浓度靓精对公猪精子、受精卵、胚胎发育安全无害，并能延长精子有效存活时间，降低精子畸形率，提高精子质量；在实验条件下，靓精能有效减少精液中的细菌总数，在10分钟内能完全杀灭五种试验病菌，且在0.25%以下能完全杀灭精液中的五种猪病病毒。靓精 实验数据总结结合以上报告可以看出：42靓精靓精 主要成分：主要成分：特制高分子生物有机碘、组合增效剂及精子保护剂。特制高分子生物有机碘、组合增效剂及精子保护剂。靓精 主要成分：实验室精液处理：实验室精液处理：将靓精将靓精与精液与精液稀释液按照稀释液按照1:1000-20001:1000-2000的比例提的比例提前配制好，再用于稀释原精。注意前配制好，再用于稀释原精。注意计算最佳使用终浓度为计算最佳使用终浓度为0.3-0.75%0.3-0.75%之间。然后按照正常程序稀释、分之间。然后按照正常程序稀释、分装、保存精液。装、保存精液。靓精靓精 使用方法一：使用方法一：精液预防添加精液预防添加关于使用浓度：关于使用浓度：预防控制：推荐预防控制：推荐0.3-0.50.3-0.5左右；左右；污染净化或感染压力大时推荐污染净化或感染压力大时推荐0.50.50.750.75；最简单的用法最简单的用法：1010毫升靓精毫升靓精加入加入20002000毫升精液稀释液。毫升精液稀释液。实验室精液处理：将靓精与精液稀释液按照1:1000-2靓精靓精 使用方法二：使用方法二：公猪采精过程公猪采精过程n公猪：清洗公猪体表污物，尤其是下腹及侧腹，修剪公猪包皮被毛，挤出包皮积液，用0.5%靓精溶液(用纯净水稀释即可）喷洒清洗腹部及包皮、阴茎，摸干。n采精员：采精前充分洗涤双手，用0.5%靓精溶液擦拭后操作。n重复使用器械：对实验室重复使用器械如烧杯、玻璃棒等做清洗、消毒（0.5%靓精浸泡）、烘干。靓精使用方法二：公猪采精过程公猪：清洗公猪体表污物，尤其是靓精靓精 使用方法使用方法三：三：母猪输精过程母猪输精过程 n1、待配母猪：先用清水将母猪尾根及外阴周围皮肤的粪污擦洗干净，然后用0.5%靓精溶液擦洗一遍。n2、配种员：操作前双手用0.5%靓精溶液浸泡或擦拭消毒。靓精使用方法三：母猪输精过程 靓精靓精临床使用案例临床使用案例案例一：四川某大型养猪企业自2014年初开始使用靓精，由于精液3天内用完，对精液保存时间没感觉，观察发现健仔率明显提高，畸形率从3-4%左右降到1%以下，母猪产道疾病明显下降。案例二：河南某上市公司猪场，自2013年10月开始80头母猪试用，14年5月开始8000头试用，14年10月开始全群2万多头母猪正式使用，统计结果表明使用靓精能显著降低母猪子宫内膜炎等产道疾病，提高健仔率和窝产仔猪头数，显著提高猪场生产水平。案例三：浙江某公猪站2014年10月开始在部分商品精液中使用靓精，对精液进行分级销售。靓精临床使用案例案例一：四川某大型养猪企业自2014年初开47使用注意事项使用注意事项n1 1、须先配好精液稀释液，加入靓精、须先配好精液稀释液，加入靓精 ，然后用于稀释精液；，然后用于稀释精液；n2 2、计算靓精、计算靓精使用浓度在使用浓度在0.3%0.75%0.3%0.75%之间；之间；n3 3、让靓精、让靓精与精液作用与精液作用3030分钟以上再用于人工授精；分钟以上再用于人工授精；n4 4、精液保存时间和选用精液稀释保存粉质量有直接关系；、精液保存时间和选用精液稀释保存粉质量有直接关系；n5 5、其他要求按照相应的操作规范执行。、其他要求按照相应的操作规范执行。使用注意事项1、须先配好精液稀释液，加入靓精，然后靓精靓精的价值的价值 1 1、促进引种及精液交换；、促进引种及精液交换；2 2、AIAI的生物安全措施落实到细节；的生物安全措施落实到细节；3 3、控制采精、输精过程污染；、控制采精、输精过程污染；4 4、改善子宫环境，提高母猪生产成绩；、改善子宫环境，提高母猪生产成绩；5 5、促进商品精液推广，预防疾病散播；、促进商品精液推广，预防疾病散播；靓精的价值 1、促进引种及精液交换；靓精靓精研发团队及合作单位研发团队及合作单位-鸣谢鸣谢n成都美强兽医技术服务有限公司成都美强兽医技术服务有限公司n四川大学（华西医科大学）n德国亚琛应用科技大学n四川华派生物制药有限公司n四川省种猪性能测定中心n中国农业大学动物科技学院n上海农科院畜牧兽医研究所n上海市动物疫病预防控制中心。靓精研发团队及合作单位-鸣谢成都美强兽医技术服务有限公司靓精靓精 母猪的安全套！母猪的安全套！小产品，大智慧小产品，大智慧 小产品，大智慧公猪精液带毒与精液净化技术进展课件