琼脂糖凝胶天然琼脂agar课件

DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳分子生物学基本技术分子生物学基本技术三峡大学医学院生物化学教研室三峡大学医学院生物化学教研室DNA的琼脂糖凝胶电泳分子生物学基本技术三峡大学医学院生物化凝胶电泳凝胶电泳凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳：由由由由琼琼琼琼脂脂脂脂、琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖、淀淀淀淀粉粉粉粉胶胶胶胶及及及及聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰胺等物质作支持体的电泳。酰胺等物质作支持体的电泳。酰胺等物质作支持体的电泳。酰胺等物质作支持体的电泳。特点：特点：特点：特点：1.1.1.1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。的孔中泳动。的孔中泳动。的孔中泳动。2.2.2.2.操作方法简便，电泳速度快。操作方法简便，电泳速度快。操作方法简便，电泳速度快。操作方法简便，电泳速度快。3.3.3.3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。4.4.4.4.适用于生化、免疫等定性定量测定。适用于生化、免疫等定性定量测定。适用于生化、免疫等定性定量测定。适用于生化、免疫等定性定量测定。凝胶电泳凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定分离鉴定和和纯化纯化DNA片段片段的标的标准方法。准方法。该技术操作该技术操作简便快速简便快速，可以分辨用其它方法（如，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。片段。当用低浓度的荧光嵌入染料当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色染色,在紫外光下至少可以检出在紫外光下至少可以检出1-10ng的的DNA条带条带,从而可以确定从而可以确定DNA片段在凝胶中片段在凝胶中的位置。的位置。此外此外,还可以从电泳后的凝胶中还可以从电泳后的凝胶中回收特定的回收特定的DNA条条带带,用于以后的克隆操作。用于以后的克隆操作。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（天然琼脂（agaragar）:又名琼胶、菜燕、冻粉又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。线状高聚物。琼脂糖（琼脂糖（agaroseagarose）琼脂胶（琼脂胶（agaropectinagaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸含硫酸根和羧基的强酸性多糖，性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。在电场作用下能产生较强的电渗现象。琼脂琼脂琼脂糖凝胶天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 琼脂糖琼脂糖琼脂糖是由琼脂中提取出来的，琼脂糖是由琼脂中提取出来的，D-半乳糖半乳糖和和3、6-脱水脱水-L-半乳糖半乳糖结合的结合的链状多糖链状多糖。中性物质，中性物质，不带电荷不带电荷D-D-半乳糖半乳糖3 3，6-6-脱水脱水-L-L-半乳糖半乳糖琼脂糖D-半乳糖3，6-脱水-L-半乳糖 琼脂糖链依琼脂糖链依琼脂糖链依琼脂糖链依分子内和分子间氢键分子内和分子间氢键分子内和分子间氢键分子内和分子间氢键及其它力的作用及其它力的作用及其它力的作用及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型大网孔型大网孔型大网孔型凝胶。凝胶。凝胶。凝胶。琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘琼脂糖凝胶的优点琼脂糖凝胶的优点(1)操作简单操作简单，电泳速度快，样品不需事先处，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶结构均匀结构均匀，对样品吸附极微，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖琼脂糖透明无紫外吸收透明无紫外吸收，电泳过程和结果，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。可直接用紫外监测及定量分析。(4)电泳后区带电泳后区带易染色易染色，样品易洗脱，便于定，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。量测定。制成干膜可长期保存。琼脂糖凝胶的优点(1)操作简单，电泳速度快，样品不需事先处缺点：缺点：1.1.机械强度差机械强度差，易破碎，浓度不能太低。，易破碎，浓度不能太低。2.2.易被细菌污染易被细菌污染，不易保存，临用前配制。，不易保存，临用前配制。3.3.琼琼脂脂糖糖支支持持层层上上的的区区带带易易于于扩扩散散，电电泳泳后后必须立即固定染色。必须立即固定染色。4.4.与与PAGEPAGE相比，相比，分子筛作用小分子筛作用小，区带少。，区带少。缺点：影响琼脂糖凝胶电泳的因素影响琼脂糖凝胶电泳的因素DNA分子的大小分子的大小：实验证明，：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量片段迁移距离与其分子量的对数成的对数成反比反比；琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度：一定大小的：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；胶中，电泳迁移率不相同；DNA分子的构型分子的构型：不同构型的：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。度差别较大。影响琼脂糖凝胶电泳的因素DNA分子的大小：实验证明，DNA片琼脂糖凝胶浓度与可分辨的琼脂糖凝胶浓度与可分辨的DNA大小范围的关系大小范围的关系 琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度/(%)可分辨的线性可分辨的线性DNA大小范围大小范围/(kb)0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1琼脂糖凝胶浓度与可分辨的DNA大小范围的关系 琼脂糖凝胶浓度核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系在分子量相当的情况下，在分子量相当的情况下，不同构型不同构型的的DNA的移动速度次序如下：的移动速度次序如下：共价闭环共价闭环DNA(covalently closed circular，简称，简称cccDNA)直线直线DNA开环的双链环状开环的双链环状DNA。核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系在分子量相当的情况下，不同Relaxed circleLinearized formSuper-coiled form质粒质粒Relaxed circleLinearized formS离子强度影响离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNADNA的电的电泳迁移率。泳迁移率。在在没有离子存在没有离子存在时时(如误用蒸馏水配制凝胶如误用蒸馏水配制凝胶),),电导率最小电导率最小,DNA,DNA几乎不移动；几乎不移动；在在高离子强度高离子强度的缓冲液中的缓冲液中(如误加如误加1010电泳缓电泳缓冲液冲液),),则电导很高并明显产热则电导很高并明显产热,严重时会引起严重时会引起凝胶熔化或凝胶熔化或DNADNA变性。变性。离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳缓冲液 常用三种缓冲液常用三种缓冲液 Tris-Tris-硼酸（硼酸（TBETBE）Tris-Tris-乙酸（乙酸（TAETAE）Tris-Tris-磷酸（磷酸（TPETPE）TrisTris（三羟甲基氨基甲烷）：是一种（三羟甲基氨基甲烷）：是一种生物碱生物碱，常用，常用于生物实验中配制各种于生物实验中配制各种pHpH值的缓冲液。值的缓冲液。1M1M的的TrisTris溶溶液的液的pHpH值大约是值大约是10101111。EDTA EDTA 可螯合二价阳离子可螯合二价阳离子，抑制，抑制DNADNA酶的活性，防止酶的活性，防止DNADNA降解。降解。TBETBE与与TPETPE：缓冲容量高，缓冲容量高，DNADNA分离效果好，但分离效果好，但TPETPE在在DNADNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNADNA沉淀，沉淀，TAETAE：缓冲容量低，但价格较便宜。缓冲容量低，但价格较便宜。电泳缓冲液 常用三种缓冲液 EDTA乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid），），是一种有机化合物。它是一个是一种有机化合物。它是一个六齿配体六齿配体，可以，可以螯合多螯合多种金属离子种金属离子。抑制抑制DNADNA酶的活性，防止酶的活性，防止DNADNA降解。降解。由于由于EDTA在水及酸中的溶解度很小，常用的为其二在水及酸中的溶解度很小，常用的为其二钠盐，也简写为钠盐，也简写为EDTA。EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetr上样缓冲液 0.25溴酚兰；溴酚兰；0.25二甲苯青；二甲苯青；30甘油甘油水溶液水溶液作用：作用：增加样品密度增加样品密度，使其比重增加，以确，使其比重增加，以确保保DNA均匀沉入加样孔内均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指在电泳中形成肉眼可见的指示带，可示带，可预测核酸电泳的速度和位置预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色使样品呈色，使加样操作更方便，使加样操作更方便上样缓冲液 0.25溴酚兰；0.25二甲苯青；30甘油胶浓度胶浓度（%）溴酚蓝溴酚蓝二甲苯青二甲苯青0.60.61kb1kb1 10.6kb0.6kb2kb2kb1.41.40.2kb0.2kb1.6kb1.6kb2 20.15kb0.15kb 核酸电泳常用的指示剂：核酸电泳常用的指示剂：溴酚蓝溴酚蓝（bromophenol blue,Bb bromophenol blue,Bb）；）；二二甲甲苯苯青青（xylene xylene cyanol,cyanol,Xc Xc），它它携携带带的的电电荷荷量量比比溴溴酚酚蓝蓝少少，在在凝凝胶胶中中的的迁迁移移率率比比溴酚蓝慢。溴酚蓝慢。胶浓度（%）溴酚蓝二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在基对之间，在紫外线紫外线激发下，发出激发下，发出桔红色荧光桔红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色染色1015minEB染料有许多优点，如染料有许多优点，如染色操作简便、快速，染色操作简便、快速，灵敏度高，灵敏度高，10ng或更少的或更少的DNA即可检出即可检出。注意：注意：EBEB被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小，操作时应尽量小心，配置和使用心，配置和使用EBEB时都应带上手套，且注意不要把时都应带上手套，且注意不要把EBEB洒到桌面或地板上。洒到桌面或地板上。核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂溴化乙锭（ethidium bromide，EB）注意：EB 由由于于插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶 电电 泳泳 中中 DNA的的条条带带便便呈呈现现出出橘橘黄黄色色荧荧光光，易于鉴定。易于鉴定。溴化乙锭染料的化学结构及其对溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用分子的插入作用 由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中D聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交和交联剂联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide，Bis)在在加速剂和催化剂加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶的凝胶。聚丙烯酰胺的优点：聚丙烯酰胺的优点：(1)凝胶透明，有弹性，凝胶透明，有弹性，机械性能好机械性能好。(2)化学性能稳定化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。，与被分离物不起化学反应。(3)对对pH和温度变化较稳定和温度变化较稳定。(4)几乎几乎无电渗无电渗作用，样品分离重复性好。作用，样品分离重复性好。(5)样品不易扩散样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达，且用量少，其灵敏度可达10-6g。(6)凝胶凝胶孔径可调节孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。凝胶的孔径。(7)分辨率高分辨率高。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS是阴离子去污剂，化学名称是阴离子去污剂，化学名称十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate)由于由于SDS带有大量带有大量负电荷负电荷，当其与蛋白质结合时，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异荷的差异，使其均带有相同密度的负电荷使其均带有相同密度的负电荷，因而，因而可利用可利用分子量差异分子量差异将各种蛋白质分开将各种蛋白质分开。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS是阴琼脂糖凝胶天然琼脂agar课件夹在两块玻璃板夹在两块玻璃板之间的凝胶之间的凝胶 电泳电泳缓冲液缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品电源电源夹在两块玻璃板之间的凝胶 电泳缓冲液 电泳缓冲液 加在槽 垂直板垂直板电泳装置电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向 垂直板电泳装置加样样品迁移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。子滞后。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。混合样染色方法染色方法 蛋白质染色蛋白质染色 氨基黑氨基黑10B：氨基黑氨基黑10B是酸性染料。其磺酸基与蛋白是酸性染料。其磺酸基与蛋白质反应形成复合盐，是最常见的蛋白质染质反应形成复合盐，是最常见的蛋白质染料之一。料之一。考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250 银染色法银染色法 染色方法 蛋白质染色 电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽链分子量链分子量。相对迁移率相对迁移率标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数实验目的实验目的掌掌握握琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳检检测测DNA的的原原理和方法。理和方法。实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。实验原理实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应电荷效应和分子筛效应，但，但主要为主要为分子筛效应分子筛效应。在在 pH 值为值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带部解离，核酸分子带负电负电，在电泳时，在电泳时向正极移动向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛分子筛的作的作用下，使用下，使分子大小和构象不同的核酸分子分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入核酸分子中嵌入荧光染料（如荧光染料（如 EB）后，在紫外灯下可观察后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。到核酸片段所在的位置。实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但实验器材和试剂实验器材和试剂实验器材实验器材：制胶制胶模具，水平式电泳槽，电泳仪，微量移液模具，水平式电泳槽，电泳仪，微量移液器器,微波炉微波炉,紫外透射仪或凝胶成像系统。紫外透射仪或凝胶成像系统。样品样品：DNA分子量标准品，分子量标准品，DNA样品样品试剂试剂 琼脂糖琼脂糖1电泳缓冲液（电泳缓冲液（TBE）6上样缓冲液上样缓冲液溴化乙锭溴化乙锭(EB)：10mg/ml 实验器材和试剂实验器材：电泳仪电泳仪电泳槽与制胶模具电泳槽与制胶模具微波炉微波炉电泳仪电泳槽与制胶模具微波炉凝胶成像分析系统凝胶成像分析系统紫外透射仪紫外透射仪凝胶成像分析系统紫外透射仪实验操作实验操作实验操作操作步骤1.准备准备用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子面上，并架好梳子操作步骤1.准备2.配制配制1%琼脂糖凝胶及倒胶琼脂糖凝胶及倒胶具体步骤：具体步骤：三角瓶内：三角瓶内：1g琼脂糖琼脂糖+100ml(1TBE)煮胶溶解煮胶溶解 冷却至冷却至60(不烫手不烫手)加加EB 倒板倒板 室温下充分凝固室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入向电泳槽中加入1xTBE缓缓冲液至刚没过凝胶表面。冲液至刚没过凝胶表面。2.配制1%琼脂糖凝胶及倒胶具体步骤：琼脂糖凝胶天然琼脂agar课件水平式电泳装置水平式电泳装置水平式电泳装置3.加样加样将将DNA样品（样品（5ul）与）与6 上样缓冲液（上样缓冲液（1ul）混匀混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。后，用微量加样枪小心加入样品孔内。注意加样枪的枪头注意加样枪的枪头不可插入过深不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。样品外溢。每加完一个样品要每加完一个样品要更换枪头更换枪头，以，以防止防止EB污染污染。3.加样将DNA样品（5ul）与6 上样缓冲液（1ul）琼脂糖凝胶天然琼脂agar课件4.电泳电泳接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品样品由负极往正极泳动由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为（靠近加样孔的一端为负），电压为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离（长度以两个电极之间的距离计算）计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳4.电泳接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样Agarose Gel Electrophoresis+Agarose Gel Electrophoresis+5.结果观察结果观察电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。察电泳带及其位置，记录实验结果。5.结果观察电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带注意事项注意事项1、倒胶时把握好胶的温度，不要高于倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太高会使制板变形；否则温度太高会使制板变形；2、胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔；竖直向上，不要弄坏点样孔；3、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶；不要刺穿凝胶；4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔；胶勿乱扔；5、紫外线照射不要太久。、紫外线照射不要太久。注意事项1、倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温结果与讨论结果与讨论绘制实验装置图及实验结果示意图绘制实验装置图及实验结果示意图结果与讨论绘制实验装置图及实验结果示意图下周：实验考试下周：实验考试口试口试+操作考试操作考试口试：二人一组，一位同学回答，另一口试：二人一组，一位同学回答，另一位同学补充，答完一题后交换。位同学补充，答完一题后交换。操作考试：移液管、加样枪或操作考试：移液管、加样枪或721的使用，的使用，由老师随机指定其中一项进行操作。由老师随机指定其中一项进行操作。下周：实验考试口试+操作考试