第九章环境监测中的微生物学方法课件

第一章 环境监测中的微生物学方法当环境受到污染后，环境的当环境受到污染后，环境的物理性质物理性质化学性质化学性质生物学特性生物学特性如：如：n n重金属离子、重金属离子、NO3-浓度增加；浓度增加；n n水体污染变质，水生生物种类减少，甚水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝；至灭绝；发生变化发生变化如何监测？vv化学方法：快速、定性定量反映污染物化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但为瞬时值；浓度，但为瞬时值；vv生物学方法：利用生物种类、数量的变生物学方法：利用生物种类、数量的变化，生物学特性的改变来监测污染物对化，生物学特性的改变来监测污染物对环境的影响。环境的影响。可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。污染物的性质、浓度和数量。污染物的性质、浓度和数量。污染物的性质、浓度和数量。一、空气微生物来源一、空气微生物来源n n空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。n n土壤中飞扬起来的灰尘；土壤中飞扬起来的灰尘；n n水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传播。播。第一节空气的卫生学检验n n微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空气中，形成气中，形成“气溶胶气溶胶”，借风力传播。，借风力传播。n n空气中的微生物中，真菌的孢子数量最空气中的微生物中，真菌的孢子数量最多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病毒都会存在于空气中毒都会存在于空气中。二、空气微生物的卫生标准二、空气微生物的卫生标准n n目前，还无统一的关于空气的卫生学指目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，一般以室内标，一般以室内1m3空气中细菌总数为空气中细菌总数为501,000个以上作为空气污染的指标。个以上作为空气污染的指标。n n病原菌在空气中一般很易死亡，但结核病原菌在空气中一般很易死亡，但结核菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓炎双球菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎病毒等，也可以在空气中存活一灰质炎病毒等，也可以在空气中存活一段时间。段时间。n n尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医院、城市街道的空气中，微生物数量较院、城市街道的空气中，微生物数量较多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和高纬度地带的空气中，微生物较少。高纬度地带的空气中，微生物较少。场所场所场所场所畜舍畜舍畜舍畜舍宿舍宿舍宿舍宿舍城市城市城市城市街道街道街道街道市区市区市区市区公园公园公园公园海洋海洋海洋海洋上空上空上空上空北纬北纬北纬北纬8080 微生物微生物微生物微生物(12)(12)1 10 06 6 2102104 4 555510103 320020012120 0表表2-1不同场所上空微生物的数量（个不同场所上空微生物的数量（个/m3）表表2-2以细菌总数评价空气的卫生标准（个以细菌总数评价空气的卫生标准（个/m3）清洁程度清洁程度清洁程度清洁程度细菌总数细菌总数细菌总数细菌总数最清洁的空气（有空调）最清洁的空气（有空调）最清洁的空气（有空调）最清洁的空气（有空调）1212清洁空气清洁空气清洁空气清洁空气3030普通空气普通空气普通空气普通空气3112531125临界环境临界环境临界环境临界环境150150轻度污染轻度污染轻度污染轻度污染300301301三、空气的微生物监测n n通常采用营养琼脂平板计数法。n n我国检测空气微生物所用的培养皿直径为d90mm，有用d100mm的。n n评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生物数量和空气污染微生物。测定的细菌指标有细菌总数和绿色链球菌，在必要时则测病原微生物。(一)空气微生物的测定方法1固体法固体法n n固固体体法法有有平平皿皿落落菌菌法法(沉沉降降平平板板法法)、撞撞击击法法(有有缝缝隙隙采采样样器器、筛筛板板采采样样器器、针针孔孔采采样样器器)和过滤法。和过滤法。(1)平平皿皿落落菌菌法法：将将营营养养琼琼脂脂培培养养基基融融化化倒倒人人d90mm无无菌菌平平皿皿中中制制成成平平板板。将将它它放放在在待待测测点点(通通常常设设5个个测测点点)，打打开开皿皿盖盖暴暴露露于于空空气气510min，以以待待空空气气微微生生物物降降落落在在平平板板表表面面上上，盖盖好好皿皿盖盖，置置于于培培养养箱箱中中培培养养48h后后取出计菌落数，即为落菌数。取出计菌落数，即为落菌数。n n可通过前苏联奥梅梁斯基公式换算出浮游可通过前苏联奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。细菌数。n n奥氏认为：奥氏认为：5min内落在面积内落在面积100mm2营养营养琼脂平板上的细菌数和琼脂平板上的细菌数和10L空气中所含的空气中所含的细菌数相同。细菌数相同。n n奥氏公式：奥氏公式：式中：式中：C空气细菌数；空气细菌数；A捕集面积，捕集面积，cm2；t暴露时间，暴露时间，min；N菌落数，个。菌落数，个。5t100A100010NC=n n简化后的奥氏公式：简化后的奥氏公式：n n经测定发现，用奥式公式计算的浮游细经测定发现，用奥式公式计算的浮游细菌数比实测的浮游细菌少。菌数比实测的浮游细菌少。n n此公式没有考虑尘埃粒子大小、数量、此公式没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流情况、人员密度和活动情况。气流情况、人员密度和活动情况。C=100050NAt(2)撞击法：撞击法：n n以缝隙采样器为例，用吸风机或真空泵将以缝隙采样器为例，用吸风机或真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝含菌空气以一定流速穿过狭缝(狭缝宽有狭缝宽有0.15mm、0.33mm和和1mm三种三种)而被抽而被抽吸到营养琼脂培养基平板上。狭缝长度为吸到营养琼脂培养基平板上。狭缝长度为平皿的半径，平板与缝的间隙有平皿的半径，平板与缝的间隙有2mm，平，平板以一定的转速板以一定的转速(1rmin、5-60rmin、60rmin)旋转。旋转。通常平板转动一周，取出置于通常平板转动一周，取出置于37恒温箱中恒温箱中培养培养48h，根据空气中微生物的密度可调节平，根据空气中微生物的密度可调节平板转动的速度。采集含菌高的空气样品时，板转动的速度。采集含菌高的空气样品时，平板转动的速度要比含菌量低的空气样品的平板转动的速度要比含菌量低的空气样品的转速快。根据取样时间和空气流量算出单位转速快。根据取样时间和空气流量算出单位空气中的含菌量。采样器的规格各国不一，空气中的含菌量。采样器的规格各国不一，可按说明书操作。可按说明书操作。撞击法检测空气中微生物数量撞击法检测空气中微生物数量培养前培养后2液体法n n液液体体法法用用于于测测定定空空气气中中的的浮浮游游微微生生物物，主主要要是是浮浮游游细细菌菌。该该法法将将一一定定体体积积的的含含菌菌空空气气通通入入无无菌菌蒸蒸馏馏水水或或无无菌菌液液体体培培养养基基中中，依依靠靠气气流流的的洗洗涤涤和和冲冲击击使使微微生生物物均均匀匀分分布布在在介介质质中中，然然后后取取一一定定量量的的菌菌液液涂涂布布于于营营养养琼琼脂脂平平板板上上，或或取取一一定定量量的的菌菌液液于于无无菌菌培培养养皿皿中中，倒倒入入15-18ml融融化化(45)的的营营养养琼琼脂脂培培养养基基，混混匀匀，待待冷冷凝凝制制成成平平板板，置置于于37恒恒温温箱箱中中培培养养48h，取取出出计计菌菌落落数。数。n n再再以以菌菌液液体体积积和和通通入入的的空空气气量量计计算算出出单单位体积空气中的细菌数。位体积空气中的细菌数。n n例例如如：将将10m3含含菌菌空空气气通通入入100mL的的无无菌菌水水中中，使使10m3空空气气中中的的微微生生物物全全部部截截留留在在100mL水水中中。然然后后取取0.1mL菌菌液液涂涂布布于于平平板板上上，若若长长出出100个个菌菌落落，10mL水水中中共共含含菌菌10,000个个，则则10m3空空气气含含有有10,000个。个。1m3空气含有空气含有1,000个个。(二)空气微生物的检测点数n n空气微生物的测点数越多越准确，为照空气微生物的测点数越多越准确，为照顾到工作方便，又相对准确，以顾到工作方便，又相对准确，以2030个个测点数为宜，最少测点数为测点数为宜，最少测点数为56，见表。，见表。时时间间标准标准名称名称最最少少测测点点数数建议建议测点测点数数点距（m）每点每点测定测定次数次数1987JISB9920洁净室中洁净室中浮游粒子浮游粒子测定方法测定方法和洁净室和洁净室的评价方的评价方法法620，30原则原则上上3空间空间太大太大可放可放宽宽31987空气清空气清净协净协会标准会标准洁净室性洁净室性能评价指能评价指南南520,30原则原则上上3表表2.1日本有关标准测点数的规定日本有关标准测点数的规定摘自许钟麟空气洁净技术原理P522同济大学出版社，1998表表表表2.2 2.2 2.2 2.2 按美国联邦标准按美国联邦标准按美国联邦标准按美国联邦标准209E209E209E209E方法计算的必要测点数方法计算的必要测点数方法计算的必要测点数方法计算的必要测点数 洁洁净净度度进风面积进风面积(单向流单向流)或室面积或室面积(乱流乱流)m2100级及级及高于高于100级级1000级级10000级级100000级级10102040801002004002348163240801602361325326312622248102040222223613表2.3浮游菌最小采样量浮游菌上限浓度浮游菌上限浓度个个m-2min-1计算最小采样量计算最小采样量m310510.50.10.050.30.6363060表表表表2.42.4落菌法测细菌所需要的最少培养皿数落菌法测细菌所需要的最少培养皿数落菌法测细菌所需要的最少培养皿数落菌法测细菌所需要的最少培养皿数(沉降沉降沉降沉降0.5h)0.5h)含尘浓度最大值含尘浓度最大值需要需要d90mm培养皿数培养皿数0.353.5353503500350004013421第二节 水质的细菌学检验一、细菌总数一、细菌总数是将定量水样（原水样或经一定稀释是将定量水样（原水样或经一定稀释后的水样后的水样1mL）接种于牛肉膏蛋白胨琼）接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，于脂培养基平板上，于37C培养培养24hr后观后观察结果，计算细菌菌落数，最后算出原察结果，计算细菌菌落数，最后算出原水样每毫升的细菌总数。水样每毫升的细菌总数。具有相对的卫生学意义，菌数越高，具有相对的卫生学意义，菌数越高，反映出水体受有机物污染或粪便污染越反映出水体受有机物污染或粪便污染越重，病原菌污染的可能性亦大。重，病原菌污染的可能性亦大。二、粪便污染指示菌n n人畜粪便中常常带有大量的微生物，其中有些属人畜粪便中常常带有大量的微生物，其中有些属人畜粪便中常常带有大量的微生物，其中有些属人畜粪便中常常带有大量的微生物，其中有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些则是于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些则是于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些则是于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染，病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染，病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染，病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染，从而引发各种肠道疾病。因此，水质的卫生学检从而引发各种肠道疾病。因此，水质的卫生学检从而引发各种肠道疾病。因此，水质的卫生学检从而引发各种肠道疾病。因此，水质的卫生学检验，对于保护人群健康，具有重要意义。验，对于保护人群健康，具有重要意义。验，对于保护人群健康，具有重要意义。验，对于保护人群健康，具有重要意义。n n致病菌数量少，检测比较复杂，故选用间接指标致病菌数量少，检测比较复杂，故选用间接指标致病菌数量少，检测比较复杂，故选用间接指标致病菌数量少，检测比较复杂，故选用间接指标即粪便污染的指示菌为代表。即粪便污染的指示菌为代表。即粪便污染的指示菌为代表。即粪便污染的指示菌为代表。n n常用肠道正常细菌在水中的存在及数量情况作为常用肠道正常细菌在水中的存在及数量情况作为常用肠道正常细菌在水中的存在及数量情况作为常用肠道正常细菌在水中的存在及数量情况作为粪便污染的指示。粪便污染的指示。粪便污染的指示。粪便污染的指示。健康成人粪便内的微生物数量健康成人粪便内的微生物数量微生物名称微生物名称每克粪便中平均生长菌落数每克粪便中平均生长菌落数主要微生物拟杆菌属1010乳酸杆菌属109大肠埃希氏菌属108粪链球菌108次要的微生物柠檬酸杆菌属105-106梭菌属105-106葡萄球菌属105-106克雷伯氏菌属104-105肠杆菌属104-105芽孢杆菌属酵母属104-105霉菌104-105较少的微生物变形菌属102-103铜绿假单胞菌属102-103（一）指示菌的理想条件1.1.大量存在于人的粪便中，且数量比病原大量存在于人的粪便中，且数量比病原菌多；菌多；2.2.受粪便污染的水中易检测出该指示菌，受粪便污染的水中易检测出该指示菌，未受污染的水中无此菌；未受污染的水中无此菌；3.3.在水体中不会自行繁殖；在水体中不会自行繁殖；4.4.存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗略强于致病菌；抗略强于致病菌；5.5.检出及鉴定方法比较简易迅速；检出及鉴定方法比较简易迅速；6.6.适用于各种水体。适用于各种水体。（二）适宜的指示菌n n总大肠菌群，粪大肠菌群、大肠杆总大肠菌群，粪大肠菌群、大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌）、克雷伯菌埃希氏菌（大肠杆菌）、克雷伯氏菌属。氏菌属。三、大肠杆菌（一）特征（一）特征n n定义：一群需氧或兼性厌氧性的定义：一群需氧或兼性厌氧性的G-无芽孢杆无芽孢杆菌，能在菌，能在37C培养培养24hr使乳糖发酵产酸产气，使乳糖发酵产酸产气，包括了粪便内全部兼性需氧性的包括了粪便内全部兼性需氧性的G-杆菌，以杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为主，尚有柠檬酸杆菌大肠杆菌埃希氏菌属为主，尚有柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。n n成人每日粪便中排出的菌数可达成人每日粪便中排出的菌数可达(5100)106个。个。（二）大肠菌群的测定（二）大肠菌群的测定常用多管发酵法与滤膜法：常用多管发酵法与滤膜法：1.1.发酵法：发酵法：2.2.又称多管发酵法或三步发酵法又称多管发酵法或三步发酵法1)1)初发酵（推测试验）：将不同稀释度的初发酵（推测试验）：将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中（养液中（3倍或倍或1倍乳糖液），经倍乳糖液），经37C培培养养24hr，观察产酸产气情况，以初步判，观察产酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。断是否有大肠菌群存在。2）平皿分离（证实试验）n n水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。引起糖类发酵，因此需要进一步证实。n n将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基或远藤氏培养基上，美兰培养基或远藤氏培养基上，37C培培养养24hr，根据菌落特征，挑取可能为大，根据菌落特征，挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。一步证实是否为大肠菌群。3）复发酵试验（完成试验）n n将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入入1倍乳糖培养液中，经倍乳糖培养液中，经37C培养培养24hr，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。n n产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应；产气则记为阴性反应；n n根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。群的数量。2 滤膜法n n发酵法全部检测需要的时间较长，为缩发酵法全部检测需要的时间较长，为缩短时间，可以采用滤膜法，其步骤为：短时间，可以采用滤膜法，其步骤为：1）水样过滤：选用具有微孔的滤膜，灭菌）水样过滤：选用具有微孔的滤膜，灭菌后通过抽滤一定量的待测水样，将水中后通过抽滤一定量的待测水样，将水中的细菌截留在无菌滤膜上；的细菌截留在无菌滤膜上；2）培养：将滤膜有菌面朝上贴于特定的固）培养：将滤膜有菌面朝上贴于特定的固体培养基平板上（伊红美兰培养基或远体培养基平板上（伊红美兰培养基或远藤氏培养基），经藤氏培养基），经37C培养培养16hr18hr；3）结果观察：）结果观察：培养培养16hr18hr后，挑选深后，挑选深红色或紫红色、不带或带有金属光泽的菌红色或紫红色、不带或带有金属光泽的菌落，或者淡红色、中心色较深的菌落进行落，或者淡红色、中心色较深的菌落进行革兰氏染色观察，确定大肠菌群细菌。革兰氏染色观察，确定大肠菌群细菌。G-：接入乳糖培养液中，复发酵；：接入乳糖培养液中，复发酵；G+：阴性结果。：阴性结果。经染色证实为经染色证实为G-无芽孢杆菌者，再接入乳无芽孢杆菌者，再接入乳糖蛋白胨半固体培养基中，糖蛋白胨半固体培养基中，37C培养培养68hr，产气者判定为大肠菌群阳性。，产气者判定为大肠菌群阳性。4）结果计算：）结果计算：根据滤膜上证实的大肠菌根据滤膜上证实的大肠菌群数及滤过水量，求出群数及滤过水量，求出1L水中的大肠菌水中的大肠菌群数量。群数量。n n计算公式：计算公式：总大肠菌群数总大肠菌群数=滤膜上的菌落数以滤膜上的菌落数以2060个个/片为适宜。片为适宜。5）评价报告：）评价报告：n n根据测定的数值写出检测水样的细菌学根据测定的数值写出检测水样的细菌学检测结果，予以评价。检测结果，予以评价。滤膜上生长菌落数滤膜上生长菌落数1000过滤水样量（过滤水样量（mL）v滤膜法的优点：省时、省料、设备要求低；省时、省料、设备要求低；可以采集较多的检验水样。可以采集较多的检验水样。局限性：局限性：vv易受悬浮物干扰；易受悬浮物干扰；vv受其它细菌的干扰；受其它细菌的干扰；vv受水样中毒物的干扰。受水样中毒物的干扰。nn劳动创造财富，安全带来幸福。劳动创造财富，安全带来幸福。7 7月月-24-247 7月月-24-24Saturday,July13,2024Saturday,July13,2024nn上岗安全忘一旁，好比身后藏只狼。上岗安全忘一旁，好比身后藏只狼。17:14:0717:14:0717:14:0717:14:0717:1417:147/13/20245:14:07PM7/13/20245:14:07PMnn努力推行努力推行QCCQCC，工作不会苦兮兮。，工作不会苦兮兮。7 7月月-24-2417:14:0717:14:0717:1417:14Jul-24Jul-2413-Jul-2413-Jul-24nn只有勇于承担责任，才能承担更大的责任。只有勇于承担责任，才能承担更大的责任。17:14:0717:14:0717:14:0717:14:0717:1417:14Saturday,July13,2024Saturday,July13,2024nn劣品标识加隔离，退料重要处理易。劣品标识加隔离，退料重要处理易。7 7月月-24-247 7月月-24-2417:14:0717:14:0717:14:0717:14:07July13,2024July13,2024nn宁绕百丈远，不冒一步险。宁绕百丈远，不冒一步险。20242024年年7 7月月1313日日5:145:14下午下午7 7月月-24-247 7月月-24-24nn安全保健康，千金及不上。安全保健康，千金及不上。1313七月七月202420245:14:075:14:07下午下午17:14:0717:14:077 7月月-24-24nn服务客户，播种金钱，增加信任，稳定续收。服务客户，播种金钱，增加信任，稳定续收。七月七月24245:145:14下午下午7 7月月-24-2417:1417:14July13,2024July13,2024nn不怕千日紧，只怕一时松。不怕千日紧，只怕一时松。2024/7/1317:14:072024/7/1317:14:0717:14:0717:14:0713July202413July2024nn快乐工作，心中有梦，齐心协力，再振雄风。快乐工作，心中有梦，齐心协力，再振雄风。5:14:075:14:07下午下午5:145:14下午下午17:14:0717:14:077 7月月-24-24nn一人把关一处安，众人把关稳如山。一人把关一处安，众人把关稳如山。7 7月月-24-247 7月月-24-2417:1417:1417:14:0717:14:0717:14:0717:14:07Jul-24Jul-24nn安全意识在心中，安全生产在手中。安全意识在心中，安全生产在手中。2024/7/1317:14:072024/7/1317:14:07Saturday,July13,2024Saturday,July13,2024nn得过且过，品质不妥。得过且过，品质不妥。7 7月月-24-242024/7/1317:14:072024/7/1317:14:077 7月月-24-24谢谢大家！谢谢大家！