第九章几种特殊酶课件

第九章第九章 几种特殊酶几种特殊酶第一节第一节 模拟酶模拟酶一、模拟酶的概念一、模拟酶的概念模拟酶(Enzyme Mimics)：又称人工合成酶(Synzymes)，是一类利用有机化学方法合成合成的比天然酶简单天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。w分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征及作用机制w模拟酶两个特殊部位：底物结合位点和催化位点w构成底物结合位点比较容易，而构建催化位点比较困难w模拟酶的酶学基础酶的作用机制：过渡态理论对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究设计要点w设计前：酶活性中心-底物复合物的结构酶的专一性及其同底物结合的能力反应的动力学及各中间物的知识 设计要点w设计中：为底物提供良好的微环境微环境催化基团必须尽可能同底物的功能团相接近相接近应具有足够的水溶性水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性二、模拟酶的性质二、模拟酶的性质（1）具有一个良好的疏水键合区疏水键合区来和底物发生相互作用；（2）能与底物形成静电或氢键静电或氢键等相互作用，并以适当的方式相互键合；（3）模拟酶的结构结构对底物键合的方向和立体化学应该具有专一性专一性。w天然酶的模拟工作主要从下面三个层次进行：（1）合成有类似酶活性的简单配合物简单配合物；（2）酶活性中心模拟，即在天然或人工合成的化合物中引入某些活性基团引入某些活性基团，使其具有酶的催化能力；（3）整体模拟，即包括微环境在内的整个酶活性部酶活性部位的化学模拟位的化学模拟。三、几种模拟酶的类型三、几种模拟酶的类型1环糊精模拟酶环糊精模拟酶环糊精(cyclodextrin,CD)是直链淀粉在由芽抱杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称。图11-1 环糊精的分子模型-1，4糖苷键轮胎状三种环状糊精的结构相似，但其水溶解度、穴洞大小等方面存在差别 环糊精（CD）中每个葡萄糖残基6-位的伯羟基和2,3-位的仲羟基都位于穴洞外面上下边缘，所以上下两侧分别具有亲水性或极性。洞穴内壁为氢原子和糖苷键氧原子，具有疏水性或非极性。3 26CD分子的特殊结构使其能识别捕捉识别捕捉一般大小的底物分子，模拟酶的识别作用模拟酶的识别作用。把类似于酶活性基团酶活性基团的小分子修饰到环糊精上，可以模拟酶对有机化合物的催化水解、转氨基以及氧化还原作用等等。目前为止，以环糊精为基本结构的环糊精模拟模型已成功对水解酶、核酸酶、转氨酶、氧化还原酶进行了模拟。例如：在CD侧链连上羧基、咪唑基以及其自身的羟基成功模拟胰凝乳蛋白酶对叔丁基苯乙酸酯胰凝乳蛋白酶模拟酶核糖核酸酶模拟酶核糖核酸酶活性中心基团：组氨酸，赖氨酸2大环聚醚及其模拟酶大环聚醚及其模拟酶 这类模拟酶含有一个能够配合各种离子和分子的完全闭环或者是钳型的空穴，可以对底物进行包结。图 冠醚水解模拟酶的分子模型 已经成功利用冠醚化合物模拟了水解酶和肽合成酶等多种酶活性。可以催化氨基酸对硝基苯酯水解3膜体系及其模拟酶膜体系及其模拟酶 膜体系是由多个分子共同构成对底物有结合作用的空穴。胶束由表面活性物质表面活性物质组成，其分子通常包含亲油基亲油基和亲水基亲水基两部分，亲油基是含8个碳原子以上的碳链，亲水基是带电基团或极性基团。水中的表面活性物质聚集就形成胶束。胶束在水溶液中提供了疏水微疏水微环境环境，类似于酶的结合位点酶的结合位点，将催化基团催化基团和一些辅因子连接在胶束上，提供了类似酶活性中心的催化催化部位部位，使胶束成为具有酶活力的模拟酶。胶束酶模型包括引入组氨酸的咪唑基模拟水解酶的胶束酶模型、以及金属配合物与表面活性剂共同形成的金属胶束酶模型、逆向胶束模拟酶等。图 胶束示意图胶束酶模型w例：N-十四酰基组氨酸所形成的胶束催化对硝基苯酚乙酸酯水解，催化效率比不能形成胶束的N-乙酰基组氨酸高3300倍。4聚合物及其模拟酶聚合物及其模拟酶 某些聚合物由于结构的特殊性，其内部可形成对底物结合的微环境。例如：多分枝聚亚乙基亚胺（PEI）的分子有多个支链，支链在立体空间相互交错，可以在局部形成多个疏水微环境作为底物的结合部位，带有十二烷基和乙基侧链的PEI可以催化脱羧反应。5金属卟啉及其模拟酶金属卟啉及其模拟酶 金属卟啉可以模拟以金属离子为辅酶或辅因子的天然酶。例如：钌卟啉可以模拟SOD酶和过氧化氢酶6肽酶肽酶 肽酶是模拟天然酶的活性部位，人工合成的具有催化活性的多肽。w 1977年人工合成的八肽Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe，具有溶菌酶的活性，其活力达到天然酶的50。w第一个合成的能结合离子的环肽，模拟缬氨霉素结构，有两个二硫键。环肽即具有氢键供体具有氢键受体，所以具有同时识别阴离子和阳离子能力。第二节第二节 核酶核酶核酶（核酶（ribozyme）：具有催化活性的RNA分子称为核酶，也称RNA催化剂。w核酶的发现使人们对“酶”的认识从蛋白质领域延伸到核酸领域，是一个重要的里程碑。w核酶可以通过碱基配对特异性地与相应的RNA底物结合，在特定的位点切割底物RNA分子，是一类很有希望的基因功能阻断剂，被形象地称为“分子剪刀”。核酶的种类：核酶的种类：大分子核酶：I型内含子、II型内含子、RNA酶P的RNA亚基小分子核酶：锤头状核酶、发夹状核酶及丁型肝炎病毒核酶w催化分子内反应（incis）的ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子间反应(in trans)的ribozyme。一、大分子核酶的结构及催化机理1.I型内含子的自我剪接w1982年Cech研究组在研究四膜虫26srRNA的转录后加工问题时发现该rRNA前体有自我剪接的能力。在SDS、酚类、蛋白水解酶、蛋白变性剂等方法完全去除蛋白质下，该rRNA前体有自我剪接的能力。核酶的活性需要内含子折叠成一定的空间结构空间结构。需要需要Mg2和鸟嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸L-19RNAL-19RNA具有polyC聚合酶活性、还有转核苷酸作用（核苷酸转移酶）、水解作用（磷酸二酯酶）、转磷酸作用（磷酸转移酶）、去磷酸作用（磷酸酯酶）、RNA限制性内切酶作用具有经典酶催化反应的标志：底物专一性、符合米氏方程、对竞争性抑制剂敏感2.II型内含子的自我剪接不需要鸟嘌呤核苷酸需要Mg2套索结构中的A有3个磷酸酯键3.RNA酶P的RNA亚基(M1 RNA)RNase P是一种5-内切核酸酶，负责tRNA前体5端的成熟。该酶是核糖核蛋白（由RNA和蛋白质组成）。大肠杆菌的RNase P-RNA 称为M1 RNA，由377个碱基组成，其 RNase P-蛋白质成为C5蛋白质，由119个氨基酸组成。在高Mg2+浓度下，M1 RNA单独存在就具有催化活性。而C5蛋白无论在何种条件下都无催化活性。M1 RNA是真正的生物催化剂催化剂，因为它符合催化剂的条件：在体外能催化别的分子的切割反应；少量的M1 RNA就能使反应大大加速；自身在反应前后不改变。C5蛋白是辅助因子辅助因子，起维护RNA构象的作用。二、小分子核酶的结构及催化机理二、小分子核酶的结构及催化机理1 1锤头状核酶锤头状核酶w锤头状核酶：其与底物结合后呈现一种锤头状结构，含13个保守核苷酸残基和3个螺旋域。w核酶的侧翼序列以碱基配对的方式与靶RNA特异结合w底物切割点5-端端为NUX三体结构（N为A or G or C or U；X为A or C or U），比较典型的切割靶位是GUC三体后的位点 2发夹状结构发夹状结构 其基本结构包括4个螺旋区及5个环状区，其识别的底物序列为NGUC（其中N为A or G or U or C），切割位点在GUC上游。核酶的催化作用机制核酶的催化作用机制w催化性均依赖其三级结构w均含能与底物发生碱基互补的区域。w切割反应主要表现为转酯化过程：由靠近切割位点3-端的2-OH或氧原子对切割位点的磷原子实施亲核攻击，产物是2,3-环化磷酸二酯和5-OH基。假如缺乏2-OH或自我切割位点5-端为脱氧核苷酸，一般不能产生切割效应。三、影响核酶活性的因素三、影响核酶活性的因素 1pH 核酶一般在pH 7.07.5时活性最高。2温度 大多数核酶在37时均具有适宜的活性。3.二价金属阳离子 核酶在细胞内发挥作用需要Mg2+、Mn2+等二价金属阳离子的参与 4.抗生素 抗生素对核酶的活性大多数表现出抑制效应5变性剂变性剂 变性剂对核酶活性的影响可能与变性剂的浓度及各核酶的结构和功能状态等有关。例如：w0.5 mmol/L亚精胺可在一定程度上提高 HDV核酶的切割效率。w适宜浓度的甲酰胺和尿素（57 mol/L左右）可促进基因组核酶（gRz184）和抗基因组核酶（agRzl84）的自我切割。wgRz1066活性随甲酰胺浓度增加而下降。四、核酶的应用四、核酶的应用 1在基础理论研究方面的应用在基础理论研究方面的应用w 对核酶的研究有利于揭开生命起源的奥秘。w某些催化基本生化反应的核酶的发现支持了在蛋白质产生以前，核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想w合成了能催化RNA复制的核酶w阐明某些细胞学方面的基本问题 2.在生物医学上的应用在生物医学上的应用w核酶作为基因治疗的优点核酶作为基因治疗的优点 一个核酶分子可切割多个病毒核酸分子 其作用是切断不是单纯抑制 较好的特异性 针对多个靶位设计串状排列的核酶，可提高切割效率，减少变异病毒逃逸的机会；兼具反义抑制效果。抗HIV病毒，抗肝炎病毒感染、肿瘤治疗等脱氧核酶w具有酶活性的DNA分子称为脱氧核酶wCarmi等通过体外选择技术合成了一种依赖Ca2+的具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子 第三节第三节 抗体酶抗体酶酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态反应过渡态选择结合的催化性物质，抗体是和基态基态分子结合的物质。抗体酶（abzyme）：是具有酶催化功能的抗体分子，本质为免疫球蛋白，在可变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体（Catalytic Antibody）。它既具有抗体的高度选择性，又具有酶的高效催化效率。一、抗体酶的特性一、抗体酶的特性抗体酶具有典型的酶反应特性w 专一性：抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；w催化的高效性：一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快103108倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度w抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。二、抗体酶的制备二、抗体酶的制备1诱导法 采用过渡态类似物为半抗原和载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）一起对动物进行免疫，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶图11-5 利用过渡态类似物制备抗体酶示意图 图11-6 羧酸酯水解反应机理利用过渡态类似物制备抗体酶方法的关键在于过渡过渡态类似物态类似物的正确设计。设计过渡态类似物的指导性原则有形状、电性、酸碱匹配等。例如，酯水解反应的过渡态是带电的四面体结构，因而可选用具有四面体结构的带电磷酸酯作为过渡态类似物。2拷贝法拷贝法 用已知的酶作为抗原免疫动物，再以此种抗体免疫动物，经筛选与纯化，就可获得具有原来酶活性的抗体酶。优点：操作简单，对于自然界来源稀少的紧缺酶来说，可大规模生产。不足之处：这类抗体酶需要筛选获得，具有一定的盲目性，且不能形成新的抗体酶。酶 第一次免疫 第二次免疫 单克隆化 抗体酶 图11-7 拷贝法示意图3化学修饰法（引入法）化学修饰法（引入法）采用选择性化学修饰的方法将人工合成的或天然存在的催化基团引入抗原结合部位，使其获得催化功能。可采用化学修饰或寡核苷酸定点诱变技术将含巯基的柄状亲核基团引入到抗 2，4一二硝基苯酚（DNP）的单抗MOPC 315的抗原结合位点。得到的抗体酶对含有DNP与香豆素的羧酸酯的水解反应的催化效率比二硫苏糖醇（DTT）高6X104倍4引入辅助因子法引入辅助因子法 将引入某辅助因子的半抗原通过共价键连接在载体蛋白上免疫动物后产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性对肽键进行水解。5天然来源抗体酶天然来源抗体酶 在全身红斑狼疮病人的血清中已分离出抗体酶，它具有催化水解DNA的活性。表明在有免疫性缺陷的病人体内存在着抗体酶。6基因工程法基因工程法利用PCR技术将全套抗体重链和轻链可变区的基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体功能片断，再经过化学诱变，获得具有催化活性的抗体酶。该法可筛选具有特定功能的未知结构，具有生产简单、价格低、降低抗体的免疫原性、易获得稀有抗体的优点 例如：黄华梁等利用RTPCR从分泌有谷胱甘肽结合部位的单克隆抗体杂交瘤细胞株2F3中，扩增出单抗重链可变区和轻链可变区基因，经DNA测序后，用linker（Gly4Serl）3构建成单链抗体（scFv）表达载体pTMF-scFv，将重组质粒pTMF-scFv转化到大肠埃希菌BL21（DE3），实现了单链抗体的高效表达，经过金属螫合亲和层析纯化、复性和凝胶过滤纯化，得到电泳均一的单质抗体，再经化学诱变，得到含硒单链抗体酶三、抗体酶催化的反应类型三、抗体酶催化的反应类型 反应类型包括酯水解、酰胺水解、酰基转移、环合反应、光诱导反应、氧化一还原反应、Claisen重排反应、金属螯合反应、脱羧反应、三苯基水解反应、过氧化反应、烯烃的异构化反应等。四、抗体酶的应用四、抗体酶的应用 1在有机合成中的应用在有机合成中的应用 2在前药设计中的应用在前药设计中的应用 第四节第四节 极端酶极端酶一、极端微生物和极端酶一、极端微生物和极端酶 极端微生物：生活在地球上最极端环境条件下的有机生命，又称为嗜极菌（extremophiles）极端酶：指那些可在非常规条件下作用的酶。包括嗜热酶、嗜冷酶、嗜酸酶、嗜碱酶、嗜压酶、嗜盐酶、耐有机溶剂酶、耐抗代谢物酶及耐重金属酶等极端酶根据来源分为三种：极端微生物（细胞）中分离得到的酶；某些来源于常规微生物（细胞）中，但也能在极端条件起催化作用的酶例如能在有机溶剂中催化反应的酶通过人工改良方法或借助人工全合成技术制造出的，具有新型催化活力的酶以及由新型材料构成的酶二、极端酶的筛选二、极端酶的筛选 极端酶的来源:生活在生命边缘（如：温泉、海底、南北极、碱湖和死海等）的极端微生物，包括嗜热菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜盐菌、嗜冷菌、嗜压菌和耐有机溶媒的菌类常规的极端酶筛选方法：从极端环境中采集样品，富集，分离极端微生物，再通过特定选择标记筛选极端酶。美国RBI公司直接从极端环境中收集DNA样品，随机切割成限制性片段，再插入寄主细胞进行表达，并筛选极端菌。RBI公司利用此法已经获得175种新的极端酶,提高了极端酶的筛选效率。三、蛋白质工程生产极端酶三、蛋白质工程生产极端酶 将极端微生物中极端酶的基因转移到普通宿主菌中，在温和的条件下生产极端酶 德国的Hensel等首次将古嗜热菌Pyrococcus 的3-磷酸甘油醛脱氢酶的一个重组基因在大肠埃希菌中表达。蛋白质工程生产极端酶蛋白质工程生产极端酶还存在一些技术难关：w古核菌个别氨基酸的密码子与大肠菌在使用频率上存在差异w重组极端酶蛋白在大肠菌中表达后是否能形成活性构象w古核菌中有一些特殊的伴侣蛋白辅助某些蛋白质形成正确构象，因此也增加了古核菌蛋白异源表达的难度。四、极端酶的应用四、极端酶的应用1在基因工程研究中的应用在基因工程研究中的应用2在有机相中酶催化合成中的应用在有机相中酶催化合成中的应用3在洗涤剂中的应用在洗涤剂中的应用4在皮革工业中的应用在皮革工业中的应用5在食品工业中的应用在食品工业中的应用6在环境保护中的应用在环境保护中的应用