[高二理化生]基因工程概述课件

第一节第一节 基因工程概述基因工程概述 基因工程又称为基因工程又称为重组重组DNADNA技术技术，指在体外通过，指在体外通过人工人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”等方法，对生物的基等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后因进行改造和重新组合，然后导入导入受体细胞并受体细胞并使重组基因在受体细胞中使重组基因在受体细胞中表达表达，产生人类需要，产生人类需要的的基因产物基因产物的技术。的技术。基因工程是指按照人们的基因工程是指按照人们的愿望愿望，进行严格的，进行严格的设计设计，并通过并通过体外体外DNADNA重组和转基因重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。物产品。第一节 基因工程概述 基因工程又称为重组DNA技术，指在1基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果实质实质DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子（基因）水平分子（基因）水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接导入导入 表达表达基因重组基因重组基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果实质DNA2证明证明DNADNA是遗传物质是遗传物质发现发现DNADNA双螺旋结构双螺旋结构破译遗传密码破译遗传密码限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现的发现DNADNA连接酶连接酶的发现的发现逆转录酶的发现逆转录酶的发现质粒等质粒等载体载体的发现的发现基因工程的诞生1944，艾弗里，艾弗里1953，沃森和克里克，沃森和克里克1963，尼伦贝格，尼伦贝格1970，阿尔伯、，阿尔伯、内森斯、史密斯内森斯、史密斯证明DNA是遗传物质发现DNA双螺旋结构破译遗传密码限制性核3基因工程的诞生基因工程的诞生 1973 1973年，美国科学家科恩（年，美国科学家科恩（S.N.CohenS.N.Cohen）等将）等将两种不同来源的两种不同来源的DNADNA分子进行分子进行体外重组体外重组,并首次实并首次实现了在大肠杆菌中的表达现了在大肠杆菌中的表达,创立了创立了定向改造生物定向改造生物的新技术的新技术基因工程。基因工程。基因工程的诞生 1973年，美国科学家科恩（S.N.Coh4 1973 1973年，科恩和博耶将两个不同的质粒（一个年，科恩和博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。具有双重抗药性。1973年，科恩和博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质5基因工程大事记基因工程大事记19731973年，体外重组的基因首次实现在大肠年，体外重组的基因首次实现在大肠杆菌中的表达杆菌中的表达19771977年，生长激素抑制素在大肠杆菌中成年，生长激素抑制素在大肠杆菌中成功表达功表达19781978年，人胰岛素在大肠杆菌中成功合成年，人胰岛素在大肠杆菌中成功合成19791979年，人生长激素在大肠杆菌中得以表年，人生长激素在大肠杆菌中得以表达达19801980年，人干扰素在大肠杆菌中成功表达年，人干扰素在大肠杆菌中成功表达19821982年，巨型小鼠培育成功年，巨型小鼠培育成功基因工程大事记1973年，体外重组的基因首次实现在大肠杆菌中6基因工程的工具基因工程的工具酶与载体酶与载体分子手术刀分子手术刀限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶。分子针线分子针线（分子缝合针）（分子缝合针）DNADNA连接酶连接酶。基因的运输工具（分子运输车）基因的运输工具（分子运输车）载体载体。基因工程的工具酶与载体分子手术刀限制性核酸内切酶。7限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性内切酶是在生物体限制性内切酶是在生物体(主要是主要是微生物微生物)内内的一种酶，能将外来的的一种酶，能将外来的DNADNA切断切断，由于这种切割，由于这种切割作用是在作用是在DNADNA分子内部进行的，故名限制性核酸分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。内切酶。即每种限制性内切酶只能即每种限制性内切酶只能识别特定的核苷识别特定的核苷酸序列酸序列，并在，并在特定的位点特定的位点上切割上切割DNADNA分子。分子。特点：特点：特异性。特异性。举例：举例：EcoR1限制酶、限制酶、Sma1限制酶限制酶限制性核酸内切酶 限制性内切酶是在生物体(主要是微生物8不同的限制性核酸内切酶不同的限制性核酸内切酶知识海洋知识海洋平平(口口)末端末端回文序列回文序列不同的限制性核酸内切酶知识海洋平(口)末端回文序列9要想获得某个特定性状的基因必须要用限要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后让，然后让两者的两者的黏性末端黏性末端黏合黏合起来，起来，就似乎可以合成重组就似乎可以合成重组的的DNADNA分子了。分子了。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几10A A T G A A T T C G A T G A T T C C G T A A T G A A T T C G AT T A C T T A A G C T A C T A A G G C A T T A C T T A A G G C A A T G A A T T C G A T G A T 11DNA连接酶连接酶（DNA ligase）同一种同一种DNA连接酶（DNA ligase）同一种12连接的部位连接的部位：用用DNADNA连连接酶连接接酶连接两个相同两个相同的黏性未的黏性未端要连接端要连接几个磷酸几个磷酸二酯键？二酯键？磷酸二酯键磷酸二酯键，不是氢键。，不是氢键。连接的部位：用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几13连接酶的种类连接酶的种类E.coli DNA 连接酶连接酶T4 DNA 连接酶连接酶连接酶的种类E.coli DNA 连接酶14151515外源基因外源基因(如大鼠生长激素基因如大鼠生长激素基因)怎样怎样才能导入受体细胞才能导入受体细胞(如小鼠受精卵如小鼠受精卵)？导入过程需要运输工具导入过程需要运输工具载体载体。载体的作用有哪些？载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因作用一：作为运载工具，将外源基因转移转移到到受体细胞中去。受体细胞中去。作用二：利用载体在受体细胞内，对作用二：利用载体在受体细胞内，对外源基外源基因因进行进行大量复制大量复制。外源基因(如大鼠生长激素基因)怎样才能导入受体细胞(如小鼠受16作为载体必须具备哪些条件？作为载体必须具备哪些条件？1 1）能够在宿主细胞中）能够在宿主细胞中复制复制并稳定地并稳定地保存保存。2 2）具多个）具多个限制酶切点限制酶切点，以便，以便与外源基因连与外源基因连接接。3 3）具有某些）具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行筛选筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。应的基因等。载体载体作为载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保17常用的载体主要有两类：常用的载体主要有两类：1）细菌细胞质的细菌细胞质的质粒质粒 2 2）噬菌体噬菌体或某些或某些动植物病毒动植物病毒常用的载体主要有两类：18质粒的特点质粒的特点细细胞胞染染色色体体外外能能自自主主复复制制的的小小型型环环状状DNADNA分子分子；质质粒粒是是基基因因工工程程中中最最早早应应用用也也是是最最常常用用的载体；的载体；存在于许多存在于许多细菌及酵母菌细菌及酵母菌等生物中；等生物中；质粒的存在对宿主细胞的生存无影响；质粒的存在对宿主细胞的生存无影响；质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的特点细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子；19 最常用的质粒是大最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如常含有抗药基因，如四环素等四环素等标记基因标记基因。最简单的质粒载体必需包括最简单的质粒载体必需包括3部分：部分：复制区（含复制原点）复制区（含复制原点）目的基因插入点目的基因插入点遗传标记基因遗传标记基因 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环20高二理化生基因工程概述课件211.1.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是错误的是 （）A.A.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱 氧核苷酸序列氧核苷酸序列 B.B.限制性核酸内切酶的活性受温度的影响限制性核酸内切酶的活性受温度的影响 C.C.限制性核酸内切酶能识别和切割限制性核酸内切酶能识别和切割RNARNA D.D.限制性核酸内切酶可从原核生物中提取限制性核酸内切酶可从原核生物中提取 C反馈练习反馈练习1.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，C反馈练习222 2.下下列列关关于于 D DN NA A 连连接接酶酶作作用用的的叙叙述述，正正确确的的是是（）A.A.将单个核苷酸加到某将单个核苷酸加到某DNADNA片段末端，形成磷酸二酯片段末端，形成磷酸二酯键键 B.B.将断开的两个将断开的两个DNADNA片段的骨架连接起来，重新形成片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键磷酸二酯键 C.C.连接两条连接两条DNADNA链上碱基之间的氢键链上碱基之间的氢键 D.D.只能将双链只能将双链DNADNA片段互补的黏性末端之间连接起来，片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链而不能将双链DNADNA片段平末端之间进行连接片段平末端之间进行连接B2.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（）B233.3.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应 的内容，正确的组合是的内容，正确的组合是 （）供体供体剪刀剪刀针线针线载体载体受体受体A A质粒质粒限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶DNADNA连连接酶接酶提供目的提供目的基因的生物基因的生物大肠杆大肠杆菌等菌等B B提供目的基提供目的基因的生物因的生物DNADNA连接酶连接酶限制性核酸限制性核酸内切酶内切酶质粒质粒大肠杆大肠杆菌等菌等C C提供目的基提供目的基因的生物因的生物限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶DNADNA连接酶连接酶质粒质粒大肠杆大肠杆菌等菌等D D大肠杆菌等大肠杆菌等DNADNA连连接酶接酶限制性核酸限制性核酸内切酶内切酶提供目的基提供目的基因的生物因的生物质粒质粒C3.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应供体剪刀针线载244425 5 526272727高二理化生基因工程概述课件28基因工程的一般步骤基因工程的一般步骤1.获得目的基因（目的基因的获取）2.制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）3.转化受体细胞(将目的基因导入受体细胞)（筛选筛选筛选筛选出获得目的基因的受体细胞、培养出获得目的基因的受体细胞、培养出获得目的基因的受体细胞、培养出获得目的基因的受体细胞、培养重组细胞重组细胞重组细胞重组细胞）4.目的基因的表达（目的基因的检测和鉴定）基因工程的一般步骤获得目的基因（目的基因的获取）29第一步：获取目的基因第一步：获取目的基因方法：方法：将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段，导入受片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库（的不同基因，称为基因文库（gene librarygene library）基因组文库基因组文库cDNA文库文库1.从基因文库中获取目的基因。从基因文库中获取目的基因。第一步：获取目的基因方法：将含有某种生物不同基因的许多D30高二理化生基因工程概述课件312.利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR（polymerase chain reaction）:聚聚合酶链式反应合酶链式反应.是以是以DNA变性、复制的某些特性变性、复制的某些特性为原理设计的为原理设计的.1988，K.Mulllis莫里斯发明。莫里斯发明。前提条件是必须对目的基因有一定的了解，前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计需要设计引物引物。3.通过化学方法直接人工合成通过化学方法直接人工合成高温变性高温变性低温退火低温退火(复性复性)中温延伸中温延伸2.利用PCR技术扩增目的基因PCR（polymerase32第二步：第二步：制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）基因表达载体的构建）核心核心限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶需要哪两种工具？需要哪两种工具？DNA连接酶连接酶第二步：制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）核心限制33总结：表达载体需由哪几部分组成总结：表达载体需由哪几部分组成复制原点复制原点启动子启动子目的基因目的基因终止子终止子标记基因标记基因总结：表达载体需由哪几部分组成复制原点34第三步：转化受体细胞第三步：转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）（将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为和表达的过程，称为转化（转化（ruansformation）第三步：转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）将目的基因导35将目的基因导入植物细胞的方法将目的基因导入植物细胞的方法农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法将目的基因导入植物细胞的方法农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法36将目的基因导入微生物细胞方法将目的基因导入微生物细胞方法宿主细胞（大肠杆菌）宿主细胞（大肠杆菌）感受态细胞感受态细胞（大肠杆菌）（大肠杆菌）Ca2+将目的基因导入微生物细胞方法宿主细胞（大肠杆菌）感受态细胞（37基因工程中基因工程中常用的宿主常用的宿主细胞细胞有有大肠杆菌、枯草大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、霉菌、植物细胞、母菌、霉菌、植物细胞、昆虫细胞及哺乳动物细昆虫细胞及哺乳动物细胞等胞等。将目的基因导将目的基因导将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞入受体细胞入受体细胞扩增扩增扩增扩增基因工程中常用的宿主细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵38第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定首先：首先：其次：其次：最后：最后：还要：还要：要检测转基因生物的要检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因上是否插入目的基因DNA分子杂交技术分子杂交技术 分子探针分子探针检测目的基因是否转录出检测目的基因是否转录出mRNA检测目的基因是否翻译出蛋白质检测目的基因是否翻译出蛋白质个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定首先：要检测转基因生物的DNA上39DNA分子杂交技术分子杂交技术基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。测核酸样品中特定基因顺序的探测。满足：（满足：（1）必须是单链，（）必须是单链，（2）带有容易）带有容易被检测出来的标记物。被检测出来的标记物。DNA分子杂交技术基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片401.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（）A.重组重组DNA技术所用的工具酶是限制性核酸内切技术所用的工具酶是限制性核酸内切 酶、连接酶和载体酶、连接酶和载体 B.所有的限制性核酸内切酶都只能识别同一种特所有的限制性核酸内切酶都只能识别同一种特 定的核苷酸序列定的核苷酸序列 C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌 繁殖快繁殖快 D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达只要目的基因进入受体细胞就能实现表达反馈练习反馈练习反馈练习412242高二理化生基因工程概述课件43高二理化生基因工程概述课件443（2010江江苏高考，高考，27题，8分分）下表中列出了几种限制）下表中列出了几种限制酶酶识别序列及其切割位点，序列及其切割位点，图l、图2中箭中箭头表示相关限制表示相关限制酶酶的的酶酶切切位点。位点。请回答下列回答下列问题：（1）一个图）一个图1所示的质粒分子经所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。0、2 3（2010江苏高考，27题，8分）下表中列出了几种限制酶45（2）若对图中质粒进行改造，插入的）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，酶切位点越多，质粒的热稳定性越质粒的热稳定性越 。（3）用图中的质粒和外源）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是切割，原因是 。（4）与只使用）与只使用EcoR I相比较，使用相比较，使用BamH 和和Hind 两种限两种限制酶同时处理质粒、外源制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止的优点在于可以防止 。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入合，并加入 酶。酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。（7）为了从）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在 的培养基中培养，以完成目的基因表的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。达的初步检测。高高 Sma破坏质粒上的抗性基因和外源破坏质粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因中的目的基因 质粒和含目的基因的外源质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化片段自身环化 DNA连接连接 鉴别和筛选含有目的基因的细胞鉴别和筛选含有目的基因的细胞 蔗糖为唯一含碳营养物质蔗糖为唯一含碳营养物质（2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒46一个典型的原核细胞基因结构示意图一个典型的原核细胞基因结构示意图一个典型的原核细胞基因结构示意图47一个典型的真核细胞一个典型的真核细胞基因结构示意图基因结构示意图一个典型的真核细胞48