生物化学蛋白质化学下培训课件

生物化学蛋白质化学下2生物化学蛋白质化学下 结构域（结构域（Structural DomainStructural Domain）是介于二级和三级结构之间的一）是介于二级和三级结构之间的一种结构层次。是指蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构种结构层次。是指蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域，是蛋白质三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都是区域，是蛋白质三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都是几个超二级结构单元的组合。几个超二级结构单元的组合。结构域与结构域之间常常有一段长短不等的肽链相连，形成所结构域与结构域之间常常有一段长短不等的肽链相连，形成所谓铰链区。不同蛋白质分子中结构域的数目不同，同一蛋白质谓铰链区。不同蛋白质分子中结构域的数目不同，同一蛋白质分子中的几个结构域彼此相似或很不相同。常见结构域的氨基分子中的几个结构域彼此相似或很不相同。常见结构域的氨基酸残基数在酸残基数在100100400400个之间，最小的结构域只有个之间，最小的结构域只有40405050个氨基个氨基酸残基，大的结构域可超过酸残基，大的结构域可超过400400个氨基酸残基。个氨基酸残基。结构域一般都具有一定的功能结构域一般都具有一定的功能 。也叫模体（。也叫模体（motifmotif）或基序）或基序3生物化学蛋白质化学下4生物化学蛋白质化学下5生物化学蛋白质化学下-螺旋-转角HTH模体结构示意图螺旋-转角-螺旋模体由2个螺旋和1个转角组成。HTH模体是DNA结合蛋白三维结构中的一部分，每一DNA结合蛋白含一个HTH模体，位于分子表面。DNA结合蛋白常以二聚体形式存在，两个HTG模体相距3.4nm，与DNA的螺距相当，分别结合于DNA分子中相邻的两个深沟中。HTH模体约由20个氨基酸残基组成，第1个螺旋含7个氨基酸残基，转角含4个氨基酸残基，第2个螺旋含9个氨基酸残基。第2个螺旋是DNA识别部位，结合于DNA分子的深沟中。螺旋螺旋转角NC模体：在许多蛋白质的分子中，常发现几个（多为23个）具有二级结构的肽段相互靠近，形成具有特定功能的空间构象；或者仅是一个具有特定功能的很短的肽段。模体（motif）6生物化学蛋白质化学下五 球状蛋白的三级结构 由蛋白质二级结构、超二级结构或结构域相互连接组由蛋白质二级结构、超二级结构或结构域相互连接组合形成的蛋白质构象结构称谓蛋白质三级结构。合形成的蛋白质构象结构称谓蛋白质三级结构。具有三级结构的多肽链称谓亚基（具有三级结构的多肽链称谓亚基（subunit）。单个）。单个多肽链构成的蛋白，具有三级结构才能有活性。多条多肽链构成的蛋白，具有三级结构才能有活性。多条肽链形成蛋白，需要亚基进一步组合才能有活性。肽链形成蛋白，需要亚基进一步组合才能有活性。亲水基团在外，疏水基团在内，形成疏水核心。亲水基团在外，疏水基团在内，形成疏水核心。7生物化学蛋白质化学下8生物化学蛋白质化学下维持蛋白质三级结构的化学键为非共价键氢键；盐碱（离子键）；疏水键；范德华力；配位键；二硫键9生物化学蛋白质化学下六 蛋白质四级结构由两条或以上的具有三级结构的多肽链以非共价键形式组合在一起，形成的结构称谓蛋白质四级结构。10生物化学蛋白质化学下1221NCNC血红蛋白的四级结构成人血红蛋白由2条链和2条链组成,各亚基分别含一个血红素.11生物化学蛋白质化学下12生物化学蛋白质化学下第四节 蛋白质结构与功能关系自然规律：结构决定功能，功能反应结构自然规律：结构决定功能，功能反应结构一一 蛋白质一级结构决定高级结构蛋白质一级结构决定高级结构二二 结构与功能结构与功能 一级结构一级结构 相似蛋白序列相似；相似蛋白序列相似；氨基酸变异造成功能丧失。氨基酸变异造成功能丧失。空间结构与功能空间结构与功能 构象与功能构象与功能镰刀型贫血症：镰刀型贫血症：13生物化学蛋白质化学下14生物化学蛋白质化学下 表中九种动物之间胰岛素分子一级结构中存在的氨基酸残基组成的差异不影响胰岛素的生物活性。临床上曾经应用猪和牛的胰岛素治疗人的糖尿病，取得了显著的疗效。胰岛素分子中氨基酸残基的差异部分来 源氨基酸残基的差异部分A8 A9 A10 B30人 Thr Ser Ile Thr猪 The Ser Ile Ala狗 Thr Ser Ile Ala兔 Thr Ser Ile Ser牛 Ala Ser Val Ala羊 Ala Gly Val Ala马 Thr Gly Ile Ala抹香鲸 Thr Ser Ile Ala 鲸 Ala Ser Thr Ala 15生物化学蛋白质化学下 丝氨酸蛋白酶催化基团丝氨酸周围的固定氨基酸序列 丝氨酸蛋白酶是活性中心含有丝(或苏)氨酸的蛋白水解酶家族。从表中可见，其活性部位丝氨酸（195）附近的氨基酸残基序列相似。表中蓝色标记的氨基酸为同源序列。丝氨酸蛋白酶具有相似的一级结构和相似的三级结构。16生物化学蛋白质化学下 动物体细胞色素C一级结构的进化树图中的数字表示该类动物与其祖先相比细胞色素C一级结构氨基酸残基的差异数17生物化学蛋白质化学下 0 1 0 12 11 011 10 1 010 9 3 2 0 11 10 6 5 3 010 9 5 4 2 3 0 9 8 6 5 4 5 2 0 10 11 7 8 6 7 6 6 0 13 12 11 10 9 10 9 8 12 013 12 12 11 10 10 9 8 10 2 011 10 10 9 8 8 7 6 10 3 3 0 14 15 22 21 20 21 19 18 21 19 20 17 0 15 14 11 10 9 9 8 9 11 8 8 7 22 018 17 14 13 11 12 11 11 13 11 12 11 24 10 021 21 19 18 17 18 17 17 18 17 18 17 26 18 15 027 26 22 22 22 21 22 21 24 23 24 22 29 24 22 24 031 30 29 28 27 25 27 26 28 28 27 27 31 28 29 32 14 0人,猩猩猕猴马驴猪、牛、羊狗小灰鲸兔袋鼠鸡、火鸡企鹅北京鸭响尾蛇啮龟牛蛙金枪鱼螺旋蝇蚕蛾 蚕蛾螺旋蝇金枪鱼牛蛙啮龟响尾蛇北京鸭企鹅鸡，火鸡袋鼠兔 小灰鲸狗猪牛羊驴马猕猴人，猩猩人与一些动物细胞色素C一级结构氨基酸差异的数量比较18生物化学蛋白质化学下 磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶结构域1空间构象的相似性 磷酸丙糖异构酶催化3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮的互变，丙 酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转移磷酸基生成ATP和烯醇式 丙酮酸，但其空间结构具有相似性，其空间结构的中心均是由 8个-折叠组成的-折叠桶，每个-折叠又被-螺旋所分隔磷酸丙糖异构酶丙酮酸激酶结构域119生物化学蛋白质化学下20生物化学蛋白质化学下朊病毒与蛋白质构象病 朊病毒蛋白（prion protein,PrP）是正常存在于人体神经原、神经胶质细胞等多种细胞的细胞膜上的糖蛋白。朊病毒（prion,PrPsc）是正常朊病毒蛋白（PrPc）的空间构象由螺旋变成折叠所致。朊病毒本身不能自我复制，但可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使之构象改变并与其结合，形成朊病毒二聚体。此二聚体现再攻击正常朊病毒蛋白，形成朊病毒四聚体。周而复始，脑组织中朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性病变。21生物化学蛋白质化学下 正常朊病毒蛋白与朊病毒空间结构的差异 朊病毒（PrPsc）是蛋白质，不含核酸。它是正常朊病毒蛋白（PrPc）的空间构象由-螺旋变成-片层结构所致。因此，这类疾病又称蛋白质构象病。朊病毒本身不能复制，但它却可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使其发生构象改变，并与其结合，成为致病的朊病毒二聚体。此二聚体再攻击正常的朊病毒蛋白。这样，脑组织中的朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性变。正常朊病毒蛋白结构 （显示-螺旋）朊病毒结构（显示-片层结构）22生物化学蛋白质化学下具体几种蛋白的功能胰岛素（Insulin）血红蛋白（Hemoglobin）免疫球蛋白（Immunoglobulin）膜蛋白结构前蛋白原的活化23生物化学蛋白质化学下 人胰岛素的一级结构胰岛素由A、B两条多肽链组成，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基。A链内有一个链内二硫键，A与B之间有两个链间二硫键。由于两条链之间由共价键相连接，所以胰岛素没有四级结构。SerGlyIleValGluGlnCysCysThrIleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsnPheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGlyGluArgPhePheTyrThrProLysThrNH215101520COOHA链NH2151015202530HOOCB链24生物化学蛋白质化学下25生物化学蛋白质化学下26生物化学蛋白质化学下27生物化学蛋白质化学下胞外区胞外区跨膜区跨膜区胞内区胞内区28生物化学蛋白质化学下29生物化学蛋白质化学下第五节 蛋白质性质一一 蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质 亲水胶体亲水胶体(1-100nm的的)粒子，具有胶体溶液性质（真粒子，具有胶体溶液性质（真溶液）溶液）丁达尔现象；布朗运动；不透过半透膜；稳定胶体溶丁达尔现象；布朗运动；不透过半透膜；稳定胶体溶液（真溶液）。液（真溶液）。30生物化学蛋白质化学下透析(dialysis):磁力搅拌器透析前透析后透析袋通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。31生物化学蛋白质化学下形成稳定胶体溶液的因素：水化膜和同性电荷蛋白质所带电荷和其周围包绕的水化膜是维持蛋白质在水溶液中稳定的两大因素。脱水和中和电荷可以导致蛋白质的沉淀。水化膜正电荷+H+OH-OH-OH-H+H+脱水脱水脱水蛋白质在等电点时的亲水胶体带负电荷的亲水胶体蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质带正电荷的亲水胶体带正电荷的疏水胶体不带电的疏水胶体 （极易沉淀）带负电的疏水胶体负电荷32生物化学蛋白质化学下二 两性解离和等电点pIpHpH33生物化学蛋白质化学下 三 蛋白质变性作用和复性34生物化学蛋白质化学下 牛胰核糖核酸酶分子的变性与复性变性是指蛋白质在一些理化因素的作用下，其正常的空间构象遭到破坏，主要是次级键或二硫键发生破坏，导致蛋白质的理化性质的改变（如溶解度下降、粘度增加）和生物学活性的丧失。蛋白质的变性不影响其一级结构。三三 蛋白质变性作用和复性蛋白质变性作用和复性35生物化学蛋白质化学下变性物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等沉淀改变pH至pI破坏水溶液中蛋白质的水化膜和中和电荷（变性蛋白质）（蛋白质未变性）凝固加热加热（变性，不再溶解）变性不一定沉淀沉淀不一定变性凝固均变性并不溶解加热加热36生物化学蛋白质化学下蛋白质变性（蛋白质变性（Denaturation）蛋白质复性（蛋白质复性（Renaturation)四四 蛋白质沉淀（蛋白质沉淀（sedimentation）作用）作用precipitation（沉淀）；（沉淀）；Aggregation（凝集）（凝集）1 中性盐法中性盐法 盐析（盐析（salting-out）；分段盐析（）；分段盐析（grading salting-out）重金属盐重金属盐2 有机溶剂有机溶剂 乙醇；丙酮乙醇；丙酮3 生物碱生物碱 单宁酸；苦味酸单宁酸；苦味酸4 有机酸有机酸 三氯乙酸三氯乙酸37生物化学蛋白质化学下第六节 蛋白质分离纯化与测定一一 一般原则步骤一般原则步骤材料获得与破碎（机械、渗透、冻融、超声和酶解等）材料获得与破碎（机械、渗透、冻融、超声和酶解等）蛋白抽提蛋白抽提蛋白粗体（沉淀）蛋白粗体（沉淀）蛋白质分离（精纯化）蛋白质分离（精纯化）测定：浓度；纯度；分子量；性质功能鉴定等测定：浓度；纯度；分子量；性质功能鉴定等38生物化学蛋白质化学下 蛋白质的理化性质与常用的纯化方法二二 蛋白质的提取与纯化原理蛋白质的提取与纯化原理39生物化学蛋白质化学下（一）改变蛋白质的溶解度盐析：高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出有机溶剂沉淀：降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间 相互吸引而沉淀40生物化学蛋白质化学下（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法离心(centrifugation)：利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密 度的物质进行分离 根据转速分类：常用离心机 50 000 rpm 相对离心力（g）=1.119 105 （rpm）2 r 根据应用分类：分析型离心机 制备型离心机g:gravity,rpm:revolution per minut,r:离心半径41生物化学蛋白质化学下匀浆沉淀上清1 000g,5min上清上清上清上清沉淀沉淀沉淀沉淀沉淀4 000g,10min15 000g,20min30 000g,30min100 000g,90min100 000g,180min（未破坏的 真核细胞）（细胞膜碎片，细胞核）（线粒体，细菌）（溶酶体，菌体碎片）（微粒体）（核糖核蛋白体）胞液 亚细胞成分的差速离心分离差速离心法是沉降速度离心的一种，采用离心力由小到大的分阶段离心的办法，将密度不同的物质分步骤地逐一分离开来。亚细胞结构的分离就是其中最好的例子。差速离心法42生物化学蛋白质化学下 几种蛋白质的分子量与沉降系数的关系在单位力场下，溶质分子的沉降速度与离心角速度、离心半径呈正比，其比例常数为沉降系数，用S表示，单位为秒。=s 2 一般蛋白质的沉降系数为10131012秒，故人们以Svedberg(S)单位来表示沉降系数，即1S=1013秒。沉降系数的大小与蛋白质的密度和形状相关。43生物化学蛋白质化学下透析(dialysis):磁力搅拌器透析前透析后透析袋通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。44生物化学蛋白质化学下超滤（ultrafiltration）:在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。磁力搅拌器待超滤的蛋白质溶液加压的氮气超滤膜45生物化学蛋白质化学下凝胶过滤（gel filtration）：凝胶过滤又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向下流动的路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短，移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分分开的目的 46生物化学蛋白质化学下洗脱液胶粒样品小分子大分子蛋白浓度洗脱体积各试管进行连续收集试管走行方向 凝胶过滤分离蛋白质示意图凝胶过滤47生物化学蛋白质化学下根据各种蛋白质在一定的pH环境下所带电荷种类与数量不同的特点，将不同蛋白质予以分离。常用的方法有：离子交换层析电泳等电聚焦。（三）根据蛋白质电荷性质的分离方法49生物化学蛋白质化学下低盐浓度 洗脱液高盐浓度 洗脱液各试管进行连续收集混合蛋白质离子交换层析柱+离子交换层析分离蛋白质示意图试管走行方向离子交换层析(ion exchange chromatography)：50生物化学蛋白质化学下51生物化学蛋白质化学下 离子交换层析分离蛋白质示意图52生物化学蛋白质化学下原点带负电荷蛋白质的泳动方向滤纸、醋酸纤维素薄膜或其他支持物阳极阴极电极缓冲液电极缓冲液电泳示意图电泳（electrophoresis）：53生物化学蛋白质化学下聚丙烯酰胺凝胶电泳上电极缓冲液下电极缓冲液样品槽上样器阴极阳极电泳方向聚丙烯酰胺凝胶板54生物化学蛋白质化学下等电聚焦（isoelectric focusing,IEF）:在具有pH梯度的电场中进行的电泳。每种蛋白质均有其特定的等电点，在pH呈梯度的电场中，按其等电点不同，带有不同的电荷，于是向与其带电相反的电极方向泳动。这样，在电泳时某一蛋白质迁移到电场中某一处的pH等于其等电点时，该蛋白质便因不带电荷而停止泳动。这样，各种蛋白质按其等电点不同得以分离。+(H2SO4)(NaOH)pH3pH10 +(H2SO4)(NaOH)pI 4.5 5.1 6.0 7.9 8.1 pH3pH1055生物化学蛋白质化学下将第一相胶条加到第二相电泳中，走向与 第一相垂直等电聚焦(IEF)pH3.0pH10.0 第一相IEF按pI进行分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）电泳走向 第二相SDS-PAGE 按分子大小分离pH3.0pH10.0+双向电泳（two dimensional electrophoresis）：56生物化学蛋白质化学下57生物化学蛋白质化学下三 分子量测定凝胶过滤59生物化学蛋白质化学下SDS-PAGE60生物化学蛋白质化学下超速离心最低分子量法61生物化学蛋白质化学下四四 蛋白质纯度鉴定：电泳纯蛋白质纯度鉴定：电泳纯五五 蛋白质含量测定蛋白质含量测定62生物化学蛋白质化学下