目的基因的获取培训课件

目的基因的获取l 化学合成法化学合成法l PCR技术技术l 筛选基因文库筛选基因文库l 转座子标签法转座子标签法l mRNA差别显示技术差别显示技术l 生物信息技术分离和鉴定生物信息技术分离和鉴定l 酵母双杂交系统分离酵母双杂交系统分离目的基因的获取：目的基因的获取：2目的基因的获取（一）化学合成法的单元操作（一）化学合成法的单元操作从反应机理上分为：从反应机理上分为：磷酸二酯法、磷酸磷酸二酯法、磷酸 三酯法、三酯法、亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法、自动化合成法自动化合成法操作过程：操作过程：液相合成液相合成 固相合成固相合成一、化学合成法一、化学合成法3目的基因的获取将所要合成的将所要合成的寡核苷酸链的寡核苷酸链的3末端先以末端先以3-OH与一个不溶性载体与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠、二氧化硅，如多孔玻璃珠、二氧化硅等连接，然后依次从等连接，然后依次从3-5的方向的方向将核苷酸单体将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都活性官能团都是经过保护的是经过保护的，其中，其中5-OH用用二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基（DMT）保护，保护，3-端的二丙基亚磷酸酰上的磷端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的酸的OH，用用甲基或氰乙基甲基或氰乙基保护。保护。固相亚磷酸三酯法原理：固相亚磷酸三酯法原理：4目的基因的获取亚磷酸三酯法合成过程亚磷酸三酯法合成过程DMT:二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基 酸（三氯乙酸）洗柱子酸（三氯乙酸）洗柱子1核苷酸连柱子核苷酸连柱子1核苷酸的保护核苷酸的保护 5目的基因的获取 磷氧原子保护基团：磷氧原子保护基团：氰乙基氰乙基激活：激活：氨基亚磷酸化合物氨基亚磷酸化合物亚磷酸三酯亚磷酸三酯2核苷酸活化核苷酸活化缩合反应缩合反应氰乙基氰乙基二异丙基亚磷酸酰二异丙基亚磷酸酰二异丙胺二异丙胺四氮唑活化剂四氮唑活化剂6目的基因的获取氧化氧化:碘碘氧化反应氧化反应35磷酸二酯键磷酸二酯键引物、接头引物、接头、探针等、探针等7目的基因的获取1、小片段粘接法：、小片段粘接法：根据根据目的基因目的基因全序列，分别合全序列，分别合成成12-15碱基长的碱基长的单链单链DNA小片段小片段（二）基因组装战略：（二）基因组装战略：预先设计合成的预先设计合成的片段之间都有互补区域片段之间都有互补区域，不同片段之，不同片段之间的互补区域能形成有断点的完整双链。间的互补区域能形成有断点的完整双链。粘性末端粘性末端8目的基因的获取2、补丁延长法：、补丁延长法：根据根据目的基因目的基因两条互补链全两条互补链全序列，分别合成序列，分别合成12-15碱基长的单链碱基长的单链DNA小片段小片段以及以及20-30碱基长的碱基长的单链单链DNA中片段中片段预先设计合成的预先设计合成的短片段与长片段的某段序列互补。短片段与长片段的某段序列互补。9目的基因的获取3、大片段酶促法：、大片段酶促法：根据根据目的基因目的基因的全序列，的全序列，分别合成分别合成40-50碱碱基长的基长的单链单链DNA片段片段预先设计的预先设计的片段之间片段之间有有局部互补区局部互补区，可以相互作，可以相互作为另一个片段延长的引物。为另一个片段延长的引物。10目的基因的获取（三）（三）DNA化学合成的用途化学合成的用途合成天然基因合成天然基因:胰岛素基因、干扰素等；胰岛素基因、干扰素等；有些基因比较短，化学合成费用较低。有些基因比较短，化学合成费用较低。修饰改造基因，设计新型基因。修饰改造基因，设计新型基因。“人造儿人造儿”20102010，5.205.20，美国美国6464岁科学家岁科学家 10 10年耗资年耗资40004000万美万美元元 用电脑进行基因设计改造后，用化学方法合成基用电脑进行基因设计改造后，用化学方法合成基因后导入到支原体细菌，因后导入到支原体细菌，DNADNA象正常细菌的基因一样象正常细菌的基因一样进行复制人造生命诞生。进行复制人造生命诞生。制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头定点突变合成：定点突变合成：合成带有合成带有定点突变定点突变的基因片断。的基因片断。11目的基因的获取二、二、PCR技术获得目的基因技术获得目的基因反转录反转录PCR：RT-PCR，以，以mRNA逆转录合成的逆转录合成的cDNA第一条链为模板的第一条链为模板的PCR。引物：基因边码区引物，引物：基因边码区引物，oligo（dT）12-18，氨基酸序列设计特异引物：简并引物氨基酸序列设计特异引物：简并引物反向反向PCR：根据已知根据已知DNA区的序列设计引物，以包含区的序列设计引物，以包含已知区和未知区已知区和未知区的环化的环化DNA分子为模板来扩增未知分子为模板来扩增未知DNA区序列的区序列的PCR技术。技术。templatetemplate3 5 3 5 12目的基因的获取三、筛选基因文库三、筛选基因文库(gene library)基因库（基因库（gene pool）：）：特定生物体全基因组的特定生物体全基因组的集合集合（天然存在）。每个种群都具有其独特的基因库。（天然存在）。每个种群都具有其独特的基因库。基因文库（基因文库（gene library or gene bank）通过克隆的方法将某一通过克隆的方法将某一基因组基因组DNA或或mRNA保存于适当保存于适当宿主菌宿主菌中形成的中形成的转化子群转化子群。所有。所有重重组组DNA组合组合代表该代表该基因组的全序列。基因组的全序列。基因组文库和基因组文库和cDNA文库文库根据构建方法的不同，基因文库分为：根据构建方法的不同，基因文库分为：13目的基因的获取（一）基因文库的容量和完备性（一）基因文库的容量和完备性 在构建的基因文库中任一在构建的基因文库中任一基基因存在的概率因存在的概率，它与基因，它与基因文库文库最低所含克隆数最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示：N=ln（1-P）/ln（1-f）P=任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率 f=克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小/生物基因组的大小生物基因组的大小影响因素：影响因素：基因组大小、目的基因在基因组中基因组大小、目的基因在基因组中的拷贝数、克隆载体的容量及目的基因的大小。的拷贝数、克隆载体的容量及目的基因的大小。14目的基因的获取例：人的单倍体例：人的单倍体DNA总长为总长为2.9109bp，基因文，基因文库中克隆片段的平均大小为库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完，则构建一个完备性为备性为0.9的基因文库至少需要的基因文库至少需要45万个万个克隆；而当克隆；而当完备性提高到完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要时，基因文库至少需要180万万个克隆。个克隆。基因文库的完备性:在构建的基因文库中任一基因存在的概率。完备性越高，文库容量越大。完备性越高，文库容量越大。15目的基因的获取（二）理想基因文库条件（二）理想基因文库条件1、完备性高，筛选任一基因的概率均应为、完备性高，筛选任一基因的概率均应为99%2、重组克隆的、重组克隆的总数总数不宜过大不宜过大3、载体的、载体的装载量装载量最好大于基因的长度最好大于基因的长度4、克隆与克隆之间必须存在足够长度的、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠重叠区域区域5、克隆片段克隆片段易于从载体分子上易于从载体分子上完整完整卸下卸下6、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选16目的基因的获取（三）基因组文库的构建程序（三）基因组文库的构建程序 基因组文库：基因组文库：包含某种生物包含某种生物基因组基因组全全部遗传信息的一系列部遗传信息的一系列DNADNA片段片段，通过，通过克隆克隆载体载体贮存在一种贮存在一种受体菌受体菌的群体中，这个的群体中，这个群体称为这种生物的基因组文库。群体称为这种生物的基因组文库。文库中所有克隆所携带的文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组片段重新组合起来可以覆盖该生物的整个基因组。合起来可以覆盖该生物的整个基因组。17目的基因的获取（四）基因组文库的构建程序（四）基因组文库的构建程序1、基因组、基因组DNA的制备和切割的制备和切割（保证（保证DNA片段之间存在部分重叠；片段之间存在部分重叠；DNA片段大小均一）片段大小均一）超声波处理超声波处理 限制性内切酶部分酶切限制性内切酶部分酶切2、载体和受体的选择、载体和受体的选择基因组文库：基因组文库：-DNA或考斯质粒，或考斯质粒，大型基因组使用大型基因组使用YAC或或BACcDNA文库构建载体：文库构建载体：质粒质粒n受体：受体：大肠杆菌或酵母菌大肠杆菌或酵母菌18目的基因的获取3、DNA片段和载体的相连片段和载体的相连 直接连接、人工接头或同聚物加尾。直接连接、人工接头或同聚物加尾。把培养皿上的细菌全部洗下加以保存。把培养皿上的细菌全部洗下加以保存。4、重组体转化宿主细胞，构建形成了基、重组体转化宿主细胞，构建形成了基因组文库的初库（因组文库的初库（primary bank）5、初库扩增形成终库、初库扩增形成终库19目的基因的获取20目的基因的获取（五）（五）cDNA文库的构建文库的构建 某某生物生物mRNAmRNA反转录产生反转录产生cDNAcDNA片段片段分别与分别与合适的合适的克隆载体克隆载体相连，通过转化贮存在一种相连，通过转化贮存在一种受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因组组全部基因全部基因cDNAcDNA的受体菌群体称为该生物的受体菌群体称为该生物cDNAcDNA文库。文库。cDNA文库的特点文库的特点（1 1）不含内含子序列。不含内含子序列。不含内含子序列。不含内含子序列。（2 2）可以在细菌中直接表达。）可以在细菌中直接表达。）可以在细菌中直接表达。）可以在细菌中直接表达。（3 3）包含了所有）包含了所有）包含了所有）包含了所有编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因。（4 4）比）比）比）比DNADNA文库小文库小文库小文库小的多，容易构建。的多，容易构建。的多，容易构建。的多，容易构建。21目的基因的获取cDNA文文库库制制备备及及筛筛选选策策略略22目的基因的获取1、总、总RNA的提取的提取方法：方法：1）提取总核酸，用）提取总核酸，用氯化锂氯化锂将将RNA沉淀；沉淀；2）异硫氰酸胍异硫氰酸胍一步法一步法3）改良的改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化胺十六烷基三甲基溴化胺)法提法提取总取总RNA。4)提取总提取总RNA用商业化的试剂盒（用商业化的试剂盒（kit）Trizol原理：直接在原理：直接在酸性条件酸性条件下抽提，酸性下下抽提，酸性下DNA与蛋白质与蛋白质进入进入有机相有机相而而RNA留在留在水相水相。23目的基因的获取2、mRNA的纯化的纯化（1 1）Oligo(dT)Oligo(dT)纤维素亲和层析法纤维素亲和层析法纤维素亲和层析法纤维素亲和层析法 总总RNA高盐缓冲液高盐缓冲液上柱，带有上柱，带有poly（A）尾尾巴的巴的mRNA与柱子中的与柱子中的oligo（dT）结合，然后结合，然后用用中盐中盐洗柱，去除洗柱，去除rRNA和和 tRNA。蒸馏水或低蒸馏水或低盐盐冲洗柱子获得冲洗柱子获得mRNA。商业化的商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。24目的基因的获取mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%25目的基因的获取（2 2）磁珠法纯化）磁珠法纯化）磁珠法纯化）磁珠法纯化mRNAmRNA 利用总利用总利用总利用总RNARNA纯化试剂盒获得纯化试剂盒获得纯化试剂盒获得纯化试剂盒获得总总总总RNARNA，加，加，加，加入入入入PolyAT mRNAPolyAT mRNA分离系统。分离系统。分离系统。分离系统。生物素标记生物素标记生物素标记生物素标记的的的的dTdT引物引物引物引物与与与与总总总总RNARNA温育温育温育温育，利用强磁场吸附，利用强磁场吸附，利用强磁场吸附，利用强磁场吸附抗生抗生抗生抗生物素蛋白微磁球物素蛋白微磁球物素蛋白微磁球物素蛋白微磁球，从而吸附了通过，从而吸附了通过，从而吸附了通过，从而吸附了通过ATAT配对的配对的配对的配对的杂交体杂交体杂交体杂交体mRNAmRNA。26目的基因的获取PolyAT tract mRNA的分离纯化过程的分离纯化过程磁性分离架分离磁性分离架分离27目的基因的获取3、cDNA的合成的合成cDNA第一链的合成第一链的合成Oligo(dT)12-1828目的基因的获取cDNA第二链的合成第二链的合成u自身引导法：获得的自身引导法：获得的DNA双链双链5端有碱基缺失端有碱基缺失29目的基因的获取u置换合成法：获得的双链置换合成法：获得的双链cDNA 5端也有几端也有几 对碱基缺失对碱基缺失,但一般不影响编码区的完整但一般不影响编码区的完整.大肠杆菌大肠杆菌 DNA 聚合酶聚合酶 30目的基因的获取u引导合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列,但操作比较复杂，但操作比较复杂，Poly（dC）/（dA），），对重组子的复制和测序对重组子的复制和测序不利。不利。31目的基因的获取4、双链、双链cDNA的克隆的克隆平头末端直接与载体连接平头末端直接与载体连接平头两端分别接平头两端分别接同聚物尾同聚物尾：最好是：最好是AT同聚物同聚物尾，重组子可以通过加热尾，重组子可以通过加热局部变性局部变性和和S1核酸酶核酸酶处处理回收插入片段理回收插入片段.加装加装人工接头或衔接物人工接头或衔接物引入酶切口：方便插入片引入酶切口：方便插入片段回收段回收平头平头cDNA可以使用下列三种方法克隆入载体可以使用下列三种方法克隆入载体：32目的基因的获取（六）从基因组文库中筛选目的基因（六）从基因组文库中筛选目的基因探针杂交探针杂交 阳性克隆阳性克隆 质粒提取纯化、酶切质粒提取纯化、酶切探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列获得的简并序列、近缘物种的同源序列获得的简并序列、近缘物种的同源序列33目的基因的获取四、转座子标签法获得目的基因四、转座子标签法获得目的基因（一）转座子的相关知识（一）转座子的相关知识转座子（转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上指位于染色体上可以可以从基因组的一个位置转移到另一个位置从基因组的一个位置转移到另一个位置的的DNA片段或基因。（片段或基因。（jumping gene）简单转座子简单转座子：除：除转座所需基因转座所需基因外不携带任何外不携带任何标记基因的转座因子。标记基因的转座因子。IS复合转座子复合转座子：除：除转座所需基因转座所需基因外还外还携带某种携带某种标记基因标记基因的转座因子。的转座因子。TnA family34目的基因的获取复制转座：复制转座：在转座期间先在转座期间先复制一份拷贝复制一份拷贝，而，而后拷贝转座到后拷贝转座到新的位置，新的位置，原位置仍保留原转座原位置仍保留原转座因子。因子。非复制转座：非复制转座：直接从原来位置上转座插入新直接从原来位置上转座插入新的位置，并留在插入位置上作用。的位置，并留在插入位置上作用。反转座子（反转录转座子）反转座子（反转录转座子）：通过转录合成通过转录合成mRNA，再逆转录合成新的，再逆转录合成新的DNA元件整合到基因元件整合到基因组中完成转座。组中完成转座。35目的基因的获取（）（）Ac自主性因子：自主性因子：有自主剪接和转座的功能有自主剪接和转座的功能 Ds非自主性因子：非自主性因子：独立存在稳定，需要同一族独立存在稳定，需要同一族自主性因自主性因子提供子提供转座酶转座酶才有转座功能。才有转座功能。自主因子、非自主因子自主因子、非自主因子:玉米转座子玉米转座子 Ac/Ds体系体系（）（）Ac-Ds体系：控制色素基因体系：控制色素基因C的表达。的表达。C基因：基因：位于第九染色体上，控制紫色。位于第九染色体上，控制紫色。Ds插入插入C基因基因：C基因失活，玉米不呈紫色。基因失活，玉米不呈紫色。Ac：某种程度上激活某种程度上激活Ds，使，使Ds跳到别的位置，跳到别的位置，则则C基因还原，出现紫色玉米。基因还原，出现紫色玉米。36目的基因的获取玉米花斑的控制玉米花斑的控制在在Ac存在的情况下，存在的情况下，Ds不断跳跃，致使它不断跳跃，致使它所控制的颜色基因时开时闭，从而表现为玉所控制的颜色基因时开时闭，从而表现为玉米籽粒上的斑斑点点。米籽粒上的斑斑点点。37目的基因的获取（二）转座子标签法（二）转座子标签法（transposon tagging）将将转座子转座子插入到欲克隆插入到欲克隆基因的内部或附近基因的内部或附近，使得使得目的基因发生突变目的基因发生突变，然后利用转座子，然后利用转座子DNA为探针为探针筛选突变株的基因组文库，钓出筛选突变株的基因组文库，钓出含有转座子的含有转座子的DNA片段片段。然后再用筛选到的。然后再用筛选到的阳性克隆中阳性克隆中目的基因片段目的基因片段为探针，筛选为探针，筛选野生野生型生物基因文库型生物基因文库分离目的基因。分离目的基因。38目的基因的获取转座子标签法获得目的基因流程转座子标签法获得目的基因流程目的标签法、非目的标签法目的标签法、非目的标签法39目的基因的获取五、图位克隆（五、图位克隆（mapbased cloning）获）获 得目的基因得目的基因图位克隆：又叫定位克隆，图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑年首先由剑桥大学的桥大学的Alancoulson提出。提出。根据根据目的基因在染色体上的位置目的基因在染色体上的位置进行分离基因，进行分离基因，无需预先知道基因的无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。知道其表达产物的有关信息。40目的基因的获取染色体步移（染色体步移（Chromosome Walking）利用与利用与目的基因紧密连锁的分子标记目的基因紧密连锁的分子标记DNA片片段为探针筛选基因组文库段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆，用已获得的阳性克隆DNA的末端片段的末端片段为探针继续筛选，直到获得含为探针继续筛选，直到获得含目的基因两侧序列目的基因两侧序列为止。为止。41目的基因的获取42目的基因的获取1)用遗传作图将目标基因定位在染色体的特定位置用遗传作图将目标基因定位在染色体的特定位置;2)找到与目标基因紧密连锁的分子标记找到与目标基因紧密连锁的分子标记;3)构建含有大插入片段的基因组文库构建含有大插入片段的基因组文库(库或库或);4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;6)通过染色体步行获得含有目标基因的大片段克隆通过染色体步行获得含有目标基因的大片段克隆;7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;染色体步移染色体步移的基本过程的基本过程43目的基因的获取以一系列以一系列头尾相互重叠探针筛库头尾相互重叠探针筛库，类似于从类似于从分子标记序列开始通过一系列相互重叠的克分子标记序列开始通过一系列相互重叠的克隆向目标基因的隆向目标基因的“行走行走”，故称为染色体步移，故称为染色体步移。44目的基因的获取六、六、mRNA差别显示技术（差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因）获得差异表达的基因 mRNA差别显示技术：对差别显示技术：对组织特异性组织特异性或或诱导专一性表达基因诱导专一性表达基因进行分离的有效方进行分离的有效方法之一。将法之一。将mRNA逆转录逆转录和和PCR技术技术相相互结合发展起来的一种互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技指纹图谱技术，也称为术，也称为DDRT-PCR，45目的基因的获取DDRT-PCR理理论论基基础础（1）3端的锚定引物端的锚定引物Oligo(dT)引物的引物的3端加两个核苷酸端加两个核苷酸（倒数第二个不再是（倒数第二个不再是T）。）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 TTTTTTTT5 5 NMM：A、G or C N:A、G、T or C3 1212种锚定引物种锚定引物种锚定引物种锚定引物 46目的基因的获取（3）5端的随机引物端的随机引物 20种种 10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTT5 3 扩增扩增cDNA第一链。第一链。RTNMTTTTTTTT5 cDNA 3 NNNNNNNNNN5 3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二链，并第二链，并PCR47目的基因的获取（4）随机引物与锚定引物成对扩增）随机引物与锚定引物成对扩增12种锚定引物，与种锚定引物，与20种随机引物，可组成种随机引物，可组成240组引物。组引物。引物组合：引物组合：实验结果：实验结果：如果每条带相当于如果每条带相当于一种特定一种特定mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细基本上反映了一种特定细胞中全部的胞中全部的mRNA。240组在能分出组在能分出20000多条带！多条带！48目的基因的获取DDRT-PCR操作步骤操作步骤49目的基因的获取*差异分离目的基因程序差异分离目的基因程序 利用利用两组细胞两组细胞mRNA经过经过DDRT-PCR后，分析比较后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收种类的差异，分别回收cDNA测序分析。用此测序分析。用此DNA片段为探针筛选片段为探针筛选cDNA文库获得全长的文库获得全长的cDNA基因。较适用基因。较适用于分离克隆新基因。于分离克隆新基因。50目的基因的获取52目的基因的获取减法杂交减法杂交(subtractive hybridization)原理：从表达原理：从表达目的基因目的基因的组织提取的组织提取mRNA所转录为所转录为cDNA，然后与，然后与无目的基无目的基因表达因表达的组织提取的的组织提取的mRNA做过量杂交，做过量杂交，在在两组织两组织中均中均表达表达的基因产物形成的基因产物形成cDNA/mRNA双链杂交分子双链杂交分子，而，而特异特异mRNA反转录的反转录的cDNA仍保持单链状态，将仍保持单链状态，将这种这种单链单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。分离出来即为差异表达的序列。53目的基因的获取54目的基因的获取七、酵母双杂交系统（七、酵母双杂交系统（two-hybrid system）分离目的基因分离目的基因有效地分离能与一种有效地分离能与一种已知的诱饵蛋白已知的诱饵蛋白相互作相互作用的蛋白质用的蛋白质.许多真核生物的许多真核生物的转录激活因子转录激活因子都是由两个在都是由两个在结结构上可以分开构上可以分开的、的、功能上也相互独立功能上也相互独立的的结构域结构域组成。组成。1.结构域（结构域（Domain）合作）合作（一）、酵母双杂交系统的原理（一）、酵母双杂交系统的原理55目的基因的获取例如：例如：啤酒酵母的啤酒酵母的半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因激活因子基因激活因子GAL4:DNA binding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录激活转录激活GAL4效应基因效应基因结合结合结合结合激活转录激活转录实验发现：实验发现：转录表达转录表达只要只要DNA binding domain（DNA-BD）与与Active domain（AD）靠近就能激活转录。）靠近就能激活转录。56目的基因的获取2.拆开拆开 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录激活转录激活GAL4效应基因效应基因结合结合用重组用重组DNA技术把技术把GAL4的两个的两个Domain分分开，就开，就丧失丧失了激活效应基因的能力。了激活效应基因的能力。不能转录不能转录57目的基因的获取3.重组重组Domain用重组用重组DNA技术把这两个技术把这两个Domain分别与分别与两个不同的多肽连接。两个不同的多肽连接。Active domain蛋白蛋白A蛋白蛋白BDNA binding domain在体内，蛋白在体内，蛋白A与蛋白与蛋白B是否能结合。是否能结合。4.观察报告基因表达观察报告基因表达58目的基因的获取GAL4的的DB domain与与AD Domain也不能靠近，也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。所以仍然不能启动效应基因的转录。（1）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B不能相互结合不能相互结合（2）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B能相互结合能相互结合上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录激活转录激活GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白B激活转录激活转录转录表达转录表达59目的基因的获取X X基因基因基因基因和和和和Y Y基因基因基因基因产物产物产物产物的相互结合，导致的相互结合，导致的相互结合，导致的相互结合，导致reporter genereporter gene表达。表达。表达。表达。Reporter gene表达就表达就说明说明X基因产物基因产物与与Y基因产物基因产物能结合。能结合。双杂交原理双杂交原理60目的基因的获取重组质粒构建过程重组质粒构建过程61目的基因的获取构建好的两质粒载体构建好的两质粒载体Trp-Leu报告基因表达情况报告基因表达情况构建的质粒转到酵母均株中，根据筛选标记获得阳性植株构建的质粒转到酵母均株中，根据筛选标记获得阳性植株62目的基因的获取八、生物信息技术分离和鉴定目的基因八、生物信息技术分离和鉴定目的基因1、利用、利用EST数据库发现新基因数据库发现新基因EST：基因表达的短的基因表达的短的cDNA序列，包含基序列，包含基因编码区的部分信息，因编码区的部分信息，称为表达序列标签。称为表达序列标签。利用利用EST数据库发现新基因也被称为基因数据库发现新基因也被称为基因的的电脑克隆电脑克隆。GenBank的的EST数据库中已收集了数据库中已收集了EST序序列列2,020,608条条.2000年，夏家辉用年，夏家辉用EST方法发现了神经性耳方法发现了神经性耳 聋基因聋基因.63目的基因的获取2、通过蛋白家族的保守性分离目的基因、通过蛋白家族的保守性分离目的基因(1)利用序列利用序列同源性比较同源性比较软件软件(如如B1ast软件软件)将待进行将待进行延伸的序列延伸的序列(以下简称种子序列以下简称种子序列)对库检索；对库检索；(2)从数据库中从数据库中挑选挑选出全部出全部相关序列相关序列；(3)对所有序列进行片段对所有序列进行片段整合分析整合分析(即即Contig分析分析)，形形成延伸后的序列成延伸后的序列(简称新生序列简称新生序列)。随后，此新生序列。随后，此新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列不能够被进一步延伸为止。不能够被进一步延伸为止。64目的基因的获取作业：作业：1、说明获取目的基因方法的选择策略。、说明获取目的基因方法的选择策略。2、酵母双杂交分离获得目的基因的原理与、酵母双杂交分离获得目的基因的原理与过程？过程？3、详细介绍两种获得差异表达基因的方、详细介绍两种获得差异表达基因的方4.什么是基因组文库什么是基因组文库(genomic library)?构建基构建基因组文库，涉及哪些基本过程因组文库，涉及哪些基本过程?5.什么是什么是cDNA文文(complementDNAlibrary)?65目的基因的获取