疟原虫血片制作及染色-课件

疟原虫血片制作及染色血膜制作血膜染色影响染色效果的因素主要内容血膜制作(血膜分类)用于检查疟原虫的血涂片有两种:一种是将血液涂呈薄膜状,称薄血膜;一种是血液涂成圆盘状,称厚血膜。厚血膜上的血细胞是重叠堆积在玻片上面,而薄血膜上的血细胞则要求平辅在玻片上面。门诊或现场发热病人血片标本片厚血膜用血量约为4l5l,涂制成直径0、8 1cm的厚血膜,由于在制备过程中红细胞已溶解,疟原虫在形态上仍可分辨,但胞浆和胞核不可幸免地形成一定程度的固缩。受影响较大的有大、裂殖体的形态。由于厚血膜与薄血膜相比血量大,须查范围小,节约时间,阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜的1525倍。因此,我们推荐疟疾诊断(门诊检验及现场普查)应以检查厚血膜为主。厚、薄血膜的优缺点及其适用范围薄血膜用血量约为1-1、5l,涂制成2cm宽2、5cm长面积的薄血膜。由于在制备过程中,血片通常经甲醇固定,使红细胞及其内疟原虫的形态保持完整,适用于对疟原虫虫种的鉴定。由于用血量少,为保证检测的敏感性,常耗时较多,不适用于大规模调查。特别在医院的检验室,由于要求在短时间内作出诊断,因而极有估计出现漏诊。厚、薄血膜的优缺点及其适用范围 血膜制作(取血时间)取血时机 现症病人一般可随时取血,疟疾普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时,则应掌握适宜的取血时机。血膜制作(取血时间)间日疟前驱期相当于肝内期疟原虫发育,因原虫密度太低,镜检多为阴性。发冷(寒战)期相当于红内期成熟裂殖体涨破 红细胞期,镜检多为裂殖体和环状体。发热期外周血中以环状体(小滋养体)为主,也可见到裂殖 体;出汗期因原虫密度太低,镜检多为阴性。发作后数小时,间歇期外周血中以大滋养体为主,形态较易辩认,为诊断的有 利时机;发作36-48h,可检出裂殖体;发作1-2次后,配子体出 现较多。血膜制作(取血时间)恶性疟较理想的取血时间是在发作后至 20h内取血,发作后2小时左右,此时环状体发育至最高峰,初发患者退热后常查不到原虫。末梢血血检到恶性疟原虫配子体,是在末梢血出现环状 体之后的7-10天。血膜制作(工具准备)一次性采血针、75%酒精、棉棒(球),载玻片,推片,记号笔或铅笔。血膜制作(取血操作)取血方法 采血部位一般人为耳垂,指头,通常在耳垂取血。先用75%酒精棉球消毒取血部位(冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒),待酒精干后,用左手拇指和食指紧捏耳垂上方,右手持消毒采血针(一人一针,幸免血传疾病)迅速刺入耳垂下端12毫米,不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向上挤压出血。厚血膜 用推片的一角,从取血部位刮取约4-5微升血量(相当于火柴头大小),使血滴与平置的载玻片接触,再由里向外一个方向旋转,转24圈,再回到圆心收起,涂成直径0、81cm大小圆形厚血膜。水平放置,务必使血膜厚薄均匀,过厚易于脱落,过薄达不到检出率的要求。血膜制作(涂片操作)血膜制作(涂片操作)薄血膜 取取洁洁净净的的载载玻玻片片2 2张张,1 1张张以以左左手手拇拇指指,食食指指夹夹持持载载玻玻片片两两端端(手手指指切切勿勿接接触触玻玻片片表表面面),),用用另另1 1张张边边缘缘平平滑滑(最最好好为为磨磨口口边边缘缘)的的载载玻玻片片做做推推片片,用用推推片片一一端端边边缘缘的的中中点点从从取取血血部部分分取取约约1 1微微升升的的血血量量(相相当当于于1/41/4火火柴柴头头大大小小),),使使血血滴滴与与平平置置的的载载玻玻片片接接触触,并并形形成成25302530度度夹夹角角,待待血血液液向向两两侧侧扩扩展展约约2cm2cm长长度度时时,均匀而迅速地轻轻向左推出均匀而迅速地轻轻向左推出(约约2 2、5cm5cm长长)。将推玻片向1的方向稍抽回,当血液充满推玻片适当宽度(约2cm)后,以一定均匀的速度向2的方向滑动(约2、5cm)。血涂片质量评价:血膜均匀、厚薄度合适、无空泡、无划痕 薄血膜头体尾位置和形状好、无停顿起伏、两侧留出空间注意:血滴大,速度快、角度大 血膜厚 血滴小,速度慢、角度小 血膜薄血膜制作(涂片操作)涂制厚、薄血膜的位置 通常是将厚、薄血膜涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分,第1、2格备贴标签及编号用;厚血膜涂在第3格中央,薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个;门诊和发热病人血片每片1人,涂2个厚血膜1个薄血膜,以防血膜脱落而影响检查;疟疾调查时,每张玻片 可涂制23人血膜。标本片发热病人血片标签标签 厚、薄血膜的位置 每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜,如图 2 2、5cm5cm各种不同的疟疾血片涂制法:标准血片门诊发热病人血片居民普查血片血膜制作(涂片操作)血膜编号 血膜制成后,马上用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的号码,以防差错,待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号,依次顺序插入标本盒内。血膜制作的注意事项1 1、玻玻片片清清洗洗时时,幸幸免免玻玻片片碰碰撞撞、磨磨损损。制制作作血血膜膜的的载载玻玻片片必必须须完完全全清清洁洁而而毫毫无无油油渍渍或或污污垢垢。制制片片时时,手手指指只只能能持持载载片片的的边边缘缘,不不能能接接触触玻玻片片表表面面,以以免免油油污污使使薄薄血血膜膜产产生生空空白白区区以以及及厚厚血血膜膜脱脱落落。作作为为推推片片的的玻玻片边缘一定要平滑片边缘一定要平滑,才能使推出的血膜均匀一致。才能使推出的血膜均匀一致。血膜制作的注意事项 2 2、刚刚涂涂制制的的血血膜膜要要平平放放在在标标本本盒盒内内,厚厚血血膜膜未未干干前前勿勿使使标标本本盒盒倾倾斜斜,以以免免血血膜膜倾倾向向一一侧侧,造造成成血血膜膜厚厚薄薄不不均均,厚厚处处不不易易溶溶血血和和着着色色而而影影响响检检查查结结果果;晾晾干干血血膜膜时时应应注注意意防防尘尘、防防止止苍苍蝇蝇、蟑蟑螂螂等等昆昆虫虫吮吮吸吸血血膜膜,凉凉干干后后应应及及时时装装入入标标本本盒盒并并盖盖严严,新新的的木木制制标标本本盒盒需需敞敞开开放放置置一一段段时时间间,让让醇醇、醛醛等等物物质质挥挥发发后后才才能能使使用用,以以免免厚厚血血膜膜红红蛋蛋白白被被其固定其固定,不能溶血导致染色效果不佳。不能溶血导致染色效果不佳。血膜制作的注意事项 3 3、血血膜膜让让其其自自然然干干燥燥,切切忌忌用用太太阳阳晒晒或或火火烤烤,干干透透后后才才能能用用甲甲醇醇固固定定薄薄血血膜膜,并并对对厚厚血血膜膜溶溶血血。夏夏天天标标本本尽尽估估计计24482448小小时时内内固固定定、溶溶血血和和染染色色;冬冬天天也也不不能能超超过过7272小小时时。放放置置时时间间越越久久,厚厚血血膜膜越越不不易易溶溶血血,染染色色效效果果也也差差。若若不不能能及及时时染染色色,薄薄血血膜膜宜宜先先用用甲甲醇醇固固定定,然然后后用用蒸蒸馏馏水水(或或过过滤滤的的清清水水)对对厚厚血血膜膜溶溶血血,晾晾干干固固定定后后装装入入盒盒内内盖严盖严,待以后染色。待以后染色。血膜染色一、染液的种类及染色原理染液种类染液种类:对对镜镜检检疟疟原原虫虫染染色色尽尽管管种种类类名名称称特特别别多多,但但都都是从罗门诺夫斯基氏创造的多色性染液变化过来的。是从罗门诺夫斯基氏创造的多色性染液变化过来的。多多色色性性染染液液可可分分为为水水溶溶液液和和醇醇溶溶液液两两类类。水水溶溶液液类类有有罗罗氏氏(RomanowskyRomanowskyRomanowskyRomanowsky)染染液液、费费氏氏(Field)(Field)(Field)(Field)染染 液液 等等;醇醇 溶溶 液液 有有 吉吉 氏氏(GiemsaGiemsaGiemsaGiemsa)染染 液液、瑞瑞 氏氏(WrightWrightWrightWright)染液等。染液等。血膜染色(一)染液的种类醇溶液类:有吉氏(GiemsaGiemsa)染液、瑞氏(WrightWright)染液等。是在水溶液染液的基础上改进发展而成。目前我们推荐的是运用醇溶液类中的吉氏(GiemsaGiemsa)染液血膜染色(二)染色的原理 染染色色原原理理是是染染料料于于被被染染物物的的阴阴阳阳离离子子互互相相吸吸附附而结合的一种化学反应。而结合的一种化学反应。各各种种细细胞胞和和疟疟原原虫虫主主要要是是由由不不同同的的蛋蛋白白质质或或类类氨氨基基酸酸组组成成。不不同同的的氨氨基基酸酸均均含含有有氨氨基基(NHNHNHNH2 2 2 2)和和羧羧基基(COOHCOOHCOOHCOOH)。在在游游离离状状态态时时,氨氨基基(NH2NH2NH2NH2)获获得得一一个个氢氢离离子子成成为为带带阳阳电电的的离离子子(NHNHNHNH3 3 3 3 +););););而而羧羧基基失失掉掉一一个个氢离子成为带阴电的离子氢离子成为带阴电的离子(COO COO COO COO )。血膜染色(二)染色的原理主要染料都含有美蓝、伊红和美蓝氧化后的天青。主要染料都含有美蓝、伊红和美蓝氧化后的天青。美蓝的有色基团带阳离子美蓝的有色基团带阳离子,是一种碱性染料是一种碱性染料,用的是盐用的是盐酸美蓝。溶于水后离解为带阴电的氯离子和能着色酸美蓝。溶于水后离解为带阴电的氯离子和能着色的美蓝阳离子。的美蓝阳离子。伊红的有色基团带阴离子伊红的有色基团带阴离子,是一种酸性染料是一种酸性染料,染色用的染色用的是伊红钠盐。溶于水中时离解为带阳电的钠离子和是伊红钠盐。溶于水中时离解为带阳电的钠离子和带阴电的伊红离子。带阴电的伊红离子。天青为美蓝氧化而成。虽为碱性染剂天青为美蓝氧化而成。虽为碱性染剂,在染色中起染在染色中起染媒作用。媒作用。血膜染色(二)染色的原理伊红主要离解为酸性的阳离子伊红主要离解为酸性的阳离子,在遇到碱性的蛋白在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的沈淀物染成红色。不易溶于水的沈淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰离子美兰主要离解为碱性的美兰离子,在遇到酸性蛋白在遇到酸性蛋白质如疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性质如疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等即可结合染成兰色。白细胞的颗粒等即可结合染成兰色。血膜染色(二)染色的原理美兰与伊红都不能使原虫和白细胞的核着色美兰与伊红都不能使原虫和白细胞的核着色,必须必须由天青作为媒介由天青作为媒介(染媒染媒)才能使其着色。天青尽管才能使其着色。天青尽管也是碱性染剂也是碱性染剂,但又具有染媒作用但又具有染媒作用,使原虫核和白细使原虫核和白细胞核等原来只能染上极淡蓝色的结构染上显著的胞核等原来只能染上极淡蓝色的结构染上显著的酸性染剂伊红酸性染剂伊红,如此如此,就使白细胞粗大的核染成显著就使白细胞粗大的核染成显著的既蓝又红的紫蓝色的既蓝又红的紫蓝色,而较小或菲薄的原虫核和淋而较小或菲薄的原虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。血膜染色(二)染色的原理染色化学反应反应的示意图染色化学反应反应的示意图:疟原虫细胞浆的阴离子疟原虫细胞浆的阴离子(COOCOOCOOCOO)美蓝阳离子美蓝阳离子呈蓝色呈蓝色 天青天青(染媒作用染媒作用)疟原虫核的阳离子疟原虫核的阳离子(NHNHNHNH3 3 3 3+)呈紫红色呈紫红色 伊红阴离子伊红阴离子血膜染色(二)染色的原理 蛋蛋白白质质本本身身是是阴阴阳阳电电荷荷是是相相等等,带带有有两两基基性性的的。因因此此其其所所带带阴阴阳阳电电荷荷的的数数量量可可受受周周围围液液体体的的酸酸碱碱度度(PHPHPHPH)而而改改变变,在在偏偏酸酸的的溶溶液液中中阳阳离离子子增增加加,易易于于伊伊红红结结合合,着着色色偏偏红红。在在偏偏碱碱的的溶溶液液中中阴阴离离子子增增加加,易易于于美美蓝蓝结结合合,着着色色偏偏蓝蓝。这这就就说说明明了了为为何何配配制制染染液液的的酸酸碱碱度度直直截截了了当当影影响响了了血血片片染染色色的的质质量量,偏偏酸酸着着色色过过红红,偏偏碱碱着着色色过过蓝蓝。因因此此在在染染血血片片时时稀稀释释液液要要控控制制在在PHPHPHPH7 7 7 7、2 2 2 2,最为适宜最为适宜,疟原虫的结构才能清楚可见。疟原虫的结构才能清楚可见。吉氏染色血片外观偏 酸偏 碱标 准 1、吉氏染液的配制:这是目前最常用的疟原虫染色剂,它具有方便、染色效果稳定的优点,也是我们推荐的染色方法。将吉氏粉5g置于研钵中,加入少量甘油充分研磨,然后边加边磨,至甘油250ml加完为止,倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇,洗掉剩余部分,倒入瓶内,再次加甲醇,洗后再倒入瓶中,至甲醇250ml洗清研钵中甘油为止。塞紧瓶塞,充分摇匀,置室温内,每天用力摇动溶液5分钟,3天后即可使用。也可在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠(直径3 5mm),用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中,再把吉氏粉放入漏斗中,用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内,塞紧瓶塞,置于室温内,每天用力摇动5分钟,3天后即可使用。血膜染色(三)染液的配制和染色方法吉氏染液染色方法:先用甲醇固定薄血膜,待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白,然后才进行染色。成批血片染色:将已固定薄血膜的血片插入染色缸,倒入2%吉氏染液稀释液(2毫升原液加中性蒸馏水98毫升稀释均匀即成),同时对厚薄血膜染色30分钟,然后用清水注入染缸将染液通过溢出方式洗去,再用清水浸洗1-2次,干净后将血片标本(血膜面朝下)插于晾干板上,待干后镜检。单张血片染色:薄血膜经固定干燥后,用中性蒸馏水(或娃哈哈矿泉水)1ml,加吉氏母液12滴,混合均匀后滴入血片标本上,染色1020分钟,然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净,晾干镜检。2、瑞式染液的配制:将瑞氏染剂粉1g置于研钵内,加入15ml甘油充分研磨后,倒入有塞玻璃瓶中,再用500ml甲醇洗出研钵中的甘油溶液,倒入瓶中,摇匀后,置室温下,每天摇动5分钟,3天后即可使用。此方法染色的时间短,但染色效果不如吉氏染液效果稳定,又不能大量血片染色,常用于门诊应急情况下血片染色。瑞氏染液的染色方法:先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限,滴几滴蒸馏水在厚血膜上溶血。溶血后倾去水滴。在薄血膜上加瑞氏染液67滴,摇动玻片均匀染色30秒。然后再加1012滴蒸馏水于薄血膜上,摇动玻片将染液与蒸馏水混合均匀后,用吸管把染液引到厚血膜上,使厚血膜再染色5分钟。用清水轻轻冲去染液,晾干镜检。(四)影响染色效果的因素 血片染色好坏除了与玻片是否清洁,血片制作质量好坏等有关外,还受到以下几个因素的影响:1、染料溶剂的质量:染料、甲醇和甘油假如不纯,常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油,而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。(四)影响染色效果的因素2、染液的新旧:新配制的染液因色素尚未充分溶解,染色力较弱且常有沉渣。染液存放时间越久,染色力越强。通常在染液配制12周后才使用,盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。(四)影响染色效果的因素3、染液的稀释浓度:染液的浓度高其着色就快而深,染色时间相对缩短,疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著,但颜色常偏蓝;染液浓度过低则染色时间相对长一些,颜色偏酸红,薛氏点不明显或消失。(四)影响染色效果的因素4、染液稀释后使用时间:染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青,三者能在醇溶液中溶解,但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此,必须在稀释染液当时使用,一般在30分钟内染色力最强。(四)影响染色效果的因素5、染色时间:染色时间长染色效果好,反之较差。室温高则着色快,染色时间可略缩短,气温低可适当延长。因此染色时间应依照染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。(四)影响染色效果的因素6 6、染色用水染色用水:染液的稀释用水和染色后冲洗用水染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择应选择Ph7Ph7、0 07 7、2 2清洁水清洁水,通常使用的新鲜的蒸通常使用的新鲜的蒸馏水馏水(或过滤的冷开水或过滤的冷开水,以及自来水、井水、河水、以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等泉水和雨水等)。假如偏酸或偏碱。假如偏酸或偏碱,可用缓冲液调整。可用缓冲液调整。染色后发现血膜颜色偏蓝染色后发现血膜颜色偏蓝(偏碱偏碱)或偏红或偏红(偏酸偏酸)时时,可可用与之相反的酸、碱度缓冲液冲洗血片予以纠正。用与之相反的酸、碱度缓冲液冲洗血片予以纠正。(四)影响染色效果的因素7 7、染色后不要直截了当将染液倒掉,应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出,并轻轻冲洗,以免染液色素颗粒沾污血膜。感谢您的聆听！