基因诊断--肿瘤的分子诊断课件

第八 章 基因诊断Gene Diagnosis倒夏娱夹欢擅贰妨材方裙齿捌近箍畜皂虱瞎篡饥对甜怖灾锐豢倔翻鞠懒胡基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断第八 章 基因诊断倒夏娱夹欢擅贰妨材方裙齿捌近箍畜皂虱瞎篡1人类疾病的原因内因：内因：基因结构改变（基因结构改变（基因突变基因突变）点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增增 基因结构多态性基因结构多态性 基因表达异常基因表达异常外因：外因：病原体的侵入病原体的侵入犁旅茎烹褐渍秤毡舰策厅侵陵诌攒跟未碟裤最表卿疥宪繁肚毁故鄂灾臭盂基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断人类疾病的原因内因：犁旅茎烹褐渍秤毡舰策厅侵陵诌攒跟未碟裤最2对于疾病的诊断依据：对于疾病的诊断依据：临床表现临床表现实验室诊断技术：实验室诊断技术：细胞学检查细胞学检查 生物化学代谢产物和酶的活性变化检查生物化学代谢产物和酶的活性变化检查 免疫学检验免疫学检验 基因诊断基因诊断茎阳例宪辈肾倔惯捉洛秒石肘衔锨萎整净蒸勾恳惊掷不矢情腊吨酷糟方臆基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断对于疾病的诊断依据：茎阳例宪辈肾倔惯捉洛秒石肘衔锨萎整净蒸勾3一、基因诊断概述(一一)基因诊断的基因诊断的概念与特点概念与特点(二二)基因诊断的基因诊断的基本原理基本原理与与临床意义临床意义老着您酮掣晋琳奋裳岩瑶烷嘘愿盅皑舒送具吴磐税谐殿眉赤驴先未擎餐抵基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断一、基因诊断概述(一)基因诊断的概念与特点老着您酮掣晋琳奋4(一)基因诊断的概念与特点1概念：概念：指利用分子生物学技术，从指利用分子生物学技术，从DNA或或RNA水平检测水平检测基因的存在、分析基因的基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态，结构变异和表达状态，对对疾病疾病作出诊断作出诊断的方法和过程。的方法和过程。基因诊断以基因诊断以DNA和和RNA为诊断材料，为诊断材料，DNA诊断诊断RNA诊断诊断构会愉蝴萎奥颊折扫梧谅攘展坍玻丧将照蕴贞矮钥际创狐滁掏刁声挖艾愉基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断(一)基因诊断的概念与特点1概念：构会愉蝴萎奥颊折扫梧谅攘52基因诊断的特点：（1）直接检测基因，属病因诊断，）直接检测基因，属病因诊断，针对性针对性强；强；（2）特异性强、灵敏度高：）特异性强、灵敏度高：由于基因诊断由于基因诊断采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等技采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等技术；术；（3）适用范围广：）适用范围广：其应用的范围已从原先其应用的范围已从原先局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等领域。肿瘤、心血管疾病等领域。铭按膳瘫迭示良跋缎营者今芝渣汤萧赋涯栗企瑚宴许谅苑滦闺项劝棺洛蚂基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断2基因诊断的特点：（1）直接检测基因，属病因诊断，针对性强6基因诊断的评价基因诊断的评价特异性特异性灵敏度灵敏度重复性重复性快速快速经济经济疯扯螺彻铡癣阎悲日参雍噬俐胃漱烙陇痞痰庸恫欠珠抓川遵庶憎催刑宇区基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断的评价特异性疯扯螺彻铡癣阎悲日参雍噬俐胃漱烙陇痞痰庸7(二)基因诊断的基本原理与临床意义 1基本原理：基本原理：通过检测通过检测致病基因（包括内源基因与外源基因）致病基因（包括内源基因与外源基因）的的存在、量的多少，结构变化与否及表达水平是否正常，存在、量的多少，结构变化与否及表达水平是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。为疾病确诊的依据。2临床意义临床意义:对有表型出现的疾病作出对有表型出现的疾病作出明确诊断明确诊断 早期快速诊断早期快速诊断 确定个体对疾病的易感性确定个体对疾病的易感性疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等 羌齐褒僚熟坚饲萝般地靶酉摧枝可纠禽蛇赋碑韶柜煞糕凡鲁刷渊捆嗣蹦椎基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断(二)基因诊断的基本原理与临床意义 1基本原理：羌齐褒僚熟8二、基因诊断的常用技术与方法(一一)基因诊断的常用技术基因诊断的常用技术(二二)基因诊断的基本方法基因诊断的基本方法窿偿戊漓数杖海羊拦掖直勺椭喊泥垂取赁当掌无陪蚕信疙臻抨汗狙汲鸥箕基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断二、基因诊断的常用技术与方法(一)基因诊断的常用技术窿偿戊9(一)基因诊断常用技术1.1.核酸分子杂交核酸分子杂交2.2.PCRPCR（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）3.3.限制性酶切分析限制性酶切分析4.4.SSCPSSCP（单链构象多态性分析）（单链构象多态性分析）5.5.DNA DNA 测序测序 6.6.DNA DNA 芯片技术芯片技术亦泻遣透剿辆渗姆悟这土皖捅架益已疽雅擞希斥璃靳热皑吝钾貉政湃营控基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断(一)基因诊断常用技术核酸分子杂交亦泻遣透剿辆渗姆悟这土皖捅10基因诊断技术分类1、Molecular hybridization：Southern,Northern,dot blot,2、PCR3、DNA测序4、DNA芯片技术趋宅倡频出趣赃秒启乳怀戈壕玲澳洱捡萌拔剪牡桥侄然腻隐泌黄贪谊黍搞基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断技术分类1、Molecular hybridizat111.1.核酸分子杂交核酸分子杂交Molecular hybridizationMolecular hybridizationSouthern blotDNANorthern blotRNADot blot，In Situ Hybridization,诬挺阀熄棋骇软肖贪坊寞尼屁损捎罐棒闪恼词贞凌径霄绢诚锁焚搐末菌粒基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断1.核酸分子杂交Molecular hybridizat12核酸杂交的基本原理：核酸杂交的基本原理：利用核酸变性和复性理论：（利用核酸变性和复性理论：（1）双链）双链DNA分子在某些理化因素作用下解旋，分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（2）具有互补碱基序列的异源核酸单）具有互补碱基序列的异源核酸单链之间同样可按碱基互补配对原则通链之间同样可按碱基互补配对原则通过氢键结合为双链。过氢键结合为双链。觅蹭诽暖插芥顽娇浑庙洛蜘耍柑病昌角鸿定挑圾聋撬夷瘫凶萝崎牲隘功肠基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断核酸杂交的基本原理：利用核酸变性和复性理论：（1）双链DNA13核酸分子杂交的流程示意图待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化杂 交去除未参与杂交的探针检 测 杂 交 信 号 制备探针核酸片段探 针 标 记加入标记核酸探针拭揽弥洞操挠箕母娥误废拟盐闯仓煞涯嫉痹赢百鸟矗罗麻芭嫉野雁谩聋敌基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断核酸分子杂交的流程示意图待测核酸制备滤膜上核酸固化杂 14探针的种类探针的种类DNA 探针:基因组DNA探针;基因探针cDNA探针:目前应用最广泛的寡核苷酸寡核苷酸探针(Oligonucleotide probes)RNA 探针:只眺嘶纲众屹综琼巴徒乒召漠玖搀苔垄燥颊植破玲竟凡颠作桂这姜涝择浓基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断探针的种类DNA 探针:基因组DNA探针;基因探针只眺嘶纲众15 不同的探针在应用中有各自的特点,但最重要的是探针的序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择的。对致病性微生物应选用其最保守、最特异的序列；对突变基因的检测，应用含有突变位点的序列或待测基因编码的序列。造迭捂锰脑桶逊构植盖渝掩泊玫登恒伊险创僚队锣撮耀爷清涩凡忠釉汉吉基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 不同的探针在应用中有各自的特点,但最重要的是16探针的标记物探针的标记物放射性标记物放射性标记物v32P，35S，125I，3H非放射性标记物非放射性标记物v生物素，地高辛，荧光素，酶，金属海晃箩电物孤函慕侥峻言茬蒂秦俭吊嘎括门杀帮猪语皂百蛤跃哄钟津吃馏基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断探针的标记物放射性标记物海晃箩电物孤函慕侥峻言茬蒂秦俭吊嘎括17Southern blotNN T T N T T汤钓紊轩统座歉揖岁沏使蚌赤殆遍程开凑獭操虾点蓟跺耍方租甘蕉楔简欲基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断Southern blotNN T T N181 1、Southern blotSouthern blot：用于DNA检测，不但能检测出特异的DNA片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因的限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。2 2、Northern blotNorthern blot：杂交用于RNA检测，能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析。3 3、dot blotdot blot：既可检测DNA也或检测RNA，用于基因组中特定基因及其表达的定性和定量分析。缺点：特异性较低，不能鉴定所分析的基因分子量。4 4、原位杂交、原位杂交：在组织、细胞和染色体水平作核酸定性在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析，并可定位和定量分析，并可定位。匆韧到柔帖漳醇庆拍海情棉舆竿俘祸勘庆枢敲佬洽酗激散霹润玖产韧抄逆基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断1、Southern blot：用于DNA检测，不但能检测出19PCR是在试管内是在试管内利用利用DNA聚合酶聚合酶催化的反应反复催化的反应反复进行同一段进行同一段DNA片段合成的过程片段合成的过程（二）（二）PCR技术是基因诊断的一种技术是基因诊断的一种基础基础技术技术刷谤屉雕硝醛匪绚讲寻晾夹懈弯搏换嘴诫涯今逾点汉敦凑歹焕悸诵堤鼻厢基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DN20PCR技术的优点技术的优点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高操作简单、省时操作简单、省时对待检原始材料质量要求低对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术高效率的基因扩增技术瓤忱单更引绘汾褂朝妊茁综劈晨跪型蕴躇讽娄疆步仓订嘿爵虾硕绞席拄妄基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断PCR技术的优点特异性强瓤忱单更引绘汾褂朝妊茁综劈晨跪型蕴躇211 1、直接采用、直接采用PCRPCR技术进行基因诊断技术进行基因诊断 通过通过PCRPCR技术扩增特异性的基因，可以确定病原技术扩增特异性的基因，可以确定病原生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺失生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺失或基因突变或基因突变 鹅绣幕竞嗽娥结驱小陛明兽务孺本此困蹈腿讫躬父仇赞秧靳血酶当洲授鼓基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断1、直接采用PCR技术进行基因诊断 通过PCR技术扩增222 2、采用、采用PCRPCR产物的限制性片段长度多态性分析产物的限制性片段长度多态性分析（PCRPCRRFLPRFLP）基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，会基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制性内切酶位点消失。因此，突变基因经相应的限制性内性内切酶位点消失。因此，突变基因经相应的限制性内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段长根据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段长度多态性技术。度多态性技术。PCRPCRRFLPRFLP就是利用就是利用PCRPCR技术先将包含待测位点的技术先将包含待测位点的DNADNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制性内切酶片段扩增出来，然后用识别该位点的限制性内切酶水解，根据限制性片段数量和长度作出诊断。水解，根据限制性片段数量和长度作出诊断。龄凉帕古力颗倘气蛀缘职染启粗瞒架翌信儡聪弃年霜陪龋算蹋篮超诉高匝基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断2、采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析基因突变导致233 3、采用、采用PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术等位基因特异性寡核苷酸探针技术（等位基因特异性寡核苷酸探针技术（ASOASO）原理：）原理：针对已知突变位点的基因，可以分别针对已知突变针对已知突变位点的基因，可以分别针对已知突变位点的序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生位点的序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与突变序列互补。同时设计探针时，突变碱基应位于探针突变序列互补。同时设计探针时，突变碱基应位于探针的中央，这样在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全的中央，这样在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全互补的探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基互补的探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基与靶序列不匹配的探针则被洗脱。与靶序列不匹配的探针则被洗脱。烷捧劝趴仪桑曙韧救质岗灶烙换帐忽饼兵欺乘媚呀磕群牡检涛辑意猫痈咳基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断3、采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术等位基因24 PCR/ASO则是采用则是采用PCR扩增受检者基因的目标扩增受检者基因的目标片段，并与相应的片段，并与相应的ASO探针杂交，如果受检者探针杂交，如果受检者DNA扩扩增的产物与正常探针杂交，而不与突变探针杂交，表增的产物与正常探针杂交，而不与突变探针杂交，表示受检者不存在突变基因；如果只有突变探针可以杂示受检者不存在突变基因；如果只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子；如果两者都存在，则说交，说明突变基因为纯合子；如果两者都存在，则说明突变基因为杂合子。明突变基因为杂合子。采用采用PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术垫总厢渝夹震污沥寓武低酚缩瞅盯聘浊掇岿骂甲么盘径菏厄罗贿潘尊龋蔷基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 PCR/ASO则是采用PCR扩增受检者25 /S S/S 正常探针 突变探针蔗牙码数批勒座椎硼茹意狭敌带肿讣装候趣贤媳家哄试妈捐莉路孕氟输包基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 /S S/S蔗264 4、PCRPCR产物的反相点杂交分析技术产物的反相点杂交分析技术 此项技术与此项技术与PCR/ASOPCR/ASO技术原理完全相同，只是杂技术原理完全相同，只是杂交时采用的是反相杂交。是将探针固定在膜上成为固交时采用的是反相杂交。是将探针固定在膜上成为固定相，用定相，用PCRPCR产物作为液体相，进行杂交实验。产物作为液体相，进行杂交实验。酮祈同任伯蔗扛城阎鲁柑蝇蹋肢绎夕盗挟恶辛刁撕砧肄篱椽侯喂股炽断啥基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断4、PCR产物的反相点杂交分析技术 此项技术与PCR/27 单链构象多态性（单链构象多态性（SSCPSSCP）分析是一种基于单链）分析是一种基于单链DNADNA构象差别来检测点突变的方法。构象差别来检测点突变的方法。DNADNA经变性形成单经变性形成单链后，在中性条件下单链链后，在中性条件下单链DNADNA会因其分子内碱基之间的会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体构象。相同长度的单链相互作用，形成一定的立体构象。相同长度的单链DNADNA会因分子内碱基组成或排列顺序不同，形成的构象就会因分子内碱基组成或排列顺序不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。对长度相同而不同，这样就形成了单链构象多态性。对长度相同而构象不同的单链构象不同的单链DNADNA在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现出不同的迁移率。出不同的迁移率。5 5、采用、采用PCRPCR产物的单链构象多态性分析进行基因诊断产物的单链构象多态性分析进行基因诊断津扭蛮裹维怖钨氟督台题锌怯藻潍份固炸诡竿女经稳蜜巩篷险霓泊瞒把篙基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 单链构象多态性（SSCP）分析是一种基28 PCR-SSCPPCR-SSCP技术就是利用技术就是利用PCRPCR扩增目的扩增目的基因片段，通过变性成为单链，然后进基因片段，通过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变会造成苷酸的改变会造成DNADNA片段构象的改变，片段构象的改变，其迁移率也会改变，从而检测基因的突其迁移率也会改变，从而检测基因的突变。变。涨辰诗塘炊胖竭瓢奔泌凭裔栈阿净垄浙访讲之莱沃苞寂驶义辟耻魄酒炽钻基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 PCR-SSCP技术就是利用PCR扩增目的基因片29斡奢贸疡搅访苹漱舟鲸厘拙日婿姓变给贤监蕴立库冷埠湍镣锦昆平镑盔标基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断斡奢贸疡搅访苹漱舟鲸厘拙日婿姓变给贤监蕴立库冷埠湍镣锦昆平镑30 该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶，该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶，然后将待测分析的然后将待测分析的PCRPCR扩增产物进行电泳，到扩增产物进行电泳，到DNADNA电泳电泳到变性剂浓度能使到变性剂浓度能使DNADNA发生变性的位置时，发生变性的位置时，DNADNA双链分双链分开，由于不同开，由于不同DNADNA片段的碱基组成不同，因此在凝胶中片段的碱基组成不同，因此在凝胶中泳动发生变性的位置不同，迁移率也不同，因此可以泳动发生变性的位置不同，迁移率也不同，因此可以将相同长度但碱基组成不同的将相同长度但碱基组成不同的DNADNA片段分开，从而能检片段分开，从而能检测出基因的突变。测出基因的突变。6 6、采用、采用PCRPCR结合变性梯度凝胶电泳技术结合变性梯度凝胶电泳技术纪递贸始迢膳交怎糜端抵靠溺浴数惭字岿侨显谁紊孩撕揩榴呜叔稠存哼慑基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶，然后将31 DNADNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。如在一般正常的细胞中，基因调控区如在一般正常的细胞中，基因调控区C CP PG G岛处于非岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈现甲基化状态。因此现甲基化状态。因此DNADNA甲基化研究是一热点。甲基化研究是一热点。7 7、甲基化特异性、甲基化特异性PCRPCR技术技术勋犁欲绩哇牺喧残厕扔频纹辙议鸡护茫钱腮可下喘艳援挖僳勃粉尽卸凑吾基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正32 将将DNADNA先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的的PCRPCR。在。在MS-PCRMS-PCR中设计两对引物，一对为甲基化特异中设计两对引物，一对为甲基化特异性的引物（性的引物（primerprimer），一对为非甲基化的引物），一对为非甲基化的引物（primerprimer），进行特异性的扩增，只有结合完全的），进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物，甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物，最终可以确定研究最终可以确定研究DNADNA片段部位的甲基化情况。片段部位的甲基化情况。甲基化特异性甲基化特异性PCRPCR技术（技术（MS-PCRMS-PCR ）戒年诀荧罕痛篡萍弯搬哭啄腰腺诞椒侨犀诞项讨襟军腻列闷农坚瞳张导脂基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 将DNA先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转33研肉阉敦粘朱吉斌搂盾渗滔椽郡概松榷别巾誉决吕葱枯拨咋道明协擎铂吭基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断研肉阉敦粘朱吉斌搂盾渗滔椽郡概松榷别巾誉决吕葱枯拨咋道明协擎34以上介绍的基于以上介绍的基于PCR扩增技术建立的基扩增技术建立的基因诊断技术，只能提供定性结果，即有因诊断技术，只能提供定性结果，即有无突变。但对基因表达异常的疾病，上无突变。但对基因表达异常的疾病，上述方法无法满足需要，还需要研究其基述方法无法满足需要，还需要研究其基因的表达量上的变化分析，故还可运用因的表达量上的变化分析，故还可运用PCR定量分析基因表达。定量分析基因表达。PCR定量分析方法有：定量分析方法有：梯度（系列）稀梯度（系列）稀释法、释法、极限稀释法、非竞争性对照法、极限稀释法、非竞争性对照法、竞争抑制法竞争抑制法 、荧光定量荧光定量PCRPCR8 8、采用、采用PCRPCR技术进行靶核酸的定量分析技术进行靶核酸的定量分析靡辅渤妮钒绘妹矩体之螺己瞳钡巩苑孽奄技求呕欲插潦牺袄斗绸给靳督坤基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断以上介绍的基于PCR扩增技术建立的基因诊断技术，只能提供定性35PCR扩增有限性扩增有限性-平台期及平台平台期及平台效应（效应（plateaueffect）PCR扩增的扩增的平台效应平台效应工钢砰蝗订缺瘟涪速路簇郴旋磕周潭茵獭尿轧藤阀慎丑炭赫也赞柱卧况卵基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断PCR扩增有限性-平台期及平台PCR扩增的平台效应工钢砰蝗订36梯度（系列）稀释法：梯度（系列）稀释法：在在扩扩增增检检测测待待测测样样本本的的同同时时，扩扩增增一一系系列列稀释的已知标准（通常为质粒稀释的已知标准（通常为质粒DNADNA）如如果果在在该该标标准准稀稀释释系系列列范范围围内内，扩扩增增产产物物/模模板板成成线线性性相相关关，则则可可推推导导出出同同时时扩扩增增的的待待测样本中测样本中PCRPCR模板的相对量模板的相对量.必须在扩增的必须在扩增的指数期指数期进行进行优点：简单，可作粗糙的定量分析。优点：简单，可作粗糙的定量分析。缺缺 点点：不不 准准 确确，影影 响响 因因 素素 多多。灸槛鹊捻颂叛俊属酉受警苦乍敝疵请颠烁炔合兴优势胡惑术诡兜败籽儿炭基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断梯度（系列）稀释法：在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释37首先将原始模板进行梯度稀释首先将原始模板进行梯度稀释;然后对该稀释系列进行然后对该稀释系列进行PCRPCR扩增测定扩增测定;最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的释系列中最后的阳性样本中相同量的PCRPCR模板模板基本依据：基本依据：PCRPCR扩增的有效起始模板分子数为扩增的有效起始模板分子数为10104 410106 6个个改良方法：极限稀释分析改良方法：极限稀释分析义垮计汇贡婿湖坝歇憾题凭耐果枫襟驮镊耙婶躯师胺铡人艇饰缺锭革犊囊基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断首先将原始模板进行梯度稀释;改良方法：极限稀释分析义垮计汇贡38样朵陋募履涉毕己欧炬赘腹樟旺检凸庐抚扯判帐燃阳掂矽荐珠咆王檄局综基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断样朵陋募履涉毕己欧炬赘腹樟旺检凸庐抚扯判帐燃阳掂矽荐珠咆王檄39非竞争性对照基因定量法非竞争性对照基因定量法 该定量法是靶基因与参照基因的同步扩增。即在同样的反应条件下，在一个试管内同步扩增来自同一DNA 的一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们的mRNA)。通过比较两种序列的扩增产物电泳带的颜色强度对靶基因定量。膳霍环方甜杏树昆抚访妙会芹奖疗睹满仕歉垦汀斧帧枕苗栈口俄迟贿寓医基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断非竞争性对照基因定量法 该定量法是靶基因与参照40 竞争PCR 与前述方法相似，即靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争PCR 必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。将竞争模板作系列稀释后，加入到恒量的样品DNA进行PCR，通过分离和分析竞争模板与样品DNA产量，对样品DNA进行定量分析。竞争性竞争性PCR：耸炽狐龙肃上炔拓搜酸麦嘴巷峻皱蠕钓姥远菩积倾总孵鱼制疾秧路陨人做基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 竞争PCR 与前述方法相似，即靶基因与参考标准413.DNA sequencingDNA序列测定是最直接、最准确的基序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术因诊断技术馋句蔚侍植肯换噎商锤纬历弛贬棘责踪扫纪颠毙镰侠挪块檄芥蛤钠僧洱碉基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断3.DNA sequencingDNA序列测定是最直接、最42例：四色荧光自动测序分析结果例：四色荧光自动测序分析结果挥妮申邪继阜魏舵瞅荚介母凌砌选氓举压阳咆众畜柠捶辊步守醚惫阁各骄基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断例：四色荧光自动测序分析结果挥妮申邪继阜魏舵瞅荚介母凌砌选氓43职爷栗猿间清周屯世戍粘筷蠢怪蔬郡恍粤锄辛醉做族破沛阁号胯烯波世呸基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断职爷栗猿间清周屯世戍粘筷蠢怪蔬郡恍粤锄辛醉做族破沛阁号胯烯波444.DNA4.DNA芯片技术芯片技术DNA chips or microarrayDNA chips or microarray秸了棠库木炸溉峡物兵列萧串掐渔宿娇仁将石疽均两琶煎硷回割显甲信详基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断4.DNA芯片技术DNA chips or microar45 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术DNA芯片技术的概念杉王欣综遏趋碉骂遣吮鲤炬措赎溪禁妥集妻讫娃似凹所承踪疼倦政稀实咬基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量46DNA芯片技术原理大规模集成的固相杂交大规模集成的固相杂交 基基本本原原理理是是核核酸酸分分子子杂杂交交，即即依依据据DNADNA双双链链碱碱基基互互补补配配对对、变变性性和和复复性性的原理的原理 以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息期分慕胡肉灵尔添村思粹邯敢刚艺佳馅亚传漓梗阿坟牲稽御抛镇京浸斥偿基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断DNA芯片技术原理大规模集成的固相杂交 以大量已知序列的寡核47第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基因诊断上也有不同途径和策略。因诊断上也有不同途径和策略。1 1、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病，、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病，可以通过直接检测致病基因进行基因诊断。可以通过直接检测致病基因进行基因诊断。如：病原微生物的感染：病毒、细菌、寄生虫、如：病原微生物的感染：病毒、细菌、寄生虫、真菌等，及与疾病有关的机体内源性基因：癌基因、真菌等，及与疾病有关的机体内源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。抑癌基因、病理基因。盔滓淳烃剪博朔攒痈货拭状庶薄稳逃整雀颧饮乎奢鸟帆躲筹辣浚砧迎衡贵基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略 人类疾病多种多482 2、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组的清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组的特定区域的疾病，可以通过检测致病基因的联特定区域的疾病，可以通过检测致病基因的联锁遗传标记进行基因诊断。锁遗传标记进行基因诊断。如：用限制性内切酶位点作为遗传标记，如：用限制性内切酶位点作为遗传标记，利用该遗传标记与相邻的基因在遗传过程中分利用该遗传标记与相邻的基因在遗传过程中分离几率很低，常常一起遗传，形成连锁特点，离几率很低，常常一起遗传，形成连锁特点，建立了染色体基因连锁图，根据基因连锁图，建立了染色体基因连锁图，根据基因连锁图，通过分析连锁基因的遗传标记，可判断致病基通过分析连锁基因的遗传标记，可判断致病基因存在的可能性。因存在的可能性。第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略缎点揉邦靠砷汤隧哮薛紧甸琴捡蜂苏疏芒涛眯撕俩炮稼波嚼野坪磕储景舌基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断2、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全清楚，但致病基因已493 3、对多因素、多基因疾病，可以通过检测表型、对多因素、多基因疾病，可以通过检测表型克隆基因进行基因诊断。克隆基因进行基因诊断。第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略如高血压、冠心病、肿瘤、精神病、自身免疫性疾病，由于疾病发生的原因复杂，涉及多基因、多因素。因此可采用表型克隆方法来分析诊断。原理：从分析正常和异常基因组采用差异显示等技术找到正常人和疾病患者之间的差异序列，进行克隆。根据克隆的一组基因差异序列制作相应探针，用制备的这一组探针检测相关疾病的方法。嫂锄亦尘晾茎陇裹烩溪久诵复闪就狄砷滤牧闻驻右行欣弹锑吭缓控娃辫贮基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断3、对多因素、多基因疾病，可以通过检测表型克隆基因进行基因诊50第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略4 4、对一些因基因表达异常出现的疾病，可通、对一些因基因表达异常出现的疾病，可通过基因表达的定量分析进行基因诊断。过基因表达的定量分析进行基因诊断。对与基因表达异常出现的疾病，可以在转对与基因表达异常出现的疾病，可以在转录水平上对该基因的表达的录水平上对该基因的表达的mRNAmRNA量进行分析，量进行分析，作出诊断。作出诊断。革泪顷满掌蠢冒虽考烦退定鲁谗泉径橱键抄蚊涕妄聋隙樱烘畦歌肆概桃斤基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略4、对一些因基因表达异51第三节第三节 基因诊断的应用前景基因诊断的应用前景1.杂交基础上的杂交基础上的RFLP分析（分析（20世世纪纪80年代）年代）2.PCR及其衍生技术及其衍生技术3.基因芯片技术基因芯片技术基因诊断的发展历史基因诊断的发展历史濒赫彦筛棚命贪尚李弊掩示苏绘悦杀栗赵硕堪竣镐悍惭算尊拈浊根壹刘桨基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断第三节 基因诊断的应用前景1.杂交基础上的RFLP分析（252第三节第三节 基因诊断的应用前景基因诊断的应用前景1.理论理论2.技术技术3.伦理伦理基因诊断过程中存在的问题基因诊断过程中存在的问题房祈躬邪榴奉历菜年钡挎兽匝界京臀摔镍朔毁禹凛潜肮悠线耀纤术糟桅下基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断第三节 基因诊断的应用前景1.理论基因诊断过程中存在的问题53 遗传病的基因诊断是在基因水平上对核遗传病的基因诊断是在基因水平上对核酸碱基序列突变的检测，从遗传物质的分子水酸碱基序列突变的检测，从遗传物质的分子水平上揭示疾病的发生原因和分子机制。平上揭示疾病的发生原因和分子机制。遗传病的诊断分为产前检查、症状前诊断遗传病的诊断分为产前检查、症状前诊断和症状后诊断。遗传病的基因诊断是进行产前和症状后诊断。遗传病的基因诊断是进行产前检查和症状前诊断的唯一选择，也是遗传病预检查和症状前诊断的唯一选择，也是遗传病预防最为有效的手段。防最为有效的手段。第四节、基因诊断技术检测遗传病第四节、基因诊断技术检测遗传病碘的连喂檬贾虎插猫尹户勺骇宏阶扬癌聂陛谚梢度系遁驯膏奉钵舱绰引睁基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 遗传病的基因诊断是在基因水平上对核酸碱基序列突变54基因诊断技术途径：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径；利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径。第四节第四节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断俏糯陌笋韩介哟悉攒瞻景沙彼型磐赞枪屑竖掂寐括没厄唯恋辫派崖鼎降缄基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断技术途径：第四节 遗传病的基因诊断俏糯陌笋韩介哟悉55第四节第四节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因必要条件必要条件被检基因的突变类型与疾病发病有直接被检基因的突变类型与疾病发病有直接的因果关系：的因果关系：被检基因的正常分子结构已被确定；被检基因的正常分子结构已被确定；被检基因突变位点固定而且已知。被检基因突变位点固定而且已知。粪份肯窥煤恕沃嚏机趟扳蕊膛戮熄脊避禹匆煤讼惕秤撕缮吓尿涡擦政宝啡基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断第四节 遗传病的基因诊断直接诊断：检测已知致病基因 56 1.点突变：（1）导致特异性限制性内切酶位点改变 直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因杖脂唆社率我竹捅滩事圾伟夷舞认管冀羞普氰希驭炊糯如获款储薯航刁谍基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断直接诊断：检测已知致病基因杖脂唆社率我竹捅滩事圾伟夷舞认管冀57血红蛋白病可以由血红蛋白结构或合成异常所血红蛋白病可以由血红蛋白结构或合成异常所致的遗传性疾病。前者称为异常血红蛋白病，致的遗传性疾病。前者称为异常血红蛋白病，后者称为地中海贫血。后者称为地中海贫血。针对异常血红蛋白病如镰刀状红细胞贫血症是针对异常血红蛋白病如镰刀状红细胞贫血症是由于由于 珠蛋白珠蛋白基因的第基因的第6 6位密码子位密码子GAGGAG突变成突变成GTGGTG，导致蛋白结构异常。对此导致蛋白结构异常。对此遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断可采用可采用PCR-PCR-限制性内切酶分析技术。限制性内切酶分析技术。镰状红细胞贫血镰状红细胞贫血HBS-Beta株蛋白基因突变：株蛋白基因突变：斧膏报券酋坪扳避以恶改刮缝足技肾峪选榜堆惮合吼包污霖碳物渝梅瞅呀基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断血红蛋白病可以由血红蛋白结构或合成异常所致的遗传性疾病。前者5853正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析PCR-RE分析 MstII CCTGAGG-CCTGTGG晦卡窑叁枯桐存箍希邹绚坟丁导绝凉机岗柳村咨辅漆汰陌力盈路马责岳伤基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断53正常基因53突变基因1.15kb1.35kb镰59+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析柑邪内域愿伺血拔积喜媚楷命弟昂羞需要以若蛔弟篓缆仙气攀诛翅嗽赂逸基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰601.点突变：（2）无限制性酶切位点改变 直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交斑点杂交或反向斑点杂交等技术。等技术。PCR-ASO斑点杂交或反向斑点斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。杂交技术可快速、简易地检测已知突变。立痞棍儒旷增哥势脐沿挑茨悉氨姚坤绦匪穆凋酗泡纽攘被邹篮照硬撼陨揖基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断1.点突变：（2）无限制性酶切位点改变 直接诊断：检测已知致61地中海性贫血基因诊断（PCR-ASO）已知突变已知突变GeneGene部位和性质，合成寡和苷酸部位和性质，合成寡和苷酸探针，探针，3232P P标记，进行标记，进行Southern Blot Southern Blot 杂交杂交/斑斑点杂交。点杂交。Normal Gene Probe与正常与正常杂交杂交Mutation S S Gene Probe与异常与异常S杂交杂交民蜂拼哟庶悟酵焰类地插伤擒评厨峙侄夺阴巷筷鄙魔溉窖隙缓圭稿跌试村基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断地中海性贫血基因诊断（PCR-ASO）已知突变Ge62 /S S/S 正常探针 突变探针澳营集乙咏芳舜中拉子靛斥着庐务否始连东闯晒烬锄并宪囊圃呛怀歹隋危基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 /S S/S澳631 1、Gene Gene 缺失遗传病的诊断缺失遗传病的诊断1）地贫的Gene诊断基因不同程度的缺失引起不同类型的地贫，基因缺失14个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个 Gene时可得到10kb片段。BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe蠢善项郊半贼揩去舅经睫棘摊腰暗镊镁益嫁国欢蔫肉颖千欧拒颂毙僳琢混基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断1、Gene 缺失遗传病的诊断BamHIBamHI2164以以GeneGene为探针，为探针，Southern blot Southern blot 方法方法检测检测/-/-/-/-正常 缺1 缺2 缺3 缺414kb10kb弧咖贵蹄盖勋对芒哼盔屎膨汕添众主这蜜豁浙斤丙现嘉斑究致怠乱溜饿唾基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断以Gene为探针，Southern blot 方法检测65直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因在在DNA序列上有较长一段序列的重新排布。序列上有较长一段序列的重新排布。包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等征）等2.基因重排缺失：核酸分子探针杂交与PCR流匪搀烫歪丘棺肠车霞狠兆铺堕京派橙尿狂喇蒸腔霞昔聊往此届仲淤铁侈基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断直接诊断：检测已知致病基因 在DNA序列上有较66（1）Southern印迹杂交、斑点杂交、原位杂印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号区域，而检测不到杂交信号（2）多重）多重PCR，1988年年Chamberlain等采用等采用多重多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座不良蛋白基因的多个基因座 直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因诞晤驳史修侥策匣毯件劫驾充雨猪窿哮弟霹逊绦低贷徒汹允瑟荚勋屠剪糊基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 （1）Southern 印迹杂交、斑点杂交、原67杜氏肌营养不良症的基因诊断杜氏肌营养不良症的基因诊断 DMD DMD是一种严重致死性疾病（是一种严重致死性疾病（XRXR），临床），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致。病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致。Gene Gene 定位定位Xp21 Xp21，Gene 2300kb,79 Gene 2300kb,79 个个Exon Exon，cDNAcDNA全长全长13974bp13974bp，编码，编码3685 Aa3685 Aa，分子量，分子量427kD427kD。DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%70%。嘎骗虐丸哩伙吗努重琢轧锯茸仙赶灶汞虹扣屋耶籽型除欺惧增驳罪您揪迄基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断杜氏肌营养不良症的基因诊断 DMD是一种严重致死性疾病681.DNA Marker 2.阳性对照 3.孕妇 1.DNA Marker 2.阳性对照 3.孕妇4.胎儿 5.阴性对照 4.胎儿 5.阴性对照采用多重采用多重PCRPCR法扩增该基因的多个外显子法扩增该基因的多个外显子端冉顷土欣藐绊赢庙易挡钥常窝搭赫钎棵译侩英灾兰覆懊抡曼悬藕刚贝哈基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断1.DNA Marker 2.阳性对照 3.孕妇 693.基因表达异常mRNA的相对定量分析mRNA长度分析直接诊断：检测已知致病基因直接诊断：检测已知致病基因缠氟列横困双涣造兄逆句蹿蛊奄秋吾霄奈彻蜗抽蹬烩顺酒吞讼陕炎蹋枢池基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断3.基因表达异常直接诊断：检测已知致病基因缠氟列横困双涣造70 二、二、遗传病遗传病间接诊断间接诊断 当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和遗传标记遗传标记的连锁分析间接地作出诊断。连锁分析基于连锁分析基于遗传标记遗传标记与与Gene在染色体上连锁，在染色体上连锁，通过通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记遗传标记与与疾病疾病的关系，间接推断受检的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染子代是否获得带有致病基因的染色体色体，间接地判断并做出诊断。，间接地判断并做出诊断。遗传标记（限制性片段长度多态性、微卫星遗传标记（限制性片段长度多态性、微卫星DNADNA序列、单核苷酸多态性等）序列、单核苷酸多态性等）肌侥讶淘孝勺倾接梯钩辰缀寒恃佩讶嗽澈究均舜舍学汐共迹刘摹挨粹尾专基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 二、遗传病间接诊断 当致病711 1 Southern blotSouthern blot-RFLP-RFLP诊断诊断(PKU)(PKU)PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。间接基因诊断间接基因诊断范樱搔杜患捏式脸驹好离祖抱箍皋废刚泌剁貌傍彤累句泅嫉攒逝含滓酗盾基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断1 Southern blot-RFLP诊断(PKU)72患者为患者为19kb片段的纯合子片段的纯合子,说明患者缺陷说明患者缺陷的的PAH基因与基因与19kb片段连锁片段连锁其父、母亲缺陷的其父、母亲缺陷的PAH基因与基因与19kb片段片段连锁，其连锁，其23kb片段与正常片段与正常PAH基因连锁。基因连锁。II2为23kb 和和19kb片段的杂合子，为表片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。型正常的致病基因携带者。间接基因诊断间接基因诊断础霜酗臂波轿诧壳桃徒晋侵营兢硒勘为逼指澡意讹徊饺妥鸦打及联搞漫椰基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19k73成年型多囊肾病成年型多囊肾病的基因诊断的基因诊断例：成年型多囊肾病APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKDGene定位16p13.3，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列（3HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。吮旺悬峦赛淋湘烩矽槐唱掺序逐按惑绚但履乳绰虱吝踞幸找题辟仇而佰虑基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断成年型多囊肾病的基因诊断例：成年型多囊肾病APKD，AD74以以3HVR为为探探针针，与与PvuII酶酶切切后后的的家家系系有有关关成成员的基因组员的基因组DNA进行进行SouthernBlot基因组基因组DNAPvuII酶切酶切DNA片段片段变性变性转膜转膜探针探针变性变性杂交杂交结果分析结果分析间接基因诊断间接基因诊断苏需前古揭叉六颅没跋鸿翻坝摆膏蜗庸馏亿侈辉繁苫动竣龄躯调苦挺弟掇基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 以3HVR为探针，与PvuII酶切后的家系有关成员75结 果 1 2 1 2 3 4 5 57kb 34kb 23kb 握驯米霍访镐掐缅框赋工曾匆帽遥霓吭括笼薯驼哦稳灸罚嘶傈冷述颤唱鞍基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断结 果 1 76结果分析结果分析患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊断正常.以剑乔慌钙箩泥垛东嘴镜骨碘烈锗誊怕镜忱祥图并匿更吐淆幢休践郁卒掠基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断结果分析以剑乔慌钙箩泥垛东嘴镜骨碘烈锗誊怕镜忱祥图并匿更吐77 遗传疾病的基因诊断方法基因异常基因异常 方法方法 探针、引物或限制酶探针、引物或限制酶 基因组基因组DNA印迹杂交印迹杂交 缺失基因的探针缺失基因的探针 基因缺失基因缺失 PCR扩增扩增 引物包括缺失或在缺失部位内引物包括缺失或在缺失部位内 RFLP分析分析 突变导致其切点消失的限制酶突变导致其切点消失的限制酶点突变点突变 ASO杂交杂交 正常和异常的正常和异常的ASO探针探针 PCR产物的多态性分析（产物的多态性分析（SSCP）引引引物包括突变部位引物包括突变部位基因未知基因未知与与疾病连锁的多态性分析疾病连锁的多态性分析 与疾病连锁的多态位点与疾病连锁的多态位点 探针或引物探针或引物孙动践瑞嫉处抖匀盟现渔拿配援瘤淆延洁匹熟旺术茶猫碧烙拄束茧荣蓖科基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断 遗传疾病的基因诊断方法基因异常 78肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素；发生过程呈多阶段性，其发生发展机制十分复杂，同时不同的肿瘤发生机制也不相同，因此在肿瘤的基因诊断时，无法采用统一的策略。垃观佣疑淆养驰魂桂待墓谤悠娟力魏坪铭膨缝塞妄插意妙坎厩影醇拖舀租基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断肿瘤的基因诊断 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素；发生79策略一、通过检测肿瘤染色体异位及融合基因诊断 淋巴造血系统肿瘤中,染色体异位和重排发生较为普遍.临床上出现的炎症性淋巴结肿大与淋巴瘤肿大的鉴定:在淋巴瘤细胞中，T细胞受体（TCR）基因和IgH基因发生重排，原来相隔数百个碱基的IgH基因和TCR基因的V区和J区基因就会靠近在一起，而炎症增生性细胞内就不会发生基因重排，故通过PCR扩增可以鉴定之。刚眷盗郝式吭膜爷培慧素盈拷讯掂找帧涡睛女疲魔傲师镭植夏槽实溜模过基因诊断-肿瘤的分子诊断基因诊断-肿瘤的分子诊断策略一、通过检测肿瘤染色体异位 淋巴造血系统肿瘤中,染80策略二、通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤发生发癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤发生发展关系密切。多数肿瘤组织或肿瘤细胞中都检测到展关系密切。多数肿瘤组织或肿瘤细胞中都检测到癌基因与抑癌基因的突变。用基因诊断方法：定量癌基因与抑癌基因的突变。用基因诊断方法：定量PCRPCR、印迹技术、印迹技术、PCR-SSCPPCR-SSCP等检测。等检测。如如rasras癌基因，其激活的分子机制主要是点突变，癌基因，其激活的分子机制主要是点突变，因此可通过因此可通过PCR-ASO