第14讲微阵列技术课件

生物信息学生物信息学第十四讲第十四讲微阵列技术及其应用微阵列技术及其应用生物信息学第十四讲1 1p19971997年，年，财财富富杂杂志就志就报报道道说说，“在在2020世世纪纪科科技史上有两件事影响深技史上有两件事影响深远远：一是微：一是微电电子芯片，它子芯片，它是是计计算机和算机和许许多家多家电电的的 心心脏脏，改，改变变了我了我们们的的经济经济和文化生和文化生 活，并已活，并已进进入每一个家庭；另一就入每一个家庭；另一就是生物芯片，它将改是生物芯片，它将改变变生命科学的研究方式，革生命科学的研究方式，革新医学新医学诊诊断和治断和治疗疗，极大地提高人口素，极大地提高人口素质质和健康和健康水平。水平。”1997年，财富杂志就报道说，“在20世纪科技史上有两件2 21.生物芯片的诞生 p生物芯片（生物芯片（生物芯片（生物芯片（Biochip,Bioarray,Biochip,Bioarray,Biochip,Bioarray,Biochip,Bioarray,microarraymicroarraymicroarraymicroarray）：将高密度）：将高密度）：将高密度）：将高密度核酸、抗原、抗体、核酸、抗原、抗体、核酸、抗原、抗体、核酸、抗原、抗体、细细胞或胞或胞或胞或组织组织等生物等生物等生物等生物识别识别分子分子分子分子按按按按预预先先先先设设置的排置的排置的排置的排列列列列固定于一种固定于一种固定于一种固定于一种载载体（如硅片、玻片及高聚物体（如硅片、玻片及高聚物体（如硅片、玻片及高聚物体（如硅片、玻片及高聚物载载体等）表面，利用生物分子的特意性体等）表面，利用生物分子的特意性体等）表面，利用生物分子的特意性体等）表面，利用生物分子的特意性亲亲和和和和反反反反应应，如，如，如，如DNA-DNADNA-DNADNA-DNADNA-DNA杂杂交、交、交、交、DNA-RNADNA-RNADNA-RNADNA-RNA杂杂交、抗原交、抗原交、抗原交、抗原-抗体以及受体抗体以及受体抗体以及受体抗体以及受体-配体配体配体配体之之之之间间的特异性的特异性的特异性的特异性结结合，合，合，合，检测检测生物生物生物生物样样品中品中品中品中对应对应生物分子的有无、多少或者生物分子的有无、多少或者生物分子的有无、多少或者生物分子的有无、多少或者结结构改构改构改构改变变等等等等。高通量、微型化和自动化高通量、微型化和自动化 1.生物芯片的诞生 生物芯片（Biochip,Bioarr3 3在在在在许许多情况下，生物多情况下，生物多情况下，生物多情况下，生物学学学学问题问题最最最最终终的解决都的解决都的解决都的解决都源于技源于技源于技源于技术术上的突破。上的突破。上的突破。上的突破。Mark SchenaMark SchenaMark SchenaMark Schena 在许多情况下，生物学问题最终的解决都源于技术上的突破。4 4p后基因后基因后基因后基因组时组时代，蛋白代，蛋白代，蛋白代，蛋白组组学，涌学，涌学，涌学，涌现现出出出出许许多功能多功能多功能多功能强强大大大大的研究方法和研究工具，最突出的就是的研究方法和研究工具，最突出的就是的研究方法和研究工具，最突出的就是的研究方法和研究工具，最突出的就是细细胞蛋白胞蛋白胞蛋白胞蛋白质质二二二二维维凝胶凝胶凝胶凝胶电电泳（泳（泳（泳（2-D-gel2-D-gel2-D-gel2-D-gel）（及相）（及相）（及相）（及相应应的的的的质谱质谱法法法法测测蛋白分子量）和生物芯片（蛋白分子量）和生物芯片（蛋白分子量）和生物芯片（蛋白分子量）和生物芯片（BiochipBiochipBiochipBiochip）技）技）技）技术术 p生物科学正迅速地演生物科学正迅速地演生物科学正迅速地演生物科学正迅速地演变为变为一一一一门门信息科学信息科学信息科学信息科学生物芯片是信息生物芯片是信息生物芯片是信息生物芯片是信息时时代的代的代的代的产产物，物，物，物，横跨：横跨：横跨：横跨：生命科学、生命科学、生命科学、生命科学、物理学、物理学、物理学、物理学、计计算机科学、微算机科学、微算机科学、微算机科学、微电电子技子技子技子技术术光光光光电电技技技技术术、材料科学、材料科学、材料科学、材料科学、等等等等现现代高科技代高科技代高科技代高科技 后基因组时代，蛋白组学，涌现出许多功能强大的研究方法和研究工5 5生物芯片发展历史生物芯片发展历史Southern&Northern Southern&Northern BlotBlotDot Dot BlotBlotMacroarrayMacroarrayMicroarrayMicroarraySouthern blot可以被看作是生物芯片的雏形 生物芯片发展历史Southern&Northern Do6 62.2.生物芯片（微生物芯片（微阵列）列）是如何定是如何定义的？的？必必必必须须符合：符合：符合：符合：有有有有规则规则的；的；的；的；显显微尺度的；微尺度的；微尺度的；微尺度的；平面的；平面的；平面的；平面的；特异性的。特异性的。特异性的。特异性的。2.生物芯片（微阵列）是如何定义的？必须符合：7 7规则的微的微阵列列pp微微微微阵阵列上的点按照行和列列上的点按照行和列列上的点按照行和列列上的点按照行和列规则规则地排列而非无地排列而非无地排列而非无地排列而非无规则规则排列；排列；排列；排列；pp点的大小和点点的大小和点点的大小和点点的大小和点间间距均一而非不均一；距均一而非不均一；距均一而非不均一；距均一而非不均一；pp点的位置明确而非模棱两可。点的位置明确而非模棱两可。点的位置明确而非模棱两可。点的位置明确而非模棱两可。规则的微阵列微阵列上的点按照行和列规则地排列而非无规则排列8 8显微尺度的点微尺度的点p显显微尺度（微尺度（microscopic):microscopic):是一个物体若没有是一个物体若没有显显微微镜镜的帮助，不能清楚地被看的帮助，不能清楚地被看见见。一般以。一般以小于小于1mm1mm为为界。界。p微微阵阵列：列：l l光引光引导导原位合成的点：原位合成的点：15153030 m ml l点制的点：点制的点：5050350350 m ml l组织组织芯片的点：芯片的点：200200600600 m m显微尺度的点显微尺度（microscopic):是一个物体9 9一块指甲大小一块指甲大小基因芯片的密度：基因芯片的密度：基因芯片的密度：基因芯片的密度：100-1 million DNA 100-1 million DNA 100-1 million DNA 100-1 million DNA 探探探探针针/1 cm/1 cm/1 cm/1 cm2 2 2 2一块指甲大小基因芯片的密度：100-1 million DN1010平面基片平面基片p平面基片是像玻璃、塑料、硅片一平面基片是像玻璃、塑料、硅片一样样平行不平行不能弯曲的基能弯曲的基质载质载体。玻片是微体。玻片是微阵阵列中用得最列中用得最为为广泛的基广泛的基质载质载体。体。p非平面基片：尼非平面基片：尼龙龙膜、硝酸膜、硝酸纤维纤维素膜等。素膜等。p平坦的表面平坦的表面优优点：适合大点：适合大规规模自模自动动化生化生产产；为为光掩膜、接触式光掩膜、接触式针针点点样样、喷喷墨式非接触点墨式非接触点样样和其它制和其它制备备工序提供了精密的距离，确保制工序提供了精密的距离，确保制备备微微阵阵列的高列的高质质量；使量；使扫扫描和成像描和成像变变得容易。得容易。平面基片平面基片是像玻璃、塑料、硅片一样平行不能弯曲的基质1111特异性吸附特异性吸附p微微阵阵列上的每一个点能与列上的每一个点能与标记标记好的探好的探针针混合物中混合物中的一种分子的一种分子发发生吸附，才能生吸附，才能对对此基因或基因此基因或基因产产物物进进行精确的行精确的检测检测特异性吸附微阵列上的每一个点能与标记好的探针混合物中的一种1212PrinciplePrinciplePrinciplePrinciple：Hybridization of the target to the Hybridization of the target to the Hybridization of the target to the Hybridization of the target to the probeprobeprobeprobe Principle：Hybridization of the1313核酸分子固相核酸分子固相杂交方法交方法p菌落原位菌落原位杂杂交（交（Colony in situ Colony in situ hybridizationhybridization）pSouthernSouthern印迹印迹杂杂交（交（Southern blotSouthern blot）pNorthernNorthern印迹印迹杂杂交（交（Northern blotNorthern blot）p斑点斑点杂杂交（交（Dot blotDot blot）p组织组织原位原位杂杂交（交（Tissue in situ Tissue in situ hybridizationhybridization）核酸分子固相杂交方法菌落原位杂交（Colony in sit1414Hybridization methodsHybridization methods Hybridization methods 1515Southern and Northern blot Southern and Northern blot hybridizationhybridizationSouthern and Northern blot hyb1616Colony in situ hybridizationColony in situ hybridizationColony in situ hybridization1717Fluorescent in situ hybridization Fluorescent in situ hybridization(FISH)(FISH)Fluorescent in situ hybridizat1818抗原抗体抗原抗体p酶联酶联免疫吸附免疫吸附测测定定 (Enzyme-Linked(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)ImmunoSorbent Assay,ELISA)抗原抗体酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Im19193.Biochip3.Biochip的的类型型 p狭狭义义：微：微阵阵列芯片，主要包括列芯片，主要包括cDNAcDNA微微阵阵列、列、寡核苷酸微寡核苷酸微阵阵列、蛋白列、蛋白质质微微阵阵列和小分子化列和小分子化合物微合物微阵阵列等列等p 广广义义：能：能对对生物成分或生物分子生物成分或生物分子进进行快行快速并行速并行处处理和分析的厘米理和分析的厘米见见方的固体薄型器方的固体薄型器件，主要件，主要还还包括微流体芯片和包括微流体芯片和“芯片芯片实验实验室室”。3.Biochip的类型 狭义：微阵列芯片，主要包括cD2020生物芯片的类型pp基因芯片基因芯片gene chipgene chip：又称：又称DNADNA芯片芯片,是根据核酸是根据核酸杂杂交交的原理，将大量探的原理，将大量探针针分子固定于支持物上，然后与分子固定于支持物上，然后与标标记记的的样样品品进进行行杂杂交，通交，通过检测杂过检测杂交信号的交信号的强强度及分布度及分布来来进进行分析。行分析。pp蛋白蛋白质质芯片芯片protein chipprotein chip：利用抗体与抗原特异性：利用抗体与抗原特异性结结合即免疫反合即免疫反应应的原理，将蛋白的原理，将蛋白质质分子（抗原或抗体）分子（抗原或抗体）结结合到固相支持物上，形成蛋白合到固相支持物上，形成蛋白质质微微阵阵列，即蛋白列，即蛋白质质芯片。芯片。pp组织组织芯片芯片tissue microarraytissue microarraypp芯片芯片实验实验室室(labs-on-chip)(labs-on-chip)：微流体芯片微流体芯片：微流控：微流控芯片技芯片技术术(Microfluidics)(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析是把生物、化学、医学分析过过程的程的样样品制品制备备、反、反应应、分离、分离、检测检测等基本操作等基本操作单单元集元集成到一成到一块块微米尺度的芯片上，微米尺度的芯片上，自自动动完成分析全完成分析全过过程。程。生物芯片的类型基因芯片gene chip：又称DNA芯片,是2121第14讲微阵列技术课件2222蛋白蛋白质芯片芯片pp蛋白蛋白质质芯片（芯片（protein chipprotein chip）,又称蛋白又称蛋白质质微微阵阵列，列，是指以蛋白是指以蛋白质质或多或多肽肽作作为为配基配基,将其有序地固定在将其有序地固定在固相固相载载体的表面形成微体的表面形成微阵阵列；用列；用标记标记了了荧荧光的蛋白光的蛋白质质或其它分子与之作用，洗去未或其它分子与之作用，洗去未结结合的成分，合的成分，经荧经荧光光扫扫描等描等检测检测方式方式测测定芯片上各点的定芯片上各点的荧荧光光强强度，来度，来分析蛋白分析蛋白质质之之间间或蛋白或蛋白质质与其它分子之与其它分子之间间的相互作的相互作用关系。用关系。蛋白质芯片蛋白质芯片（protein chip）,又称蛋白2323ppThere are two general There are two general types of protein types of protein microarray:microarray:ppAnalytical protein Analytical protein microarraysmicroarrays involve a involve a high-density array of high-density array of affinity reagents(e.g.affinity reagents(e.g.antibodies or antigens)antibodies or antigens)that are used for that are used for detecting proteins in a detecting proteins in a complex plex mixture.ppFunctional protein chipsFunctional protein chips are constructed by are constructed by immobilizing large immobilizing large numbers of purified numbers of purified proteins on a solid proteins on a solid surface.It has an surface.It has an enormous potential in enormous potential in assaying for a wide range assaying for a wide range of biochemical activities of biochemical activities(protein-protein,(protein-protein,protein-lipid,protein-protein-lipid,protein-nucleic acid,and enzyme-nucleic acid,and enzyme-substrate interactions),substrate interactions),as well as drug and drug as well as drug and drug target identification.target identification.There are two general types of2424组织芯片pp它将数十个甚至上千个不同个体的它将数十个甚至上千个不同个体的组织标组织标本集成在一本集成在一张张固相固相载载体上，体上，为为医学分子生物学提供了一种高通量、医学分子生物学提供了一种高通量、大大样样本以及快速的分本以及快速的分 子水平的分析工具子水平的分析工具pp研究者一次可有效利用成百上千份自然或出于疾病状研究者一次可有效利用成百上千份自然或出于疾病状态态下的下的组织标组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白本来研究特定基因及其所表达的蛋白质质与疾病之与疾病之间间的相关关系的相关关系pp对对于疾病的分于疾病的分 子子诊诊断，断，预预后指后指标标和治和治疗疗靶点的定位，靶点的定位，抗体和抗体和药药物的物的筛选筛选等方面均有十分重要的等方面均有十分重要的实实用价用价值值。组织芯片它将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相2525测序芯片pp任何任何任何任何线线状的状的状的状的单链单链DNADNADNADNA或或或或RNARNARNARNA序列均可被分解序列均可被分解序列均可被分解序列均可被分解为为一个一个一个一个序列固定、序列固定、序列固定、序列固定、错错落而重叠的寡核苷酸，又称落而重叠的寡核苷酸，又称落而重叠的寡核苷酸，又称落而重叠的寡核苷酸，又称亚亚序列序列序列序列（subsequencesubsequencesubsequencesubsequence）。）。）。）。例如例如例如例如 可把寡核苷酸序列可把寡核苷酸序列可把寡核苷酸序列可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATGTTAGCTCATATGTTAGCTCATATGTTAGCTCATATG分解成分解成分解成分解成5 5 5 5个个个个8 nt8 nt8 nt8 nt亚亚序列；序列；序列；序列；这这5 5个个个个亚亚序列依次序列依次序列依次序列依次错错开一个碱基而重叠开一个碱基而重叠开一个碱基而重叠开一个碱基而重叠7 7个碱基。个碱基。个碱基。个碱基。亚亚序列中，序列中，序列中，序列中，A A A A、T T T T、C C C C、G 4G 4G 4G 4个碱基自由个碱基自由个碱基自由个碱基自由组组合而形成的所有可能的序列共有合而形成的所有可能的序列共有合而形成的所有可能的序列共有合而形成的所有可能的序列共有65536655366553665536种。种。种。种。测序芯片任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列2626p人工合成的已知序列的所有可能的人工合成的已知序列的所有可能的人工合成的已知序列的所有可能的人工合成的已知序列的所有可能的ntntntnt寡核苷酸探寡核苷酸探寡核苷酸探寡核苷酸探针针与一个未知的与一个未知的与一个未知的与一个未知的荧荧光光光光标记标记DNA/RNADNA/RNADNA/RNADNA/RNA序列序列序列序列杂杂交，通交，通交，通交，通过过对杂对杂交交交交荧荧光信号光信号光信号光信号检测检测，检检出所有能与靶出所有能与靶出所有能与靶出所有能与靶DNADNADNADNA杂杂交的交的交的交的寡核苷酸，从而推出靶寡核苷酸，从而推出靶寡核苷酸，从而推出靶寡核苷酸，从而推出靶DNADNADNADNA中的所有中的所有中的所有中的所有8 nt8 nt8 nt8 nt亚亚序列，序列，序列，序列，最后由最后由最后由最后由计计算机算机算机算机对对大量大量大量大量荧荧光信号的光信号的光信号的光信号的谱谱型（型（型（型（patternpatternpatternpattern）数据数据数据数据进进行分析，重构靶行分析，重构靶行分析，重构靶行分析，重构靶DNA DNA DNA DNA 的互的互的互的互补补寡核苷酸序列。寡核苷酸序列。寡核苷酸序列。寡核苷酸序列。测序芯片原理序芯片原理人工合成的已知序列的所有可能的nt寡核苷酸探针与一个未知的荧2727测序芯片原理序芯片原理pp芯片芯片测测序的原理是序的原理是杂杂交交测测序方法，即通序方法，即通过过与一与一组组已知序列的核已知序列的核酸探酸探针杂针杂交交进进行核酸序列行核酸序列测测定的方法。如定的方法。如图图在一在一块块基片表面固基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探定了序列已知的八核苷酸的探针针。当溶液中。当溶液中带带有有荧荧光光标记标记的核的核酸序列酸序列TATGCAATCTAGTATGCAATCTAG，与基因芯片上，与基因芯片上对应对应位置的位置的 核酸探核酸探针针产产生互生互补补匹配匹配时时，通，通过过确定确定荧荧光光强强度最度最强强的探的探针针位置，位置，获获得一得一组组序列完全互序列完全互补补的探的探针针序列。据此可重序列。据此可重组组出靶核酸的序列。出靶核酸的序列。测序芯片原理芯片测序的原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序2828ChIP-chipChIP-chip(chromatin immunoprecipitation(chromatin immunoprecipitation(chromatin immunoprecipitation(chromatin immunoprecipitation（ChIP)ChIP)ChIP)ChIP)：在生理状：在生理状：在生理状：在生理状态态下把胞内蛋白下把胞内蛋白下把胞内蛋白下把胞内蛋白质质和和和和DNADNADNADNA甲甲甲甲醛醛作用下交作用下交作用下交作用下交联联在一起，用超声波打碎在一起，用超声波打碎在一起，用超声波打碎在一起，用超声波打碎为为0.2-2 kb0.2-2 kb0.2-2 kb0.2-2 kb的染色体小的染色体小的染色体小的染色体小片段，然后通片段，然后通片段，然后通片段，然后通过过目的蛋白目的蛋白目的蛋白目的蛋白质质特异性抗体沉淀此复合物，特异性抗体沉淀此复合物，特异性抗体沉淀此复合物，特异性抗体沉淀此复合物，获获得特异地作得特异地作得特异地作得特异地作用于目的蛋白用于目的蛋白用于目的蛋白用于目的蛋白结结合的合的合的合的DNADNADNADNA片段，通片段，通片段，通片段，通过对过对目的片段的目的片段的目的片段的目的片段的纯纯化与化与化与化与检测检测，从而，从而，从而，从而获获得蛋白得蛋白得蛋白得蛋白质质与与与与DNADNADNADNA相互作用的信息。相互作用的信息。相互作用的信息。相互作用的信息。ChIP-chipChIP-chipChIP-chipChIP-chip：将共沉淀的：将共沉淀的：将共沉淀的：将共沉淀的 DNADNADNADNA和合适的和合适的和合适的和合适的对对照用照用照用照用荧荧光光光光标记标记，加在，加在，加在，加在载载玻片上，玻片上，玻片上，玻片上，用于芯片分析。使用外源性用于芯片分析。使用外源性用于芯片分析。使用外源性用于芯片分析。使用外源性DNADNADNADNA作作作作为为背景，免疫沉淀背景，免疫沉淀背景，免疫沉淀背景，免疫沉淀DNADNADNADNA与作与作与作与作为为背景的背景的背景的背景的对对照照照照进进行比行比行比行比较较，可以找到特异性蛋白在基因，可以找到特异性蛋白在基因，可以找到特异性蛋白在基因，可以找到特异性蛋白在基因组组中的中的中的中的结结合位点。合位点。合位点。合位点。POI，protein of interestChIP-chip(chromatin immunoprec2929表达谱芯片表达谱芯片pp基因表达基因表达谱谱芯片是采用芯片是采用DNADNA片段作探片段作探针针，固化在芯片上；，固化在芯片上；将待将待测样测样品（品（处处理理组组）与）与对对照照样样品的品的cDNAcDNA以两种不同的以两种不同的荧荧光分子光分子进进行行标记标记，然后同，然后同时时与芯片与芯片进进行行杂杂交，通交，通过过分析分析两种两种样样品与探品与探针杂针杂交的交的荧荧光光强强度的比度的比值值，来，来检测检测基因表达基因表达水平的水平的变变化。化。表达谱芯片基因表达谱芯片是采用DNA片段作探针，固化在芯片上3030单核苷酸多核苷酸多态芯片芯片(SNP-chip)(SNP-chip)What are SNPs?What are SNPs?What are SNPs?What are SNPs?ppSNPs make up 90%of all human genetic variations,1%SNPs make up 90%of all human genetic variations,1%occur every 100 to 300 bases along the human genome,on occur every 100 to 300 bases along the human genome,on average.average.ppSNPs can affect how humans develop diseases,respond to SNPs can affect how humans develop diseases,respond to pathogens,chemicals,drugs,etc.As a consequence SNPs are pathogens,chemicals,drugs,etc.As a consequence SNPs are of great value to biomedical research and in developing of great value to biomedical research and in developing pharmacy products.pharmacy products.ppWe have two alleles:From mom and from dadWe have two alleles:From mom and from dad；Each one is Each one is either A or B,so you can be AA,AB,BBeither A or B,so you can be AA,AB,BBppSNP-chip is used to determine genotype for 1000s SNPs at a SNP-chip is used to determine genotype for 1000s SNPs at a timetime单核苷酸多态芯片(SNP-chip)What are SNP3131单核苷酸多核苷酸多态芯片芯片(SNP-chip)(SNP-chip)The three mandatory components of the SNP arrays are:The three mandatory components of the SNP arrays are:An array containing immobilized allele-specific oligonucleotide An array containing immobilized allele-specific oligonucleotide(ASO)probes.(ASO)probes.SNP-chip has millions of spots,each containing a different single-SNP-chip has millions of spots,each containing a different single-stranded oligonucleotide that contains a site of variation.stranded oligonucleotide that contains a site of variation.（ASO ASO probesprobes，600,000 SNPs for an Affymetrix SNP-chip 600,000 SNPs for an Affymetrix SNP-chip）Each of the probes on each position of the chip corresponds to a Each of the probes on each position of the chip corresponds to a genetic locusgenetic locus For each such site,the four oligonucleotides containing each of the For each such site,the four oligonucleotides containing each of the four possible bases at that site are adjacent to each other on the four possible bases at that site are adjacent to each other on the chipchipFragmented nucleic acid sequences of target,labeled with Fragmented nucleic acid sequences of target,labeled with fluorescent dyes.fluorescent dyes.A detection system that records and interprets the hybridization A detection system that records and interprets the hybridization signal.signal.单核苷酸多态芯片(SNP-chip)The three ma3232单核苷酸多核苷酸多态芯片芯片(SNP-chip)(SNP-chip)hybridization conditionshybridization conditions！单核苷酸多态芯片(SNP-chip)hybridizatio3333第14讲微阵列技术课件3434比比较基因基因组杂交芯片（交芯片（CGH-chipCGH-chip）ppProbeProbe：several thousand evenly spaced cloned DNA several thousand evenly spaced cloned DNA fragments or oligonucleotides,which have been fragments or oligonucleotides,which have been spotted in triplicate on the array.spotted in triplicate on the array.比较基因组杂交芯片（CGH-chip）Probe：sever3535The sample has a duplication.The sample has a duplication.36364.DNA4.DNA芯片芯片进行行实验过程程pp生物学生物学生物学生物学问题问题的提出、探的提出、探的提出、探的提出、探针设计针设计与制与制与制与制备备以及芯片制以及芯片制以及芯片制以及芯片制备备 “根和叶的基因表达有和不同？根和叶的基因表达有和不同？根和叶的基因表达有和不同？根和叶的基因表达有和不同？”把探把探把探把探针针固定于固定于固定于固定于载载体表面体表面体表面体表面pp样样品制品制品制品制备备（核酸提（核酸提（核酸提（核酸提纯纯、扩扩增、增、增、增、标记标记）mRNAmRNAmRNAmRNA分离与富集、探分离与富集、探分离与富集、探分离与富集、探针标记针标记、PCRPCRPCRPCR、微、微、微、微阵阵列点制列点制列点制列点制pp杂杂交反交反交反交反应应（样样本与互本与互本与互本与互补补模板形成双模板形成双模板形成双模板形成双链链）杂杂交、基片交、基片交、基片交、基片处处理、理、理、理、封封封封闭闭、清洗、清洗、清洗、清洗pp结结果探果探果探果探测测（共聚焦（共聚焦（共聚焦（共聚焦扫扫描，双色激光）描，双色激光）描，双色激光）描，双色激光）最常用最常用最常用最常用荧荧光法：光法：光法：光法：选择荧选择荧光通道、激光光通道、激光光通道、激光光通道、激光设设置、生成置、生成置、生成置、生成图图像像像像pp数据数据数据数据处处理和建模（定量理和建模（定量理和建模（定量理和建模（定量软软件，数据件，数据件，数据件，数据库检库检索）索）索）索）数据定量、数据定量、数据定量、数据定量、计计算比率、聚算比率、聚算比率、聚算比率、聚类类分析分析分析分析 4.DNA芯片进行实验过程生物学问题的提出、探针设计与制备3737Steps in a microarray experimentSteps in a microarray experiment Steps in a microarray experime3838芯片制芯片制备 探探针针的的设计设计：根据：根据应应用目的不同，用目的不同，设计设计不同的固定于芯片不同的固定于芯片上的探上的探针针。pp表达型芯片探表达型芯片探针针的的设计设计：不需要知道待：不需要知道待测样测样品中靶基因的精确品中靶基因的精确细节细节；序列的特异性序列的特异性应应放在首要位置（特定区域的几套寡聚核苷酸）放在首要位置（特定区域的几套寡聚核苷酸）pp单单核苷酸多核苷酸多态态性性检测检测芯片探芯片探针针的的设计设计：多多态态性分析、突性分析、突变检测变检测或者或者基因基因测测序序时时，每个核苷酸或突，每个核苷酸或突变变位点都必位点都必须检测须检测出来。出来。等等长长移位移位设计设计法法通常通常设计设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针针在某在某一特点位点的一特点位点的杂杂交交严谨严谨程度，即可程度，即可测测定出定出该该碱基的种碱基的种类类。pp基因表达基因表达检测检测芯片：只需芯片：只需设计设计出出针对针对基因中的即可。基因中的即可。pp特定突特定突变变位点探位点探针针的的设计设计：叠瓦式策略：叠瓦式策略 探探针针的合成的合成原位合成（原位合成（in situ synthesisin situ synthesis）PCR,RT-PCRPCR,RT-PCR（点（点样样法）法）芯片制备 探针的设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于3939Affymetrix GeneChip Affymetrix GeneChip Affymetrix GeneChip 4040基因芯片的合成方法点样芯片：多用于大片段点样芯片：多用于大片段DNADNANatural DNA(PCR Products)Natural DNA(PCR Products)gene expressiongenomic DNA detection光蚀刻原位合成法：适用于寡核苷酸光蚀刻原位合成法：适用于寡核苷酸Artificial DNA(oligonucleotideArtificial DNA(oligonucleotide，30nt30nt左右左右)gene expressionSNP genotypinggene mutationgene mutationon-chip on-chip SynthesisSynthesis（in situ synthesisin situ synthesis）spottingspotting基因芯片的合成方法点样芯片：多用于大片段DNA光蚀刻原位合成4141光光蚀刻原位合成法原理刻原位合成法原理pp是在是在是在是在经过处经过处理的理的理的理的载载玻片表面玻片表面玻片表面玻片表面铺铺上一上一上一上一层连层连接分子接分子接分子接分子（linkerlinker），其），其），其），其羟羟基上加有光敏保基上加有光敏保基上加有光敏保基上加有光敏保护护基基基基团团，可用光照除，可用光照除，可用光照除，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（去，用特制的光刻掩膜（去，用特制的光刻掩膜（去，用特制的光刻掩膜（photolithographic maskphotolithographic mask）保）保）保）保护护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除除除除羟羟基上的保基上的保基上的保基上的保护护基基基基团团，游离，游离，游离，游离羟羟基，利用化学反基，利用化学反基，利用化学反基，利用化学反应应加上第加上第加上第加上第一个核苷酸，所加核苷酸种一个核苷酸，所加核苷酸种一个核苷酸，所加核苷酸种一个核苷酸，所加核苷酸种类类及在芯片上的部位及在芯片上的部位及在芯片上的部位及在芯片上的部位预预先先先先设设定，所引入的核苷酸定，所引入的核苷酸定，所引入的核苷酸定，所引入的核苷酸带带有光敏保有光敏保有光敏保有光敏保护护基基基基团团，以便下一步合，以便下一步合，以便下一步合，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而成第一位核苷酸的合成，因而成第一位核苷酸的合成，因而成第一位核苷酸的合成，因而N N个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸长长的芯片需要的芯片需要的芯片需要的芯片需要4N4N个步个步个步个步骤骤。每一个独特序列的探。每一个独特序列的探。每一个独特序列的探。每一个独特序列的探针针称称称称为为一个一个一个一个“feature”feature”，这样这样的芯片便具有的芯片便具有的芯片便具有的芯片便具有4N4N个个个个“feature”feature”，包，包，包，包含了全部含了全部含了全部含了全部长长度度度度为为N N的核苷酸序列。的核苷酸序列。的核苷酸序列。的核苷酸序列。光蚀刻原位合成法原理是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子4242原位光刻合成基因芯片原理光源光源遮蔽板遮蔽板芯片芯片原位光刻合成基因芯片原理光源遮蔽板芯片4343array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGA Mask 1AAAAA光蚀刻原位合成法实例光蚀刻原位合成法实例array probesA 33 arrayCGACGAC4444array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGC Mask 2CCCCCCAAAAA光蚀刻原位合成法实例光蚀刻原位合成法实例array probesA 33 arrayCGACGAC4545A 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCG Mask 3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC光蚀刻原位合成法实例光蚀刻原位合成法实例完成的芯片完成的芯片Nucleotide Deposition Sequence ACGA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCG 4646光光蚀刻原位合成特征刻原位合成特征p密集程度高密集程度高p可合成任意序列的寡聚核苷酸可合成任意序列的寡聚核苷酸p特异性特异性较较差差p寡聚核苷酸合成寡聚核苷酸合成长长度有限，度有限，约约20-2520-25个核苷个核苷酸碱基。随酸碱基。随长长度增加，合成度增加，合成错误错误率增高率增高p成本成本较较高，高，设计设计和制造和制造较烦琐费时较烦琐费时p常用于基因常用于基因类类型的分析，如突型的分析，如突变变、正常、正常变变异异（多（多态态性）性）光蚀刻原位合成特征密集程度高4747点样p预预先合成好的探先合成好的探先合成好的探先合成好的探针针通通通通过类过类似于似于似于似于喷喷墨打印机墨打印机墨打印机墨打印机的技的技的技的技术喷术喷射到玻璃基射到玻璃基射到玻璃基射到玻璃基片表面，或者用片表面，或者用片表面，或者用片表面，或者用针头针头点在片基上。点在片基上。点在片基上。点在片基上。p全部或部分全部或部分全部或部分全部或部分cDNAcDNAcDNAcDNA：约约500500500500 5000500050005000个核苷酸碱个核苷酸碱个核苷酸碱个核苷酸碱基，通常用于两种或基，通常用于两种或基，通常用于两种或基，通常用于两种或以上以上以上以上样样本的相关基因本的相关基因本的相关基因本的相关基因表达分析。表达分析。表达分析。表达分析。点样预先合成好的探针通过类似于喷墨打印机的技术喷射到玻璃基片4848点样仪点样仪4949 核酸提核酸提核酸提核酸提纯纯（mRNAmRNAmRNAmRNA分离）与富集（分离）与富集（分离）与富集（分离）与富集（PCRPCRPCRPCR）p根据根据根据根据样样品来源、基因含量及品来源、基因含量及品来源、基因含量及品来源、基因含量及检测检测方法和分析目的方法和分析目的方法和分析目的方法和分析目的不同，采用的基因分离、不同，采用的基因分离、不同，采用的基因分离、不同，采用的基因分离、扩扩增及增及增及增及标记标记方法各异。方法各异。方法各异。方法各异。当然，常当然，常当然，常当然，常规规的基因分离、的基因分离、的基因分离、的基因分离、扩扩增及增及增及增及标记标记技技技技术术完全可完全可完全可完全可以采用，但操作繁以采用，但操作繁以采用，但操作繁以采用，但操作繁琐琐且且且且费时费时。高度集成的微型。高度集成的微型。高度集成的微型。高度集成的微型样样品品品品处处理系理系理系理系统统如如如如细细胞分离芯片及基因胞分离芯片及基因胞分离芯片及基因胞分离芯片及基因扩扩增芯片等是增芯片等是增芯片等是增芯片等是实现实现上述目的的有效手段和上述目的的有效手段和上述目的的有效手段和上述目的的有效手段和发发展方向。展方向。展方向。展方向。样品制备样品制备样品制备5050cDNA cDNA cDNA cDNA“A A A A”Cy5Cy5 labeledlabeledcDNA cDNA cDNA cDNA“B B B B”Cy3Cy3Cy3Cy3 labeledlabeledHybridizationHybridizationHybridizationHybridizationScanningScanningScanningScanningLaser 1 Laser 2Laser 1 Laser 2+AnalysisAnalysisAnalysisAnalysisImage CaptureImage CaptureImage CaptureImage Capture样品标记为为了了获获得基因的得基因的杂杂交信号必交信号必须对须对目的基因目的基因进进行行标记标记，目前采用的最普遍的，目前采用的最普遍的荧荧光光标记标记方法。方法。cDNA“A”cDNA“B”HybridizationS5151 v表达表达表达表达检测检测需要需要需要需要长长的的的的杂杂交交交交时间时间，更高的，更高的，更高的，更高的严谨严谨性，更性，更性，更性，更高的高的高的高的样样品品品品浓浓度和低温度，度和低温度，度和低温度，度和低温度，这这有利于增加有利于增加有利于增加有利于增加检测检测的特的特的特的特异性和低拷异性和低拷异性和低拷异性和低拷贝贝基因基因基因基因检测检测的灵敏度。的灵敏度。的灵敏度。的灵敏度。v突突突突变检测变检测，要，要，要，要鉴别鉴别出出出出单单碱基碱基碱基碱基错错配，需要更高的配，需要更高的配，需要更高的配，需要更高的杂杂交交交交严谨严谨性和更短的性和更短的性和更短的性和更短的时间时间！杂交杂交 杂交5252A A yellowyellowyellowyellow spot a gene spot a gene that hybridized to both that hybridized to both greengreen and and redred cDNA:cDNA:expressed both in healthy expressed both in healthy cells and cancer cells!cells and cancer cells!检测pp用用用用计计算机控制的高分辨算机控制的高分辨算机控制的高分辨算机控制的高分辨荧荧光光光光扫扫描描描描仪仪可可可可获获得得得得结结合于芯片上目合于芯片上目合于芯片上目合于芯片上目的基因的的基因的的基因的的基因的荧荧光信号，通光信号，通光信号，通光信号，通过计过计算机算机算机算机处处理即可理即可理即可理即可给给出目的基因的出目的基因的出目的基因的出目的基因的结结构或表达信息。构或表达信息。构或表达信息。构或表达信息。A yellow spot a gene that hy5353生物芯片生物芯片检测原理原理pp杂杂交信号的交信号的检测检测是是DNADNA芯片技芯片技术术中的重要中的重要组组成部分。成部分。pp由于由于DNADNA芯片本身的芯片本身的结结构及性构及性质质，需要确定，需要确定杂杂交信号在芯交信号在芯片上的位置，尤其是大片上的位置，尤其是大规规模模DNADNA芯片由于其面芯片由于其面积积小，密度小，密度大，点大，点样样量很少，所以量很少，所以杂杂交信号交信号较较弱，需要使用光弱，需要使用光电电倍增倍增管或冷却的管或冷却的电电荷偶荷偶连连照相机照相机(charged-coupled device(charged-coupled device cameracamera，CCD)CCD)摄摄像机像机等弱光信号探等弱光信号探测测装置。装置。pp此外，大多数此外，大多数DNADNA芯片芯片杂杂交信号交信号谱谱型除了分布位点以外型除了分布位点以外还还需要确定每一点上的信号需要确定每一点上的信号强强度，以确定是完全度，以确定是完全杂杂交交还还是不是不完全完全杂杂交，因而探交，因而探测测方法的灵敏度及方法的灵敏度及线线性响性响应应也是非常重也是非常重要的。要的。pp杂杂交信号探交信号探测测系系统统主要包括主要包括杂杂交信号交信号产产生、信号收集及生、信号收集及传传输输和信号和信号处处理及成像理及成像三个部分三个部分组组成。成。生物芯片检测原理杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部5454荧光标记杂交信号的检测方法荧光标记杂交信号的检测方法生物素标记方法中的杂交信号探测生物素标记方法中的杂交信号探测荧光标记杂交信号的检测方法5555荧光标记杂交信号的检测方法荧光标记杂交信号的检测方法激光扫描荧光显微镜激光扫描荧光显微镜:将杂交后的芯片经处理后固定在计算机将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5 510m10m。同时通过同。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台传动平台X XY Y方向上步进平移，方向上步进平移，DNADNA芯片被逐点照射，所采集芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20m20m象素的图像。象素的