流式细胞仪培训课件_002

主要内容主要内容 流式流式细胞胞仪概述概述 流式流式细胞胞仪的工作原理的工作原理 流式流式细胞胞仪的的应用用 检测的一般步的一般步骤.一、流式一、流式细胞胞仪概述概述 .BD FACSVantageBD-Calibur Epics Altra.Epics Altra Beckman Coulter.利用流式利用流式细胞胞仪通通过检测荧光信号来光信号来检测细胞或其它胞或其它颗粒性物粒性物质（表面或胞（表面或胞浆或胞或胞核）的物理、化学特性并通核）的物理、化学特性并通过这些特性些特性对细胞或胞或颗粒粒进行定量。行定量。u 检测表面表面标记物物u 检测胞胞浆标记物物u 检测胞核内胞核内标记物物u 检测可溶性蛋白可溶性蛋白流式流式细胞胞术（FLOW CYTOMETRY）.流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可以揭示细胞内部结构信息特殊的特殊的显微微镜.高速高速测定定细胞，大胞，大样本本计数数 检测稀有稀有细胞胞 多参数分析多参数分析 自自动化化 细胞分胞分选流式流式细胞胞仪的主要特点的主要特点.二、流式二、流式细胞胞仪工作原理工作原理 .流式流式细胞胞仪工作原理工作原理流式流式细胞胞仪通常以激光作通常以激光作为激激发光源，光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被品流上，被荧光染色的光染色的细胞在激光束的照射下胞在激光束的照射下产生散射生散射光和激光和激发荧光。光。这两种信号被光两种信号被光电二极管和二极管和光光电倍增管接收，之后倍增管接收，之后转换为电信号，再通信号，再通过模模/数数转换器，将器，将连续的的电信号信号转换为可被可被计算机算机识别的数字信号，最后由的数字信号，最后由计算机算机进行行计算算处理。理。.仪器基本器基本组成成流路流路流流动室室 鞘液鞘液SHEATH SHEATH 样本流本流SAMPLE SAMPLE 单细胞胞悬液液5 5 10105 5-1-1 10106 6个个/ml/ml光路光路光源光源滤片片光光电倍增管倍增管PMT HVPMT HV电路路放大放大电路路HVHV及及GAIN GAIN 增益增益A/DA/D转换统计 计算机算机.流路流路Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid流流动室室.流式流式细胞胞仪光路光路图Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1(FITC)575BP FL2(PE)620BP FL3(ECD)675BP FL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流流动室室.激光配置激光配置488nm氩离子激光器离子激光器633nm氦氦氖激光器激光器大功率水冷紫外激光器大功率水冷紫外激光器.光路光路光路光路-滤滤滤滤片特性片特性片特性片特性l长长通通滤滤片片 允允许长许长于于设设定波定波长长的光通的光通过过l 短通短通滤滤片片 允允许许短于短于设设定波定波长长的光通的光通过过l 带带通通滤滤片片 允允许许一定一定带宽带宽的波的波长长通通过过l当以当以 4545o o 角角放置放置滤滤片片时时,该滤该滤片可以通片可以通过过一定波一定波长长的光的光,同同时时也可以阻断并折射也可以阻断并折射该该波波长长以下的光以下的光 ，这这种方式的种方式的滤滤片称片称为为二向色性二向色性滤滤片片(dichroic filter)dichroic filter)630 nm BandPass FilterWhite Light Source.光信号收集光信号收集 光信号分离，光信号分离，导向，各探向，各探测通道通道PMTPMT接收并接收并转化化为电信号。信号。二色二色镜 1 2 3带通通滤波片波片光光电倍增管倍增管激光束激光束细胞胞收集透收集透镜前前向向散散射射光光侧向散射光，向散射光，荧光光.数据数据处理理FSC SSC FL1 FL2 FL3对数数 线性性 线性性 线性性 对数数脉冲处理，模数转换光信号光信号电信号信号记录数据，数据，显示示结果果（面（面积，峰高，峰高，宽度）度）.颗粒度粒度细胞大小胞大小流式细胞仪产生的信号非非荧光信号光信号.FL1 FITC,GFP(PMT2)FL2 PE(PMT3)FL3 ECD,PI(PMT4)FL4 PC5,APC(PMT5)荧光信号光信号.u细胞表面的抗原胞表面的抗原(或或细胞膜受体胞膜受体)与相关的与相关的荧光抗体光抗体结合，形成合，形成带有有荧光的抗原抗体光的抗原抗体复合物。复合物。u通通过流式流式细胞胞仪测定其定其荧光量，即可得到光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。胞群的不同抗原位点表达情况。原原理理.488nm488nm空冷激光空冷激光 ：FITCFITC、PEPE、ECDECD、PC5PC5、PIPI、7AAD7AAD、PerCP PerCP、EGFP EGFP、EYFP EYFP、AO AO、TO TO、Fluo3Fluo3633nm633nm空冷激光：空冷激光：APCAPC、APC-CY7 APC-CY7、CY5 CY5 90-490-4水冷激光：水冷激光：UVUV（333-364nm333-364nm）HOECHST 33342HOECHST 33342、DAPI DAPI .三、流式三、流式细胞胞仪应用用 .流式流式细胞胞仪应用用 淋巴淋巴细胞免疫功能胞免疫功能测定定 干干细胞研究胞研究 细胞增殖与凋亡胞增殖与凋亡检测 细胞周期及倍体分析胞周期及倍体分析 细胞活性分析胞活性分析 细胞分胞分选.淋巴淋巴细胞胞亚群群活化的活化的T淋巴淋巴细胞胞抗原特异性免疫抗原特异性免疫细胞胞调控性控性T细胞胞树突状突状细胞胞先天免疫先天免疫细胞胞细胞免疫功能胞免疫功能测定定.细胞群胞群 CDCD抗原抗原 T T细胞胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B B细胞胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系髓系细胞胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK NK细胞胞 CD16 CD56 CD57 CD94CD16 CD56 CD57 CD94 血小板血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-fCD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 内皮内皮细胞胞 CD105 CD106 CD109CD105 CD106 CD109 细胞因子受体胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126CD25 CD115 CD117 CD122 CD126CDCD抗原及其相关抗原及其相关细胞群胞群.淋巴淋巴细胞胞亚群数量群数量检查项目和意目和意义疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病自身免疫病降低降低增高增高降低降低降低降低AIDS降低降低严重降重降低低增高增高降低降低SARS降低降低降低降低降低降低降低降低降低降低慢性活慢性活动性肝性肝炎、肝硬化炎、肝硬化降低降低正常或正常或增高增高降低降低降低降低肿瘤瘤降低降低降低降低增高增高降低降低降低降低.用用荧光光标记抗体抗体抗体特异性地抗体特异性地结合合细胞上胞上对应的抗原的抗原表达表达该抗原的抗原的细胞被胞被标记上上荧光；光；抗原表达多的抗原表达多的细胞胞荧光光强度度强阳性阳性细胞百分胞百分比或比或浓度度靶蛋白靶蛋白浓度度.淋巴淋巴细胞胞CDCD抗原的流式抗原的流式细胞胞检测.造血系造血系统干干细胞胞肿瘤干瘤干细胞胞间充充质干干细胞胞神神经干干细胞胞脂肪干脂肪干细胞胞干干细胞研究胞研究.热门研究研究(肿瘤瘤)干干细胞胞l肿瘤瘤组织无限制的增殖在于无限制的增殖在于肿瘤干瘤干细胞的存在胞的存在l目前研究的目前研究的肿瘤干瘤干细胞来源于前列腺、乳腺等胞来源于前列腺、乳腺等肿瘤瘤l肿瘤干瘤干细胞数量稀少，常胞数量稀少，常规方法很方法很难检测l目前研究目前研究发现，肿瘤干瘤干细胞和正常胞和正常细胞在胞在HOECHEST HOECHEST 3334233342染料染料摄取方面有重大差取方面有重大差别l故流式故流式细胞胞仪是分析和是分析和检测肿瘤干瘤干细胞的重要工具胞的重要工具.干干细胞能表达胞能表达ABCG2ABCG2泵蛋白，在蛋白，在HOECHST 33342HOECHST 33342染染色色时能将能将该染料染料泵出，因此分析不能被出，因此分析不能被该染料染染料染色的色的细胞群胞群时可以可以发现一群不能染色的一群不能染色的细胞既是胞既是干干细胞，因此能胞，因此能够在众多在众多肿瘤瘤细胞中区分出胞中区分出肿瘤瘤干干细胞。胞。肿瘤干瘤干细胞中的研究胞中的研究应用用-Hoechst 33342 side population.HoechstHoechst+Vera.Side Population Cells.细胞凋亡研究1.鉴别凋亡与坏死凋亡与坏死:Annexin/PI2.测定凋亡率定凋亡率:Annexin、Apo 27、TUNEL3.研究凋亡触研究凋亡触发机制：机制：Caspase、Fas及及FasL bcl-2/bax4.多参数多参数分析凋亡是分析凋亡是趋势.G1S phaseG2MG112 1DNA含量含量 DNA 含量含量细胞周期胞周期时相相G0/1G2/MS细胞数胞数细胞周期分析胞周期分析.PIEthidium BromideAcridine OrangeDAPI(UV excitable)Hoechst 33342(viable,UV excitable)不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的常用的DNA 染料染料.DNA含量及含量及细胞周期分析胞周期分析 细胞周期分析胞周期分析:在在细胞周期胞周期(G0(G0，G1G1，S S，G2 G2，M)M)的各个的各个时期，期，DNADNA的含量随各的含量随各时相呈相呈现出周期性的出周期性的变化。通化。通过核酸染料核酸染料标记DNADNA，并由流式，并由流式细胞胞仪进行分行分析，可以得到析，可以得到细胞各个胞各个时期的分布状期的分布状态，计算出算出G0/G1%G0/G1%，S%S%及及G2/M%G2/M%。了解。了解细胞的周期分布及胞的周期分布及细胞的胞的增殖活性。也可利用增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（胞周期蛋白（CYCLINCYCLIN）、）、Ki67Ki67、核增殖抗原（、核增殖抗原（PCNAPCNA）等，）等，对细胞周期胞周期进行精行精确的分期：确的分期：G0G0、G1G1、S S、G2G2、M.M.G0/G1SG2/M.流式流式细胞胞仪分分选u电荷式分荷式分选是当前的主流分是当前的主流分选模式模式u高速分高速分选是保是保证结果的基本条件果的基本条件u高高纯度和高活性是分度和高活性是分选的基本要求的基本要求u可可选的激光要多的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同化（空冷、水冷、固体；不同的波的波长；真正的紫外）；真正的紫外）u提供多种分提供多种分选流流动室室u光路光路稳定，紫外激光功率大定，紫外激光功率大u流式分流式分选和磁珠分和磁珠分选的差的差别和和联系系.488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector电荷式荷式细胞分胞分选.细胞分胞分选的主要技的主要技术指指标 分分选速度：速度：25000个个细胞胞/秒秒 分分选纯度：度：98%分分选后后细胞存活率：胞存活率：97%.Before SortingAfter Sorting.三、流式三、流式细胞胞仪检测的的一般步一般步骤 .设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果检测的一般步的一般步骤.电压调节利用同型利用同型对照：照：设置背景置背景l电压 voltsl增益增益 Gain设定阴性和阳性信号定阴性和阳性信号强度的度的临界点界点.荧光补偿 Need to do when we measure signals from more than 1 fluorescence.FITC520BPPE575BP.4 Color Single Laser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5.补 偿PEFITCPE+cellsFITC+cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+cells,=PE signal -%FITC signalFor Pure PE+cells,=FITC signal-%PE signalAfter compensationPEFITCPE+cellsFITC+cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell=the Y-mean of -/-cellsX-mean of the PE cell=the X-mean of-/-cellsPEFITCPE+cellsFITC+cellsOVER compensation.淋巴细胞单核细胞中性粒细胞如如何何看看流流式式图.PIPIAnnexinAnnexinV V细胞凋亡胞凋亡检测PIAnnexin-V.G0/G1SG2/M.