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LOGOLOGO生化制药技术基础生化制药技术基础第一课件网()2020/10/182020/10/181 1第一节第一节 概述概述v生化制药技术就是在保持原来的结构和功能的前生化制药技术就是在保持原来的结构和功能的前提下，把生物体内的生化基本物质从含有多种物提下，把生物体内的生化基本物质从含有多种物质的液相或固相中，较高纯度地分离出来。质的液相或固相中，较高纯度地分离出来。2020/10/182 2 一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段：一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段：1.1.原料的选择和预处理原料的选择和预处理 2.2.原料的粉碎；原料的粉碎；3.3.提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品 的工艺过程；的工艺过程；4.4.纯纯化化，即即粗粗制制品品经经盐盐析析、有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀、吸吸附附、层层析析、透透析析、超超离离心心、膜膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程；分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程；5.5.干燥及保存；干燥及保存；6.6.成品及制剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻成品及制剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。2020/10/183 3 利利用用生生化化制制备备技技术术从从生生物物材材料料中中获获得得特特殊殊的的生生物物活活性性物物质质，如如蛋蛋白白质质、酶酶、激激素素、核核酸酸等等生生化化产产品品时时，通通常常要要注注意意以下几个问题：以下几个问题：1 1生生物物材材料料的的组组成成成成分分非非常常复复杂杂，而而且且这这些些化化合合物物在在分分离离时时仍仍在在不不断断的的代谢变化中。代谢变化中。2 2在在生生物物材材料料中中，有有些些化化合合物物含含量量很很低低或或极极微微，有有的的只只有有1 1l0000l0000，甚甚至更少至更少。“虎头蛇尾虎头蛇尾”“”“钓鱼法钓鱼法”3 3许多生物活性物质，一旦离开了生物体内环境，很易变性及被破坏许多生物活性物质，一旦离开了生物体内环境，很易变性及被破坏4 4生生化化产产品品制制备备过过程程几几乎乎都都在在溶溶液液中中进进行行，各各种种温温度度、pHpH、离离子子强强度度等等参参数数，对对溶溶液液中中各各种种组组成成的的综综合合影影响响，常常常常无无法法固固定定，有有些些实实验验或或工工艺艺的的设计理论性不强，常带有很大的经验成分。设计理论性不强，常带有很大的经验成分。5 5生化制备方法最后生化制备方法最后均一性均一性的证明与化学上的证明与化学上纯度纯度的概念并不完全相同的概念并不完全相同 2020/10/184 4第二节第二节 原料选择和预处理原料选择和预处理一、生物材料的来源一、生物材料的来源（一）植物来源（一）植物来源 从植物资源中寻找大分子有效物质从植物资源中寻找大分子有效物质（二）动物脏器（二）动物脏器脑（脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、神经肽等）脑（脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、神经肽等）脑垂体（各种激素）脑垂体（各种激素）肺肺肝脏（维生素、磷脂类、胆固醇）肝脏（维生素、磷脂类、胆固醇）脾脏（免疫器官）脾脏（免疫器官）胃肠及粘膜（胃蛋白酶、胶原蛋白酶、胃泌素、胃膜素、糖蛋白、核苷酸酶、胃肠及粘膜（胃蛋白酶、胶原蛋白酶、胃泌素、胃膜素、糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃肠道激素）溶菌酶、胃肠道激素）心脏（细胞色素心脏（细胞色素C C、辅酶、辅酶Q Q1010）胰脏（激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）胰脏（激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）血液：人血制剂、抗凝血酶血液：人血制剂、抗凝血酶，凝血因子，凝血因子，纤维蛋白原，免疫球蛋白、人，纤维蛋白原，免疫球蛋白、人血浆、干扰素、白介素等。血浆、干扰素、白介素等。胆汁：胆汁：其它：尿液、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生长因子、其它：尿液、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生长因子、HCGHCG2020/10/185 5（三）微生物来源（三）微生物来源1.1.细菌细菌常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：（1 1）氨基酸）氨基酸 利用微生物酶可转化对应的利用微生物酶可转化对应的酮酸或羟基酸作用酮酸或羟基酸作用产生氨基酸。产生氨基酸。（2 2）有机酸）有机酸 柠檬酸、苹果酸、乳酸柠檬酸、苹果酸、乳酸 （3 3）糖类）糖类 利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。糖、脂多糖。（4 4）核苷酸类）核苷酸类 用细菌可生产用细菌可生产55AMPAMP，55肌苷酸肌苷酸（5 5）维生素）维生素 VB VB1 1,VB,VB2 2，VBVB6 6,Vc,Vc（6 6）酶）酶 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶2020/10/186 62.2.放线菌放线菌 放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有10001000多种抗生素约多种抗生素约2/32/3产自放产自放线菌。线菌。（1 1）氨基酸）氨基酸 发酵法发酵法（2 2）核苷酸）核苷酸 5-5-脱氧肌苷酸脱氧肌苷酸（3 3）维生素）维生素（4)4)酶酶3.3.真菌真菌 （1)1)酶酶（2 2）有机酸）有机酸（3 3）氨基酸）氨基酸（4 4）核酸及有关物质）核酸及有关物质（5 5）维生素）维生素（6)6)促生素促生素（7 7）多糖）多糖4.4.酵母菌酵母菌（1 1）维生素）维生素（2 2）蛋白质与多肽）蛋白质与多肽（3 3）核酸）核酸第一课件网()2020/10/187 7（四）海洋生物（四）海洋生物（1 1）海藻）海藻 （2 2）腔肠动物）腔肠动物 海葵毒素海葵毒素（3 3）节肢动物）节肢动物 甲壳素甲壳素（4)4)软体动物软体动物 多糖、多肽、毒素多糖、多肽、毒素（5 5）棘皮动物）棘皮动物 海星、海胆、海参海星、海胆、海参 海参素抗癌海参素抗癌（6 6）鱼类）鱼类 鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素（7 7）爬行动物）爬行动物 龟龟 滋阴养肾滋阴养肾 抗肿瘤抗肿瘤（8 8）海洋哺乳动物）海洋哺乳动物 鲸鱼鱼肝油鲸鱼鱼肝油2020/10/188 8（五）开发生物新资源（五）开发生物新资源（1 1）生物资源的综合利用）生物资源的综合利用 动植物细胞的大规模动植物细胞的大规模培养培养（2 2）开发新生物资源）开发新生物资源（3 3）应用基因工程技术建立工程菌或工程细胞）应用基因工程技术建立工程菌或工程细胞2020/10/189 9二、生物活性物质的存在方式二、生物活性物质的存在方式（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能 根据生物活性物质的生物功能推断其存在部分和分布方式。生根据生物活性物质的生物功能推断其存在部分和分布方式。生物活性物质分为胞内与胞外两种存在部位。物活性物质分为胞内与胞外两种存在部位。（二）生物分子间的作用力（二）生物分子间的作用力三、生物活性物质的存在特点三、生物活性物质的存在特点（一）生物材料组成的复杂性（一）生物材料组成的复杂性（二）生物活性物质存在地特点（二）生物活性物质存在地特点 生物活性物质在生物材料中含量较低，杂质含量很高，而且生物活性物质在生物材料中含量较低，杂质含量很高，而且生理活性愈高，含量愈低。生理活性愈高，含量愈低。生物材料中的生化组成数量大，种类多，分离纯化比较困难。生物材料中的生化组成数量大，种类多，分离纯化比较困难。2020/10/181010第二节第二节 原料选择和预处理原料选择和预处理四、选什么样的原材料应视生产目的而定。一般要注意以下几四、选什么样的原材料应视生产目的而定。一般要注意以下几个方面个方面:1 1要选择有效成分含量高的新鲜材料；要选择有效成分含量高的新鲜材料；2 2来源丰富易得；来源丰富易得；3 3制造工艺简单易行；制造工艺简单易行；4 4成本比较低；成本比较低；5 5经济效果要好。经济效果要好。2020/10/181111如蛋白质原料的选择 蛋白质类生化产品的原料来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。2020/10/181212 对天然蛋白质生化产品，为提高其质对天然蛋白质生化产品，为提高其质量、产量和降低生产成本，对原料的量、产量和降低生产成本，对原料的种属、种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求，都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作事半功倍，反了解这些，可使分离纯化工作事半功倍，反之则收效甚微之则收效甚微。2020/10/1813131 1种属种属 牛牛胰胰含含胰胰岛岛素素（isulin)isulin)单单位位比比猪猪胰胰高高，牛牛为为4000 4000 IUIUkgkg胰胰脏脏，猪猪为为3000 3000 IUIUkgkg胰胰脏脏。抗抗原原性性则则猪猪胰胰岛岛素素比比牛牛胰胰岛岛素素低低，前前者者与与人人胰胰岛岛素素相相比比，只只有有1 1个个氨氨基基酸酸的的差差异异，而而牛牛有有3 3个个氨氨基基酸的差异。酸的差异。2020/10/1814142 2发育生长阶段发育生长阶段 幼幼年年动动物物的的胸胸腺腺比比较较发发达达，老老龄龄后后逐逐渐渐萎萎缩缩，因因此此胸胸腺腺原原料料必须采自幼龄动物。必须采自幼龄动物。2020/10/1815153 3生物状态生物状态 动动物物饱饱食食后后宰宰杀杀，胰胰脏脏中中的的胰胰岛岛素素含含量量增增加加，对对提提取取胰胰岛岛素素有有利利，但但胆胆囊囊收收缩缩素素的的分分泌泌使使胆胆汁汁排排空空，对对胆胆汁汁的的收收集集不不利利。严严重重再再生生障障碍碍性性贫贫血血症症患患者者尿尿中中的的EPOEPO（erythropoietin,erythropoietin,红红细细胞胞生生成成素素）含含量增加。量增加。2020/10/181616 4 4原料来源原料来源 血管舒缓素可分别从血管舒缓素可分别从猪胰脏猪胰脏和和猪猪颚下腺颚下腺中提取，两者生物学功能并无二致，中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。白水解酶。2020/10/181717 5 5原料解剖学部位原料解剖学部位 猪猪胰胰脏脏中中，胰胰尾尾部部分分含含激激素素较较多多，而而胰胰头头部部分分含含消消化化酶酶较较多多。如如分分别别摘摘取取则则可可提提高各产品的收率。高各产品的收率。胃胃膜膜素素以以采采取取全全胃胃粘粘膜膜为为好好，胃胃蛋蛋白白酶酶(pepsin)(pepsin)则则以以采采取取胃胃底底部部粘粘膜膜为为好好，因因胃胃底底部部粘膜富含消化酶。粘膜富含消化酶。2020/10/1818186.6.从简化提纯步骤着手从简化提纯步骤着手 如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将动如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以简化纯物饥饿后取材，可减少肝糖原，以简化纯化步骤。化步骤。第一课件网()2020/10/1819197 7对生物技术产品宿主菌或细胞的要求对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。如用考虑到后处理的问题。如用大肠杆菌大肠杆菌表达，由于表达，由于其不能将所表达的蛋白质分泌到体外，故提取时其不能将所表达的蛋白质分泌到体外，故提取时必须破壁，增加了提取的困难，而且还可能含有必须破壁，增加了提取的困难，而且还可能含有毒素类有害因子；用毒素类有害因子；用枯草杆菌枯草杆菌或或酵母菌酵母菌作宿主菌，作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷；用乏糖基化等翻译及修饰的缺陷；用动物细胞和昆动物细胞和昆虫细胞虫细胞表达则能比较好地解决后处理及完整表达表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。的问题。用用肿肿瘤瘤细细胞胞作作宿宿主主细细胞胞制制成成的的生生化化产产品品还还应应考考虑虑到到其其安安全全性性，制制造造体体外外诊诊断断用用试试剂剂则则是是很很好好的高产方法。的高产方法。2020/10/182020五、生物材料的准备五、生物材料的准备 生物材料的制造主要包括以下工艺过程：生物材料的制造主要包括以下工艺过程：1)1)生物材料的选取与预处理；生物材料的选取与预处理；2)2)从生物材料中提取有效活性物质；从生物材料中提取有效活性物质；3)3)有效成分的分离，纯化有效成分的分离，纯化4)4)后处理及制剂后处理及制剂（一）生物材料的选取（一）生物材料的选取1.1.有效成分的含量有效成分的含量（1 1）生物品种）生物品种 根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。（催乳素，哺乳动物）是选材的关键。（催乳素，哺乳动物）2020/10/182121（2 2）合适的组织器官）合适的组织器官 （胃蛋白酶，胃）（胃蛋白酶，胃）（3 3）生物的生长期）生物的生长期 生物的生长期对生理活性物质含量影响很大。生物的生长期对生理活性物质含量影响很大。2.2.杂质情况杂质情况 难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。济效益。3.3.来源来源 应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。多用，综合利用。胰脏胰脏 制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。2020/10/182222（二）生物材料的采集与保存（二）生物材料的采集与保存 生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降。要立即速冻，防止胰岛素活力下降。保存生物材料的主要方法有速冻、冻干、有机保存生物材料的主要方法有速冻、冻干、有机溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮与甘油中等。溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮与甘油中等。（三）动物细胞的培养与保存（三）动物细胞的培养与保存v动物细胞的培养常采用生物反应器和动、植物活体培养，动物细胞的培养常采用生物反应器和动、植物活体培养，在干细胞工程和疫苗生产中广泛应用。在干细胞工程和疫苗生产中广泛应用。（四）微生物菌种的选育与保存（四）微生物菌种的选育与保存1.1.菌种的分离菌种的分离 微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产各微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产各种生物药物的主要材料。种生物药物的主要材料。2020/10/182323（1 1）含菌样品的收集）含菌样品的收集 根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需要菌种，如到堆根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需要菌种，如到堆积和腐烂纤维素的地方去取样分离纤维素酶产生菌。到温泉附近取样分积和腐烂纤维素的地方去取样分离纤维素酶产生菌。到温泉附近取样分离高温蛋白酶产生菌。离高温蛋白酶产生菌。一般可以从土壤中分离所需微生物，取样时先将表土刮去一般可以从土壤中分离所需微生物，取样时先将表土刮去2-3cm2-3cm，在同一条，在同一条件下选好件下选好2-52-5点土样混在一起包好，表明采样地点及日期备用。点土样混在一起包好，表明采样地点及日期备用。（2 2）富集培养）富集培养收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。如含所需要的菌很少，收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。如含所需要的菌很少，就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利于筛选。再配合控就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利于筛选。再配合控制温度，制温度，pHpH或营养成分即可达到目的。有时用能分解的底物作为生长和或营养成分即可达到目的。有时用能分解的底物作为生长和诱导产生所须成分的培养基成分，以使所需要的菌种得到快速生长，有诱导产生所须成分的培养基成分，以使所需要的菌种得到快速生长，有利于进一步分离。利于进一步分离。（3 3）菌种纯化）菌种纯化 在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生活，所以要进行分离，以在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生活，所以要进行分离，以获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离或划线分离法。获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离或划线分离法。2020/10/1824242.2.菌种的筛选菌种的筛选（1 1）筛选对象的选择）筛选对象的选择 筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。如有报道，则根据筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。如有报道，则根据文献收集可能性最大的的微生物进行筛选。文献收集可能性最大的的微生物进行筛选。（2 2）培养方式的确定）培养方式的确定微生物的培养方式，有固体培养与液体培养。微生物的培养方式，有固体培养与液体培养。3.3.菌株的选育菌株的选育 从自然界直接分离得到的菌种，都不能立即适应实际生产需要。只有通从自然界直接分离得到的菌种，都不能立即适应实际生产需要。只有通过诱变，选育才能使产量成倍，成百倍地提高。选育方法基本上可以过诱变，选育才能使产量成倍，成百倍地提高。选育方法基本上可以分成两类：随机选择突变体；根据代谢的调节机制选择各种突变体。分成两类：随机选择突变体；根据代谢的调节机制选择各种突变体。（1 1）随机选择法）随机选择法 一般程序是采用诱变剂诱变处理微生物，增殖培养，经过稀释涂一般程序是采用诱变剂诱变处理微生物，增殖培养，经过稀释涂布，随机选择部分或全部单菌落，逐个测定它们的生物活性。最后挑布，随机选择部分或全部单菌落，逐个测定它们的生物活性。最后挑选出产量或其它性能比亲代菌株优秀的突变株。选出产量或其它性能比亲代菌株优秀的突变株。（2 2）根据代谢的调节机理选择高产突变体）根据代谢的调节机理选择高产突变体 根据代谢的调节机理选择高产突变体。根据代谢的调节机理选择高产突变体。(抗性基因抗性基因)2020/10/1825254.4.菌种的保藏菌种的保藏（1 1）菌种的退化与防止）菌种的退化与防止 生产菌种本来在自然环境下生长，所以在人工培养条件下，任何生产菌种本来在自然环境下生长，所以在人工培养条件下，任何菌株通过一系列的转接传代都可能发生退化。菌株通过一系列的转接传代都可能发生退化。退化退化一般把菌株的生活力，产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降，一般把菌株的生活力，产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降，成为退化。成为退化。菌种退化现象：菌种退化现象：单位容积中发酵液的活性物质含量；单位容积中发酵液的活性物质含量；琼脂琼脂平皿上的单菌落形态；平皿上的单菌落形态；不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征。如形成孢子能力；特征。如形成孢子能力；发酵过程发酵过程pHpH变动情况；变动情况；发酵液的气味、发酵液的气味、色泽。色泽。2020/10/182626 菌种退化防止措施：菌种退化防止措施：防止基因突变，基因突变是菌种退化防止基因突变，基因突变是菌种退化的一个主要原因，低温保藏法可以减少突变得产生。的一个主要原因，低温保藏法可以减少突变得产生。采用双重采用双重缺陷型缺陷型 采用双营养缺陷标志可间接而有效地防止突变。采用双营养缺陷标志可间接而有效地防止突变。制定制定科学管理制度科学管理制度 制作平行菌种斜面；制作平行菌种斜面；分离单菌落；认真进行单分离单菌落；认真进行单菌落分离工作，再多做平行的菌种斜面；菌落分离工作，再多做平行的菌种斜面；选择培养条件选择培养条件 选择选择有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。（2 2）常用的菌种保藏方法）常用的菌种保藏方法斜面保存法斜面保存法将菌种转接到新鲜的琼脂斜面上，待生长良好后，于将菌种转接到新鲜的琼脂斜面上，待生长良好后，于44保存。根据具体情况，间隔一定时间后转接。保存。根据具体情况，间隔一定时间后转接。矿油法矿油法在菌种斜面上覆盖矿物油以隔绝空气防止蒸发。在菌种斜面上覆盖矿物油以隔绝空气防止蒸发。索氏法索氏法将小试管斜面的菌种放在大试管内，大试管内装几粒氢氧将小试管斜面的菌种放在大试管内，大试管内装几粒氢氧化钾，管口加橡皮套，然后用石蜡包封。化钾，管口加橡皮套，然后用石蜡包封。2020/10/182727干硅胶法干硅胶法试管内装硅胶约半满，试管内装硅胶约半满，180180加热灭菌加热灭菌1.51.5小时，置密封小时，置密封干燥器内冷却，接种菌液约干燥器内冷却，接种菌液约1ml1ml，塞好棉花，放入预置有色硅胶的，塞好棉花，放入预置有色硅胶的大瓶中，蜡封瓶口，于低温处保存。大瓶中，蜡封瓶口，于低温处保存。砂土管法砂土管法取普通黄沙，洗净过取普通黄沙，洗净过6060目筛，晒干，另取普通圆土研碎，目筛，晒干，另取普通圆土研碎，过筛，晒干。两者以过筛，晒干。两者以6:46:4混合。分装于安醅瓶或小试管中，然后在混合。分装于安醅瓶或小试管中，然后在6060干热灭菌干热灭菌2 2小时，连续灭菌三次后即可使用。装管时可吸取少小时，连续灭菌三次后即可使用。装管时可吸取少许孢子悬浮液加入，待干燥后抽真空封口或用棉花塞紧后蜡封，许孢子悬浮液加入，待干燥后抽真空封口或用棉花塞紧后蜡封，低温保藏。低温保藏。冷冻干燥法：将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥。冷冻干燥法：将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥。甘油冷冻保存法：将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入甘油冷冻保存法：将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15%15%消毒消毒甘油，混匀速冻，冻存于甘油，混匀速冻，冻存于70 70 80.80.2020/10/182828第三节第三节 组织与细胞的破碎及细胞器的分离组织与细胞的破碎及细胞器的分离 一、组织与细胞的破碎一、组织与细胞的破碎（一）机械法（一）机械法1.1.组织捣碎法：适用于动物内脏组织、植物肉组织捣碎法：适用于动物内脏组织、植物肉质种子质种子2.2.匀浆器破碎匀浆器破碎3.3.研磨器破碎：常用于微生物或植物细胞的破研磨器破碎：常用于微生物或植物细胞的破碎碎2020/10/182929（二）物理法（二）物理法1 1、超声波法：多用于微生物材料超声波法：多用于微生物材料 2 2、压力法压力法 有压榨法、高压法和减压法，有压榨法、高压法和减压法，渗透压法。多用于微生物酶制剂的工业渗透压法。多用于微生物酶制剂的工业制备。制备。3 3、反复冻融法（温度差破碎法）：把待破反复冻融法（温度差破碎法）：把待破碎的样品冷至碎的样品冷至15152020，使之凝固，使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒可以破分动物性的细胞及细胞内的颗粒可以破碎。碎。4 4、冷热交替法：在细菌或病毒中提取蛋白冷热交替法：在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。质和核酸时可用此法。2020/10/183030 (三三)化学法化学法 用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容面活性剂处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物。物。1.1.溶剂处理法：溶剂处理法：破坏细胞膜的脂质双分子层破坏细胞膜的脂质双分子层 2.2.表面活性剂处理法表面活性剂处理法 表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。较常用的有十二烷基硫酸钠增溶作用。较常用的有十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)、氯、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。2020/10/183131（四）生物法（四）生物法（1 1）组织自溶法）组织自溶法 利用组织中自身溶解酶的作用改变、破坏细胞结构，利用组织中自身溶解酶的作用改变、破坏细胞结构，释放出目的物称为组织自溶法。释放出目的物称为组织自溶法。自溶时，需加少量的防腐剂，如甲苯、氯仿等，以防止自溶时，需加少量的防腐剂，如甲苯、氯仿等，以防止外界细菌的污染。因自溶的时间较长，不易控制，故制造外界细菌的污染。因自溶的时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白质时比较少用。具有活性的核酸、蛋白质时比较少用。(2)(2)酶解法酶解法 用外来酶处理生物材料，如用溶菌酶处理某些细菌，用外来酶处理生物材料，如用溶菌酶处理某些细菌，蜗牛酶等蜗牛酶等用外来酶处理生物材料，如溶菌酶（用外来酶处理生物材料，如溶菌酶（LysozymeLysozyme）是专一地破）是专一地破坏细菌细胞壁的酶。坏细菌细胞壁的酶。（3 3）噬菌体法）噬菌体法 用噬菌体感染细胞、裂解细胞，释放出内用噬菌体感染细胞、裂解细胞，释放出内容物。容物。2020/10/183232机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性剂：表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理2020/10/183333二、细胞器的分离二、细胞器的分离v为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到细胞器再进一步分离有效成分。方常常要先得到细胞器再进一步分离有效成分。方法是匀浆破碎细胞，差速离心。法是匀浆破碎细胞，差速离心。第一课件网()2020/10/183434第四节第四节 生化药物的提取生化药物的提取一、提取的概念一、提取的概念 利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取物中分离出一种或几种组分的过程称为提取（extractionextraction），提取又称萃取或抽提，其含义），提取又称萃取或抽提，其含义基本相同。用冷溶剂从固体物质提取的过程可称基本相同。用冷溶剂从固体物质提取的过程可称为浸渍（为浸渍（macerationmaceration）；用热溶剂者可称为浸提）；用热溶剂者可称为浸提（digestiondigestion），也称浸煮），也称浸煮 2020/10/183535二、物质性质与提取二、物质性质与提取（一）物质的性质与提取方法的选择（一）物质的性质与提取方法的选择 选择合适的溶剂系统与提取条件。选择合适的溶剂系统与提取条件。（二）活性物质的保护措施（二）活性物质的保护措施（1 1）采用缓冲盐系统）采用缓冲盐系统（2 2）添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等）添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等）（3 3）抑制水解酶的作用）抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)(SDS,EDTA)（4 4）其它保护措施（避免过酸过碱和剧烈搅拌）其它保护措施（避免过酸过碱和剧烈搅拌）2020/10/183636一一般般生生产产上上多多用用2 23 3次次提提取取。溶溶剂剂用用量量（L L）为为生生物物材材料料的的2 25 5倍倍，少少数数情情况况也也有有用用10102020倍倍量量溶溶剂剂作作一一次次性性提提取取。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。2020/10/183737三、物质的性质与溶解度三、物质的性质与溶解度（一）物质溶解度的一般规律（一）物质溶解度的一般规律v 相似相溶相似相溶（二）水在生化物质提取中的作用（二）水在生化物质提取中的作用v水是提取生化物质的常用溶剂。水分子的存在可水是提取生化物质的常用溶剂。水分子的存在可使其它生物分子之间的氢键减弱，而与水分子形使其它生物分子之间的氢键减弱，而与水分子形成氢键，水分子还能使溶质分子的离子键解离，成氢键，水分子还能使溶质分子的离子键解离，这就是所谓的水合作用。水合作用促使蛋白质、这就是所谓的水合作用。水合作用促使蛋白质、核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或水合离子从而促使它们溶解于水或水溶液中。水合离子从而促使它们溶解于水或水溶液中。2020/10/183838四、提取效率四、提取效率1 1、对于所选溶剂系统，目的物在生物材料中的分配、对于所选溶剂系统，目的物在生物材料中的分配系数系数K K越大，提取后的残留物质越多越大，提取后的残留物质越多2 2、所用的溶剂越多，残留量越少、所用的溶剂越多，残留量越少3 3、提取次数越多，残留量也越少、提取次数越多，残留量也越少v一般生产上多用一般生产上多用2 23 3次提取。溶剂用量（次提取。溶剂用量（L L）为生）为生物材料的物材料的2 25 5倍，少数情况也有用倍，少数情况也有用10102020倍量溶倍量溶剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。害酶的作用。2020/10/183939五、影响提取的因素五、影响提取的因素（一）温度（一）温度 多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。对多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。对耐热成分的提取可以用加热的方法。对不耐热的生物耐热成分的提取可以用加热的方法。对不耐热的生物活性物质的提取，一般在活性物质的提取，一般在0-100-10进行提取。进行提取。(二二)酸碱度酸碱度 多数生化物质在中性条件下较稳定，多数生化物质在中性条件下较稳定，pHpH值一般应控值一般应控制在制在4 49 9范围内，为了增加目的物的溶解度，往往要范围内，为了增加目的物的溶解度，往往要避免目的物的等电点附近进行提取。避免目的物的等电点附近进行提取。（三）盐浓度（三）盐浓度盐溶作用盐溶作用盐析作用盐析作用2020/10/184040六六 、提取方法、提取方法（一）用酸、碱、盐水溶液提取（一）用酸、碱、盐水溶液提取（二）表面活性剂提取（二）表面活性剂提取 表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的提取的蛋白质或酶的提取。系统无法提取的提取的蛋白质或酶的提取。2020/10/184141（三）有机溶剂提取（三）有机溶剂提取1.1.固液提取固液提取 丙酮从动物脑中提取胆固醇，丙酮从动物脑中提取胆固醇，溶剂分级提取：如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，溶剂分级提取：如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。丙酮粉丙酮粉2.2.液液萃取液液萃取 液液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶液液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。分配系数和溶剂用量质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。分配系数和溶剂用量 溶剂萃取的注意事项：溶剂萃取的注意事项：（1 1）pHpH 在萃取操作中正确选择在萃取操作中正确选择pHpH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。2020/10/184242（2 2）盐析）盐析加入中性盐如硫酸铵，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少，这种现象加入中性盐如硫酸铵，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少，这种现象成为盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提成为盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。高萃取率。（3 3）温度）温度 一般在室温下或低温下进行萃取操作。一般在室温下或低温下进行萃取操作。（4 4）乳化）乳化 在液液萃取时，常发生乳化作用，使有机溶剂与水相分层困难。去乳化的在液液萃取时，常发生乳化作用，使有机溶剂与水相分层困难。去乳化的常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，加吸附剂。加吸附剂。液液萃取时溶剂的选择：液液萃取时溶剂的选择：（1 1）选用的溶剂必须具有较高的选择性，各种溶质在所选的溶剂之间分配系）选用的溶剂必须具有较高的选择性，各种溶质在所选的溶剂之间分配系数差异愈大愈好。数差异愈大愈好。（2 2）选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收。）选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收。(3)(3)两种溶剂的密度相差不大时容易形成乳化，不利于萃取液的分离。两种溶剂的密度相差不大时容易形成乳化，不利于萃取液的分离。（4 4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易的溶剂。）要选用无毒，不易燃烧的价廉易的溶剂。2020/10/184343 对对酸性酸性物质的提取，常在物质的提取，常在碱性碱性条条件下进行；对件下进行；对碱性碱性物质的提取，常在物质的提取，常在酸性酸性条件下进行；对条件下进行；对两性两性物质的提取，物质的提取，则使水溶液的则使水溶液的pHpH值在该两性物质的值在该两性物质的等等电点附近电点附近为佳。为佳。2020/10/184444七、超临界气体的萃取技术七、超临界气体的萃取技术 以气体为萃取剂，当气体处于超过临界温以气体为萃取剂，当气体处于超过临界温度和临界压力时，呈现一种既非液相又非气相的度和临界压力时，呈现一种既非液相又非气相的流体，兼有液体和气体的特性。如密度接近于液流体，兼有液体和气体的特性。如密度接近于液体，粘度却接近于气体，具有良好的溶剂性质。体，粘度却接近于气体，具有良好的溶剂性质。主要有二氧化碳、氮气、乙烯、乙烷、丙烯、主要有二氧化碳、氮气、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧化碳。丙烷等，最常用的是二氧化碳。2020/10/184545v该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取（如鱼油该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取（如鱼油和卵磷脂的提取）、精制和回收，也可用于生化和卵磷脂的提取）、精制和回收，也可用于生化产品的溶剂脱除。某些生化产品在生产过程中，产品的溶剂脱除。某些生化产品在生产过程中，采用了丙酮和甲醇溶剂，欲脱去溶剂又要避免产采用了丙酮和甲醇溶剂，欲脱去溶剂又要避免产品的分解，需选择超临界气体提取。与减压干燥品的分解，需选择超临界气体提取。与减压干燥法相比较，前者不多消耗能源，且缩短脱溶时间。法相比较，前者不多消耗能源，且缩短脱溶时间。2020/10/184646八、提取液的分离八、提取液的分离 v 溶液与固体的分离，一股处理方法有三种：自然沉降、溶液与固体的分离，一股处理方法有三种：自然沉降、过滤、离心。过滤、离心。v自然沉降是在液体介质中，固体自然下沉而分离的过程。自然沉降是在液体介质中，固体自然下沉而分离的过程。当混悬液处理量较大，且固体和液体的比重悬殊时，可用当混悬液处理量较大，且固体和液体的比重悬殊时，可用此法。此法。v过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体通过，达到固体过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体通过，达到固体与液体分离的过程。与液体分离的过程。v离心是利用旋转运动的离心力进行分离物料的一种操作，离心是利用旋转运动的离心力进行分离物料的一种操作，其中通过过滤介质分离液体和固体者为离心过滤；利用液其中通过过滤介质分离液体和固体者为离心过滤；利用液体比重的大小分离出不同比重的液体者为离心分离；利用体比重的大小分离出不同比重的液体者为离心分离；利用液固两相比重的差异进行沉降分离者为离心沉降。液固两相比重的差异进行沉降分离者为离心沉降。2020/10/184747第五节第五节 生化物质的分离纯化技术生化物质的分离纯化技术v生化物质分离纯化技术包括：生化物质分离纯化技术包括：生化产品的分离分生化产品的分离分析析和和生化产品的制备生化产品的制备。v生物产品的制备中的分离方法多采用温和的生物产品的制备中的分离方法多采用温和的“多多阶式阶式”方法进行，即常说的方法进行，即常说的“逐级分离逐级分离”方法。方法。2020/10/184848一、分离纯化原理一、分离纯化原理（1 1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心，膜分离（透析、离心，膜分离（透析、电渗析）与超滤法，凝胶过滤法。电渗析）与超滤法，凝胶过滤法。（2 2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离。如离）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。子交换法，电泳法，等电聚焦法。（3 3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。及有机溶剂分级沉淀法。（4 4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。吸附层析法。（5 5）根据配体特异性进行分离）根据配体特异性进行分离亲和层析法。亲和层析法。2020/10/184949二、分离纯化的程序和生产设计二、分离纯化的程序和生产设计（1 1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法；方法；（2 2）制备物的理化性质稳定性的预备试验；）制备物的理化性质稳定性的预备试验；（3 3）材料处理及抽提方法的选择；）材料处理及抽提方法的选择；（4 4）分离纯化方法的摸索）分离纯化方法的摸索（5 5）产物的均一性测定。）产物的均一性测定。2020/10/1850501 1分离纯化初期使用方法的选择分离纯化初期使用方法的选择 v早期分离方法的选择原则是从低分辨能力到高分早期分离方法的选择原则是从低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大者为合适，用萃取，沉辨能力，而且负荷量较大者为合适，用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。2020/10/1851512 2各种分离纯化方法的使用程序各种分离纯化方法的使用程序v生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要根据物质的分配系数，分子量大小，离子电主要根据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。础。v在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率，如在盐析后采取吸附法，必然工序，提高效率，如在盐析后采取吸附法，必然会因离子过多而影响吸附效果，如增加透析除盐，会因离子过多而影响吸附效果，如增加透析除盐，则使操作大大复杂化。如倒过来进行，先吸附，则使操作大大复杂化。如倒过来进行，先吸附，后盐析就比较合理。后盐析就比较合理。2020/10/1852523 3分离后期的保护性措施分离后期的保护性措施 v在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气的氧化和某些事先无法了解的因素。残留，空气的氧化和某些事先无法了解的因素。2020/10/185353三、分离纯化方法的评估三、分离纯化方法的评估v每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑外，还要注意方法本身的回收重现性两方面考虑外，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。的高低十分重要。2020/10/185454四、生化产品纯度的鉴定四、生化产品纯度的鉴定v一个制备物是否纯，常以一个制备物是否纯，常以“均一性均一性”表示。均一表示。均一性是指所获得的制备物只具有一种完全相同的成性是指所获得的制备物只具有一种完全相同的成分，均一性的评价常须经过数种方法的验证才能分，均一性的评价常须经过数种方法的验证才能肯定。肯定。v生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度溶解度法，化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离法，化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及以及质谱法质谱法等。等。2020/10/185555五、具体分离纯化方法五、具体分离纯化方法（一）沉淀法（一）沉淀法（二）膜分离法（二）膜分离法（三）层析法（三）层析法（四）电泳法（四）电泳法（五）离心技术（五）离心技术2020/10/185656（一）沉淀法（一）沉淀法 在生化药物制备中最常用的几种沉淀方法是：在生化药物制备中最常用的几种沉淀方法是：中中性性盐盐沉沉淀淀（盐盐析析法法）：多多用用于于各各种种蛋蛋白白质质和酶的分离纯化。和酶的分离纯化。有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀：多多用用于于蛋蛋白白质质和和酶酶、多多糖糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。核酸以及生物小分子的分离纯化。等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。方法结合使用。2020/10/185757中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）在在溶溶液液中中加加入入中中性性盐盐使使生生物物大大分分子子沉沉淀淀析析出出的的过过程程称称为为“盐盐析析”。除除了了蛋蛋白白质质和和酶酶以以外外，多多肽肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。原理原理 1 1）中性盐离子破坏蛋白质表面水膜）中性盐离子破坏蛋白质表面水膜 。2 2）中性盐离子中和蛋白质表面电荷）中性盐离子中和蛋白质表面电荷2020/10/185858盐析常用的盐盐析常用的盐 v常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸二氢钠等。实际应用中以硫酸铵最为常用。磷酸二氢钠等。实际应用中以硫酸铵最为常用。因为硫酸铵具有因为硫酸铵具有:v盐析能力强。盐析能力强。v溶解度大且受温度影响小。溶解度大且受温度影响小。v不易使蛋白质变性。不易使蛋白质变性。v价格价廉价格价廉2020/10/185959影响盐析的因素影响盐析的因素v盐饱和度盐饱和度：不同的蛋白质，其结构和性质不同，：不同的蛋白质，其结构和性质不同，盐析时所需的饱和度也就不同。盐析时所需的饱和度也就不同。v蛋白质浓度蛋白质浓度：一般常将蛋白质浓度控制在：一般常将蛋白质浓度控制在2 23 3为宜。为宜。vpHpH：进行盐析时的：进行盐析时的pHpH，要选择在被盐析的蛋白质，要选择在被盐析的蛋白质的的pIpI附近。附近。v温度温度：蛋白质的盐析一般在室温下进行：蛋白质的盐析一般在室温下进行2020/10/186161盐析操作（以硫酸铵为例）盐析操作（以硫酸铵为例）1.1.操作方式操作方式盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：（1 1）加硫酸铵的饱和溶液）加硫酸铵的饱和溶液v在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，或硫在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，或硫酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。（2 2）直接加固体硫酸铵）直接加固体硫酸铵v在工业生产溶液体积较大时，或需要达到较高的在工业生产溶液体积较大时，或需要达到较高的硫酸铵饱和度时，可采用这种方式。硫酸铵饱和度时，可采用这种方式。2020/10/186262操作注意事项操作注意事项(1)(1)加固体硫酸铵时，必须注意表中的温度。加固体硫酸铵时，必须注意表中的温度。(2)(2)分段盐析时，要考虑到每次分段后蛋白质浓度的分段盐析时，要考虑到每次分段后蛋白质浓度的变化。变化。(3)(3)盐析条件如盐析条件如pHpH、温度和硫酸铵的纯度都必须严、温度和硫酸铵的纯度都必须严格控制。格控制。(4)(4)盐析后一般要放置盐析后一般要放置0.50.51h1h。(5)(5)盐析过程中，搅拌必须规则和温和。盐析过程中，搅拌必须规则和温和。(6)(6)反应至少应在反应至少应在50mmol/L50mmol/L缓冲溶液中进行。缓冲溶液中进行。2020/10/186363 例：分离球蛋白和白蛋白例：分离球蛋白和白蛋白 血清血清1ml 1ml 1ml PBS 1ml PBS充分混合。充分混合。逐渐加入饱和逐渐加入饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4 溶液至溶液至50%50%，边加边搅拌。，边加边搅拌。离心离心 上清上清 沉淀（球蛋白）沉淀（球蛋白）2020/10/186464 2 2、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法v概念：利用有机溶剂能降低蛋白质等生物大分子概念：利用有机溶剂能降低蛋白质等生物大分子在水溶液中的溶解度的原理而使之沉淀析出的方在水溶液中的溶解度的原理而使之沉淀析出的方法，称为有机溶剂沉淀法。法，称为有机溶剂沉淀法。v基本原理基本原理 1 1）有机溶剂能降低水溶液的介电常数。）有机溶剂能降低水溶液的介电常数。2 2）有机溶剂能破坏蛋白质表面的水膜。）有机溶剂能破坏蛋白质表面的水膜。2020/10/186565常用的有机溶剂常用的有机溶剂v有机溶剂的选择主要考虑以下几个方面的因素：有机溶剂的选择主要考虑以下几个方面的因素：介电常数小，沉淀作用强。介电常数小，沉淀作用强。对生物大分子的对生物大分子的变性作用小。变性作用小。毒性小，挥发性适中。毒性小，挥发性适中。一般需一般需能与水无限混溶能与水无限混溶v常用于生物大分子沉淀的有机溶剂有乙醇、丙酮、常用于生物大分子沉淀的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙酮和甲醇等。其中乙醇是最常用的沉淀剂，异丙酮和甲醇等。其中乙醇是最常用的沉淀剂，因为它具有沉淀作用强、沸点适中、无毒等优点。因为它具有沉淀作用强、沸点适中、无毒等优点。2020/10/186666影响有机溶剂沉淀法的因素影响有机溶剂沉淀法的因素v温度温度 在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行程应在低温下进行 。vpHpH值值 pH pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。多控制在待沉蛋白质的等电点附近。样品浓度一般认为蛋白质的初浓度以样品浓度一般认为蛋白质的初浓度以0.50.52 2为好，粘为好，粘多糖则以多糖则以1 12 2较合适。较合适。v中性盐浓度中性盐浓度 一般在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以一般在有机溶剂沉
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