真核生物转录后的加工课件

第四第四节节 真核生物真核生物转录转录后的加工后的加工（Pre-RNA processing in Eukaryotes）多数转录的初始产物无生物活性，在生物体内进行加工处理后才具有生物活性。转录后加工（post-transcriptional processing）:是指将各种 前体RNA（Pre-RNA）分子加工转变成 有功能的、成熟的 各种 RNA(mRNA，rRNA 或tRNA等)的过程。Pre-RNA Mature RNA 加帽（Capping）加尾（Tailing）剪接（Splicing）碱基修饰（Bases modification）编辑（Editing ）转录后加工的主要方式:RNA加工修饰主要对象:?hnRNA：mRNA前体?pre-rRNA：rRNA前体?pre-tRNA：tRNA前体 一、tRNA 前体的加工（一）真核生物 tRNA基因结构?真核tRNA的基因成簇排列，基因间有间隔区，是一种重复序列；?前体分子tRNA是单顺反子;?前体分子 tRNA中含有内含子；?前体分子 tRNA中没有3-CCA序列。（二）（二）tRNA前体的加工前体的加工?剪接内含子；?柄部结构的加工：加上 CCA-OH 的3 末端，完成柄部结构；?碱基修饰。（三）tRNA前体的加工过程 1、内含子剪接 位置相同，都在反密码子环的下游；不同tRNA的内含子长度和序列各异；外显子和内含子 交界处无保守序列，内含子的剪切是依靠RNase异体催化，进行剪接；内含子和反密码子配对形成 茎环结构，保护了反密码子，使其免受酶的降解。tRNA内含子特点：酵母tRNAPhe内含子的结构（引自B.Lewn,2000）剪接剪接过过程：程：第一步：核酸酶切割 释放一条线状内含子 和两个“tRNA半分子”第二步：RNA连接酶连接断端 切除tRNA内含子的核酸酶很特殊，产生2-3 环磷酸和5-OH，因 此 不 能 直 接 连 接。3端 需 通 过 环 磷 酸 二 酯 酶（Phosphodiesterase）将2-3 环磷酸打开，形成3-OH。5 端需在激酶作用下将5-OH磷酸化。再通过连接酶将两个半分子连接起来。哺乳动物的tRNA连接酶可将2-3 环磷酸与5-OH直接连接起来。剪接特点：剪接特点：(1)真核tRNA内含子的精确剪切不依赖内含子的一级序列和大小，剪切反应的识别信号 是“三叶草”的二级结构；(2)不是转酯反应；(3)RNase异体催化剪切内含子。2、柄部、柄部结结构加工构加工-加上CCA-OH 的3 末端 tRNA核苷转移酶 tRNA nucleotidyl transferase 3、碱基修、碱基修饰饰（1）（1）（3）（2）（4）（2）还原反应 如：U?DHU（3）核苷内的转位反应 如：U?（4）脱氨反应 如：A?I 如：A?Am（1）甲基化 D臂 反密码子臂 额外臂 TC臂 受体臂 二、二、rRNA 前体的加工前体的加工（一）真核生物rRNA 基因结构?真核生物的 18S、5.8S和28S rRNA基因串联在一起形成一个转录本，彼此被间隔区分开;?不同生物的 rRNA 前体大小不同：哺乳动物为45S；果蝇38S；酵母37S；四膜虫35S?每个重复单位之间的间隔 DNA序列不转录，称为 非转录间隔序列。?在转录时或转录后，甲基化酶立即结合到转录本上。?真核生物5S rRNA基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域。由RNApol 转录，转录后只需要进行简单的加工，或者根本不需要进行加工。?高等真核生物核基因组前体 rRNA中一般没有内含子。18S RNA 结合39个甲基化酶 28S RNA 结合74个甲基化酶 推测：甲基化用于标明转录本的加工区域;（二）（二）rRNA 前体的加工前体的加工过过程程 切除5 端的前导序列，45S初始转录本变成 41S中间产物；从41S的中间产物中先切下 18S的片段，产物分别为 20S（含18S rRNA 片段）和32S；32S 中间 产 物（含 5.8S 和 28S rRNA）中的 5.8S和28S之间进行部分退火，形成发夹结构；通过外切酶等将 20S中残余的ITS 切除；将已退火的32S中的ITS切除掉。已知整个加工过程是在核糖体上 进 行 的，而 不 是 以 游 离 的rRNA 进行加工的。三、mRNA 前体的加工 1、5?端形成 帽子结构（m7GpppNp）2、3?端加上多聚腺苷酸尾巴（poly A tail）3、中部剪接除去内含子 4、链内部核苷酸的 甲基化 hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：（一）5-端加上帽子结构（mGpppNp）1、帽子的种类 帽子0（Cap-0）m7Gppp XpYp m7G 7-甲基鸟苷三磷酸 帽子1（Cap-1）m7GpppXmp Yp 第一个核苷酸的 2-O 位上产生甲基化 （A N6 位甲基化）帽子2（Cap-2）m7GpppXmpYmp 第二个核苷酸的 2-O 位上产生甲基化 （A、G、C、U）单细胞真核生物只有 Cap-0 Cap-1 是其余真核生物的主要帽子形式 Cap-2 存在于某些真核生物中 2、帽子结构的生物学功能 使mRNA免受核酸酶的降解，增加mRNA的稳定性；有助于mRNA越过核膜，进入细胞质；被蛋白质起始因子识别，使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质。（二）（二）3-端加上多聚腺苷酸尾巴（端加上多聚腺苷酸尾巴（polyA）?几乎所有真核生物成熟的mRNA末端都有一串约250个腺嘌呤核苷酸尾巴。它们并非模板DNA编码，而是在转录完成时由 poly(A)多聚酶合成。加尾位置 不在转录物的最末端，而是在接近末端的内部位点。在切除 mRNA 3末端的一段序列后，再加上多聚腺苷酸。?加尾是在核内完成，先于mRNA 中段的剪接，和转录终止同时进行。?新合成的 mRNA的3-端含两个明显的 加尾信号。第一个 加 尾 信 号 位 于 poly(A)上 游，一 致 顺 序 为5?AAUAAA?3；第 二 个 加 尾 信 号 位 于5?AAUAAA?3 顺序下游约15-24 nt位置处，有一段富GU序列，紧随其后通常有一串富U的顺序。5-AAUAAA-1524 bp-GUGUGUUGGAAUUUUUUGUGU-3?如果改变5?AAUAAA?3 位置，加尾位点改变；缺失，则不发生加尾。?富GU序列和紧随其后的富U序列对正常的加尾不可缺一。1、ploy（A）加尾信号 2、poly（A）的生物学功能 提高mRNA在细胞质中的稳定性。协助mRNA从细胞核向细胞质转运。作为核糖体的识别信号，使mRNA分子有效翻译。对基因的表达调控有重要作用。（三）（三）mRNA的内部甲基化的内部甲基化?真核生物mRNA分子中有许多甲基化的碱基；?具体的甲基化位点还不太清楚；?主要是：N6-甲基腺嘌呤（m6A）；?推测可能为mRNA的剪切提供信号。（四）核（四）核mRNA前体的剪接（前体的剪接（Splicing）?真核不连续基因的初级转录产物中，外显子与内含子交替出现-割裂基因（Split gene）；?转录后把内含子切除而把外显子连接起来产生成熟 RNA分子的过程，叫RNA 剪接（RNA splicing）。?内含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超过99%。1、核mRNA内含子剪接位点特征?内含子总是由GU开始，以AG结束，其规律称为GU-AG法则（GU-AG rule)或Chambon 法则。?5 端剪接位点(供位)相邻的保守序列：5-AGGUPuAGU-3?3 端剪接位点(纳位)相邻的保守序列：5-(Py)nNCAG-3?分枝点保守序列：Py80NPy87Pu75APy95，其中A为百分之百保守，且具有2-OH。mRNA前体正确剪接所必需的 2、参与核hnRNA剪接的主要物质?snRNA(small nuclear RNAs，核内小分子RNA）?snRNP?SnRNA一般300碱基，包括U1-U6等；?在自然状态下，snRNAs与相关的蛋白质形成复合 物-SnRNP?在剪接过程中有5种snRNAs 参加，它们是U1、U2、U4、U5、和U6；?snRNP、hnRNA、其他相关蛋白质和剪接因子（Splicing Factor SF），形成呈椭球体的复合物-剪接体（Spliceosome）；?hnRNA剪接通过剪接体完成 各种SnRNA功能表 U1 snRNA自我配对形成了多个茎环结构，从而构成了不同的功能区。Sm结合位点是和其他snRNP相互作用的区域。其5 端有一保守序列：3-CAUUCAU-5。这一序列可与内含子5 端的边界序列互补结合。U2与分枝点配与分枝点配对对 U6与mRNA 5 端配对 U6 snRNA既能与U4配对也能与U2配对 3、剪接机制（、剪接机制（简简化）化）?第一次转酯左外显子、内含子剪切套索?第二次转酯外显子连接、套索状内含子释放?剪接体解体与套索降解同步 U1通过与 5 剪接点互补而结合 U2AF与 3 剪接点内含子结合 U2识别并结合分支点 A，并在SF1和BBP帮助下使内含子的 5 端和 3 端带到一起 U4/U5/U6复合物与U1/U2结合 4、具体的剪接机制、具体的剪接机制 U1脱离 U4脱离，U6与U2间发生第一次转酯反应，套索结构形成 第二次转酯反应，U2/U5/U6与套索结构结合 成熟的mRNA释放 续续上上页页 四、其他的内含子剪接方式四、其他的内含子剪接方式 1、内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为四类。I类：线粒体、叶绿体及低等真核生物细胞核的 rRNA基因；II类：线粒体、叶绿体的mRNA基因；III类：大多数真核生物核mRNA的基因；tRNA内含子：tRNA基因。2、剪接方式 方式一：由剪接装置完成（核mRNA内含子）可供识别的特异序列（GU-AG）剪接装置由多种蛋白质和核蛋白组成-剪接体；方式二：自我剪接（两类内含子、）形成特定的二级结构，具有催化剪接能力的RNA；方式三：需要蛋白质酶参与的剪接（酵母tRNA）前两种剪接都属于转酯反应 核核酶酶发现发现的的历历史：史：In 1967,Carl Woese,Francis Crick,and Leslie Orgel were the first to suggest that RNA could act as a catalyst based upon findings that it can form complex secondary structures.The first ribozyme was discovered in the 1982 by Thomas R.Cech and his coworkers who were studying RNA splicing in Tetrahymena thermophila.在四膜虫（在四膜虫（Tetrahymena thermophila）中，）中，26S rRNA分子分子含有含有1个个0.4 Kb的内含子。的内含子。17S 5.8S 26S ETS1 ITS1 ITS2 ETS2 17S 5.8S 26S IVS 1982年，Thomas Cech 及其同事发现，一个仅含有纯化的6.4 Kb前体、ATP及GTP而没有酶蛋白的 对照实验样品 中发生了剪接作用。进一步实验证实，在核苷酸存在的条件下，RNA 发生了自我剪接（self-splicing）。实验结果表明：RNA分子也具有高度特异的催化活性。Kelly Kruger,Paula J.Grabowski,Arthur J.Zaug,Julie Sands,Daniel Gottschling and Thomas R.Cech.1982.Self-splicing RNA:autoexcision and autocylcization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena.Cell 31:147-157 核核酶酶的分的分类类 根据催化反应的类型，可分为 2大类：?剪切型核酶?剪接型核酶 I 内含子 II 内含子 锤头型核酶（Hammerhead）发夹型核酶(Hairpin)丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNase P 自身催化型 异体催化型 3种剪切型核种剪切型核酶酶的二的二级结级结构构 Elizabeth A.Doherty and Jennifer A.Doudna.RIBOZYME STRUCTURES AND MECHANISMS.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,2001,30:45775.锤头型 发夹型 HDV 4、I类含子的剪接 结构特点：（1）5 剪接点和3 剪接点-U G （2）有由保守序列形成的二级结构 a、保守序列为 5 PQRS3 P与Q互补、R与S互补而形成中部核心结构 b、二级结构中还包括内含子与外显子的某一序列 互补所形成的二级结构。内部引导序列（interal guide sequence，IGS）。I类类含子的二含子的二级结级结构构 四膜虫rRNA 内含子的二级结构 5-端核苷酸序列 I类类内含子的自我剪接内含子的自我剪接过过程程 3、II类含子的剪接 结构特点：（1）剪接点序列为5 GUGCG-YnAG，符合GU-AG法则（2）分枝点保守序列：-Py Pu Py Py U A Py-。其中A为百分之百保守，且具有2-OH。（3）二级结构 形成6个茎环结构，使两个并列的功能区靠近。形成6个茎环结构，使两个并列的功能区靠近。功能区5和功能区6被两个碱基隔开。功能区6含有1个不配对A残基，其上带有2-OH，发动第一次转酯反应。类类内含子的二内含子的二级结级结构构 II类类内含子的自我剪接内含子的自我剪接过过程程 与前所叙的核基因 mRNA 的剪接过程相比，和类内含子剪接的最大特点是不需要其他成分的参与，RNA分子本身能形成剪接所需的空间结构和催化活性区域。在 核基因 mRNA 的剪接过程中，需要多种成分特别是 snRNA 与RNA前体共同作用 才能形成剪接所需的空间结构，产生具催化功能的区域。几种不同内含子剪接反几种不同内含子剪接反应应的区的区别别 五、RNA的编辑和再编码 指转录后的 RNA在编码区 发生碱基的替换、插入或丢失等现象。（一）RNA的编辑（RNA editing）碱基的替换-哺乳动物载脂蛋白基因转录产物的编辑 指导RNA指导的编辑-利什曼原虫属细胞色素b mRNA的编辑 例子：尿苷酸的缺失和添加-锥虫线粒体mRNA转录后编辑 概念：1、碱基的替、碱基的替换换 表明：RNA编辑可能是充分发挥生理功能所必须的。2、尿苷酸的缺失和添加、尿苷酸的缺失和添加 1986年，R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上 加入或丢失尿苷酸；1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。TU A U A U G UUUUG UU G UUU A UU A U G U GA UU A U GG UUUUG UUUUUUA UU GGUAUUUUUUAUA UUU AUUU AA UUU G UU GA U AAA U ACA UUUUAUUUGUU UG UU AA UUUUUUUG UUUUG U GUUUUUGGUU TT TTTTU AGG UUUUUUUG UU GUUGUU G UUUUG U A UU A U GA UU GAG UUU G UU G UUU GG UUUUUUG UUUU TT TTTTUU G U GAAACCAGUU AUGAGAGUUUGCAUU G UU A UUU A UU ACA UU AAG UU GGUGUUUUUGG UU C 图13-44 锥虫 (T.brucei)cox基因的部分RNA 顺序。很多U(红色)在DNA 中未编码，而另一些在 DNA中编码的T(紫色)在mRNA 中被删除了。(参考 B.Lewin:GENES ,1997，Fig31.16)3、指导RNA指导的编辑?研究发现，利什曼原虫属细胞色素b mRNA中含有许多独立于核基因的尿嘧啶残基。?指导RNA与被编辑区及其周围部分核酸序列虽然有相当程度的互补性，但该RNA上存在一些未能配对的腺嘌呤，形成缺口，为插入尿嘧啶提供了模板。?特异性插入这些残基的信息来自指导RNA（guide RNA）。?反应完成后，指导RNA从mRNA上解离下来，而mRNA则被用做翻译的模板。指导RNA指导的编辑机制 4、RNA编辑的生物学意义 校正作用：有些基因丢失的遗传信息可以通过RNA编辑得到恢复；调控翻译：通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子，是基因表达调控的一种手段；扩充遗传信息：能使基因产物获得新的结构 和功能，有利于生物进化。（p101）（二）RNA的再编码（RNA recoding）概念：mRNA在某些情况下不是以固定的方式翻译，而可以改变原来的编码信息，以不同的方式进行编码，科学上把 RNA编码和读码方式的改变称为RNA的再编码。例子：核糖体程序性+1/-1移位：mRNA读码信号发上+1/-1移位；核糖体跳跃：核糖体跳过多个核苷酸；终止子通读：硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸 意义：可使一种mRNA产生两种或多种相互关联但又不同的蛋白质，可能是蛋白质合成的一种调节机制。第五节 原、真核生物mRNA的特征比较 原、真核生物mRNA转录后加工 原、真核生物mRNA结构特征比较 1、原核生物mRNA的特征?半衰期短?多以多顺反子的形式存在?5 端无“帽子”结构 2、真核生物mRNA的特征?5 端存在“帽子”结构?3 端没有或只有较短的poly（A）尾巴?多数mRNA 3 端具有poly（A）尾巴?以单顺反子的形式存在 第六第六节节 RNA合成与DNA合成异同点异同点 相同点：相同点：1、都以DNA链作为模板 2、合成的方向均为 5 3 3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的 3,5 -磷酸二酯键，使核苷酸链延长。不同点：不同点：复制 转录 模板 两条链均复制 模板链转录（不对称转录）原料 dNTP NTP 酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 产物 子代双链DNA（半保留复制）mRNA，tRNA，rRNA 配对 A-T；G-C A-U；G-C 引物 RNA引物 无 本章本章结结束束 谢谢谢谢！