植物组织培养的基本原理课件

1 植物组织培养的基本原理植物组织培养的基本原理 讲授内容讲授内容n 1.1 细胞的全能性细胞的全能性n 1.2植物细胞分化与脱分化植物细胞分化与脱分化n 1.3植物的形态建成植物的形态建成n 1.4基因表达与位置效应及器官基因表达与位置效应及器官分分n 化信息传递化信息传递1.植物细胞全能性植物细胞全能性（Cellular totipotency）：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。完整植株的能力。（Haberlandt,1902）1.1 植物细胞全能性植物细胞全能性2.1.1 植物组织培养的理论基础植物组织培养的理论基础细细胞全能性胞全能性1、细胞全能性、细胞全能性（cell totipotency)：植物：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。下具有发育成完整植物体的潜在能力。3.细胞全能性（红罗卜）细胞全能性（红罗卜）4.1.2 植物细胞的分化与脱分化植物细胞的分化与脱分化1.1.分化分化differentiationdifferentiation：细细胞在分裂过程中发生结构和功能胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形上的改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活成各类组织和器官完成整个生活周期。周期。5.n高等植物细胞分化示意图幼年细胞细胞分裂细胞分裂多细胞团形态建成完整植株细胞分化细胞分化6.1.2 植物细胞的分化与脱分化植物细胞的分化与脱分化2.2.脱分化脱分化dedifferentiationdedifferentiation:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。分生能力，回复到分生组织状态的过程。3.3.再分化再分化redifferentiationredifferentiation:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。官的过程。7.离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽再再生生植植株株植物组织培养过程植物组织培养过程（高等植物细胞脱分化和在分（高等植物细胞脱分化和在分化示意图）化示意图）8.1.3 植物的形态建成9.1.3 植物的形态建成植物的形态建成细胞培养再生细胞培养再生完整的植株完整的植株茎芽分化（器官分化）茎芽分化（器官分化）体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生10.外植体的成苗途径外植体的成苗途径试管苗试管苗外植体外植体愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽芽芽根根根根 芽芽体细胞胚体细胞胚试管苗试管苗体细胞胚体细胞胚试管苗试管苗11.主要内容主要内容:n1.3.1愈伤组织的诱导与器官分化愈伤组织的诱导与器官分化n1.3.1.1 愈伤组织诱导愈伤组织诱导n1.3.1.2 器官分化器官分化n1.3.2植物体细胞胚胎发生植物体细胞胚胎发生n1.3.2.1植物体细胞胚胎发生的方式植物体细胞胚胎发生的方式n1.3.2.2植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离n1.3.3离体器官诱导离体器官诱导n1.3.4影响植物离体形态发生的因素影响植物离体形态发生的因素12.n1.3.4.1植物种类和基因型植物种类和基因型n1.3.4.2培养材料的生理状态培养材料的生理状态n1.3.4.3培养基培养基n1.3.4.4培养条件培养条件13.1.3.1愈伤组织的诱导与器愈伤组织的诱导与器官分化官分化n一、基本概念一、基本概念n脱分化脱分化：具有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，细胞改变原来的分化状态，失去原有的结构与功能，转变为具有分生能力的细胞的过程。n愈伤组织：愈伤组织：植物各种器官的外植体在离体的条件下，细胞经脱分化等一系列过程，转变为分生细胞，进而转变形成一种能够迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团 一般低，植物各器官、组织都有被诱发产生愈伤一般低，植物各器官、组织都有被诱发产生愈伤组织的潜在可能性。组织的潜在可能性。14.自然条件下的植物愈伤组织自然条件下的植物愈伤组织刺桐树刺桐树15.1.3.1愈伤组织的诱导与器官分化一）、愈伤组织的诱导一）、愈伤组织的诱导 诱导愈伤组织的诱导愈伤组织的成败关键成败关键主要不是实验材料，而是主要不是实验材料，而是培养培养条件，其中条件，其中激素激素的成分和浓度是最重要的因素。的成分和浓度是最重要的因素。1、常用激素与浓度常用激素与浓度激素类型激素类型 激素浓度激素浓度生长素类（生长素类（2，4-D,IAA,NAA)0.0110 mg/L细胞分裂素类（玉米素，细胞分裂素类（玉米素，6-BA)0.110 mg/L16.2、影响愈伤组织诱导的因素：、影响愈伤组织诱导的因素：n1）、激素：）、激素：多数情况下，单独使用多数情况下，单独使用2，4-D可以成功诱导愈伤组织的发生可以成功诱导愈伤组织的发生案例案例1：MS培养基含有不同浓度培养基含有不同浓度2，4-D时斑茅幼叶形成愈伤组织的诱导率（时斑茅幼叶形成愈伤组织的诱导率（%）不同浓度的不同浓度的2，4-D对愈伤组织的诱导率是不同的。一般情况下，对愈伤组织的诱导率是不同的。一般情况下，2，4-D的浓度过低（低于的浓度过低（低于10-9mg/L）时，愈伤组织生长缓慢；浓度过高（高于）时，愈伤组织生长缓慢；浓度过高（高于10 mg/L）时，就会抑制愈伤组织的生长。）时，就会抑制愈伤组织的生长。17.n案例案例2.不同培养基及激素浓度对诱导扁桃花药愈伤组织的影响不同培养基及激素浓度对诱导扁桃花药愈伤组织的影响 n无论在无论在MS还是在还是在H或或B5培养基中，不附加激素培养基中，不附加激素2,4-D均不能诱均不能诱导扁桃花药愈伤组织的形成，导扁桃花药愈伤组织的形成，n扁桃花药在扁桃花药在H+1.0mg/L 2,4-D的培养基上诱导率最高为的培养基上诱导率最高为47%;在在MS+1.0mg/L 2,4-D培养基上诱导率为培养基上诱导率为67.0%;在在B5+0.51.0mg/L2,4-D，出愈率都在，出愈率都在84.0%以上，其中以以上，其中以2,4-D为为0.5mg/L时，出愈率高达时，出愈率高达100%.。说明在扁桃花药诱导过程中，说明在扁桃花药诱导过程中，最适基本培养基是最适基本培养基是B5，最佳，最佳 2,4-D浓度为浓度为0.5mg/L。18.研究表明：研究表明：n生长素与细胞分裂素对保持愈伤组织的生长素与细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是二者搭配使快速生长是必要的，特别是二者搭配使用时更能强烈刺激愈伤组织的形成。用时更能强烈刺激愈伤组织的形成。n在愈伤组织的诱导时，植物材料不同所在愈伤组织的诱导时，植物材料不同所用的植物生长调节物质不同，使用的浓用的植物生长调节物质不同，使用的浓度也不同。度也不同。19.2）.培养基培养基不同的培养基成分对植物不同器官的愈伤不同的培养基成分对植物不同器官的愈伤组织诱导存在着影响组织诱导存在着影响 20.二、愈伤组织的形成二、愈伤组织的形成 愈伤组织从增殖的组织细胞中产生，激愈伤组织从增殖的组织细胞中产生，激素改变细胞的新陈代谢状态，从生长静止素改变细胞的新陈代谢状态，从生长静止期到代谢旺盛。期到代谢旺盛。n从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：期：起动期起动期 （诱导期）、分裂期和分化期。（诱导期）、分裂期和分化期。n三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明显的差别。平均大小都有明显的差别。21.（1）诱导期（起动期、或起始期）诱导期（起动期、或起始期）:n 起动期：起动期：细胞准备分裂的时期，愈伤组织形成起细胞准备分裂的时期，愈伤组织形成起n 点。点。外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐渐停止分外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐渐停止分裂，开始执行它们各自不同的功能。外植体细胞一般处于静止状裂，开始执行它们各自不同的功能。外植体细胞一般处于静止状态，称为静止细胞。态，称为静止细胞。在外源植物激素的作用下，处于静止状态的植物细胞经过复在外源植物激素的作用下，处于静止状态的植物细胞经过复杂的脱分化过程恢复分裂能力转化为分生细胞。此过程有人称之杂的脱分化过程恢复分裂能力转化为分生细胞。此过程有人称之为：细胞的诱导活化过程。为：细胞的诱导活化过程。期，并发生同步分裂。22.n有人认为损伤是诱导细胞分裂的重要因素。受有人认为损伤是诱导细胞分裂的重要因素。受伤细胞释放出的物质与外源激素共同诱导细胞伤细胞释放出的物质与外源激素共同诱导细胞发生分裂，是诱导植物愈伤组织形成的主要原发生分裂，是诱导植物愈伤组织形成的主要原因。因。Brown（1972）认为静止细胞是具有分）认为静止细胞是具有分裂能力的，只是被存在的一类抑制物质所阻止，裂能力的，只是被存在的一类抑制物质所阻止，而使其分裂能力不能表现，如果除去抑制物质，而使其分裂能力不能表现，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能力。若加入抵消抑制物质影响就可恢复分裂能力。若加入抵消抑制物质影响的外源物质（激素），细胞就立即进行的外源物质（激素），细胞就立即进行DNA复复制，全部细胞进入制，全部细胞进入S23.处于起始期外植体24.特点：特点：n在诱导期，代谢活化了，细胞内的在诱导期，代谢活化了，细胞内的合成代谢加强，如合成代谢加强，合成代谢加强，如合成代谢加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。但迅速进行蛋白质和核酸的合成。但是细胞的大小仍然和外植体时一样，是细胞的大小仍然和外植体时一样，没有多大改变。没有多大改变。25.诱导期的长短诱导期的长短n由一系列由一系列内部（植物的种类、生理状况）内部（植物的种类、生理状况）和外部（光照、外源激素）因素和外部（光照、外源激素）因素决定。决定。例如例如：菊芋的诱导期有时还不需要：菊芋的诱导期有时还不需要1天，天，胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导期也发生改变。从间的改变，诱导期也发生改变。从11月月到次年到次年4月取菊芋块茎进行培养，则诱导月取菊芋块茎进行培养，则诱导期从期从22小时逐渐延长到小时逐渐延长到40小时。小时。26.改变诱导期长短改变诱导期长短n主要外因方面是添加一些生长物质主要外因方面是添加一些生长物质 Steward等等(1964)用用2,4-D及其及其类似的类似的生长调节生长调节物质处理处于物质处理处于静止状态的组织静止状态的组织，看到看到RNA的含量的含量很快明显地增加。很快明显地增加。并且并且2、4-D积累在分裂细胞的核仁中。积累在分裂细胞的核仁中。nYeoman 和和 Mitchell(1970)指出了指出了核核仁仁是生长物质的是生长物质的作用部位。作用部位。27.（2）分裂期：）分裂期：外植体外植体(explant)中中已分已分化的活细胞在外源激素化的活细胞在外源激素的作的作用下，外植体用下，外植体外层细胞外层细胞出现出现了分裂，由于外层细胞的了分裂，由于外层细胞的迅迅速分裂速分裂使得这些细胞的使得这些细胞的体积体积缩小，缩小，逐渐回复到逐渐回复到分生组织分生组织状态，状态，该时期细胞通过该时期细胞通过脱分脱分化化的起动期而进入的起动期而进入分裂，分裂，并并开始开始形成愈伤组织。形成愈伤组织。28.分裂期特征特征：生理生化上分裂期的一个明显特征生理生化上分裂期的一个明显特征是是外层细胞进行分裂外层细胞进行分裂，而，而中间的细胞不中间的细胞不分裂分裂。另外还有细胞数目增加，体积变。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大，小；细胞核和核仁增到最大，RNA含量含量达到最高等。达到最高等。此时期的愈伤组织：细胞分裂快，此时期的愈伤组织：细胞分裂快，结构疏散，缺少组织的结构，颜色浅结构疏散，缺少组织的结构，颜色浅而透明。而透明。29.分裂期愈伤组织分裂期愈伤组织30.（3）形成期（形成期）：）形成期（形成期）：n细胞分裂从分裂期的周缘细胞分细胞分裂从分裂期的周缘细胞分裂为主逐渐转向内部的组织细胞，裂为主逐渐转向内部的组织细胞，愈伤组织表层细胞分裂减缓或停愈伤组织表层细胞分裂减缓或停止，内部深层细胞分裂并形成像止，内部深层细胞分裂并形成像维管束或类似于分生组织组成的维管束或类似于分生组织组成的鸟巢状结构的次生组织。鸟巢状结构的次生组织。n此时期中细胞的伸展和分裂处于此时期中细胞的伸展和分裂处于平衡，故细胞的平均大小趋于稳平衡，故细胞的平均大小趋于稳定。定。31.形成期愈伤组织的特点：形成期愈伤组织的特点：n 生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。多转变为黄色甚至褐色。32.提醒：根据形态变化列出三个时期，实际上根据形态变化列出三个时期，实际上它们的界限并不分严格，特别是分裂期它们的界限并不分严格，特别是分裂期和分化期。一块培养组织的细胞既有分和分化期。一块培养组织的细胞既有分裂的又有分化的。裂的又有分化的。33.愈伤组织的类型：n 不同植物来源的愈伤组织，在质地、形态和不同植物来源的愈伤组织，在质地、形态和物理性状方面均有明显的差异。有的愈伤组织呈物理性状方面均有明显的差异。有的愈伤组织呈淡黄色或白色，有的愈伤组织呈绿色或红色。淡黄色或白色，有的愈伤组织呈绿色或红色。n 一般来说，来源于相同组织的愈伤组织含有一般来说，来源于相同组织的愈伤组织含有的色素大致相同，的色素大致相同，但经过反复继代培养后会失去但经过反复继代培养后会失去色素。色素。34.根尖愈伤组织（无色透明）茎尖愈伤组织（淡绿色）植物愈伤组织类型举例：植物愈伤组织类型举例：35.当归茎段愈伤组织（绿色）当归茎段愈伤组织（绿色）香茶菜愈伤组织香茶菜愈伤组织 锁阳愈伤组织（红色）锁阳愈伤组织（红色）36.影响植物愈伤组织形成的因素：影响植物愈伤组织形成的因素：1、同一植株不同器官形成愈伤组织的能力不同。例如：同一植株不同器官形成愈伤组织的能力不同。例如：君子兰君子兰 用用MS+2mg/L 6-BA+2mg/L NAA+1mg/L 2,4-D 固体培养基培养，茎尖、茎切块和叶固体培养基培养，茎尖、茎切块和叶片形成愈伤组织的诱导率分别为片形成愈伤组织的诱导率分别为85%、13%和和72%；若用；若用MS+5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+1mg/L 2,4-D 固体培养基培养固体培养基培养,三种外植体形成愈伤组织的诱三种外植体形成愈伤组织的诱导率分别为导率分别为82%、9%和和70%。这说明培养基中植。这说明培养基中植物生长物质组成的比例不同，直接影响着愈伤组织的形物生长物质组成的比例不同，直接影响着愈伤组织的形成。成。杨宁杨宁1等人的研究表明，等人的研究表明，植物扁桃（植物扁桃（Naporeil品种）的茎段、花药在适宜的培养基上能比较容易的诱品种）的茎段、花药在适宜的培养基上能比较容易的诱导出愈伤组织，导出愈伤组织，而叶肉组织则不能或难以诱导形成愈而叶肉组织则不能或难以诱导形成愈伤组织。伤组织。37.影响植物愈伤组织形成的因素：影响植物愈伤组织形成的因素：2、选择适宜基本培养基不仅影响愈伤组织的诱导，而且影响伤组、选择适宜基本培养基不仅影响愈伤组织的诱导，而且影响伤组织的生长。织的生长。于树宏和李玲（于树宏和李玲（1999）用浅绿色野葛叶片愈伤组织进行）用浅绿色野葛叶片愈伤组织进行继代培养，用继代培养，用MS+1mg/L NAA，愈伤组织呈浅绿色，新鲜健愈伤组织呈浅绿色，新鲜健壮；在培养基中同时加入壮；在培养基中同时加入3mg/L 6-BA 和和1mg/L NAA,愈伤组愈伤组织生长迅速，若培养时间较长，形成的愈伤组织呈白、硬颗粒状，织生长迅速，若培养时间较长，形成的愈伤组织呈白、硬颗粒状，部分会发生褐变死亡；但若将愈伤组织置于含相同浓度部分会发生褐变死亡；但若将愈伤组织置于含相同浓度6-BA和和NAA的的 B5 培养基上生长，愈伤组织可以始终保持新鲜健壮的外培养基上生长，愈伤组织可以始终保持新鲜健壮的外观，观，而且不断生长。而且不断生长。杨宁杨宁2等人用等人用MS培养基作为基本培养继进行当归愈伤组培养基作为基本培养继进行当归愈伤组织增殖培养的研究表明，单独使用一种生长素时，愈伤组织增殖织增殖培养的研究表明，单独使用一种生长素时，愈伤组织增殖很不明显；若只使用一种细胞分裂素时，愈伤组织均不见增殖，很不明显；若只使用一种细胞分裂素时，愈伤组织均不见增殖，并且生长状况也不佳；但将二者合理搭配使用时，愈伤组织不仅并且生长状况也不佳；但将二者合理搭配使用时，愈伤组织不仅增殖较明显，而且生长状况较佳。可见，兼用生长素和增殖较明显，而且生长状况较佳。可见，兼用生长素和6-BA增增效作用较明显效作用较明显 38.基本培养基对当归愈伤组织继代的影响基本培养基对当归愈伤组织继代的影响*注：注：“+”表示基本可以生长表示基本可以生长;“+”表示生长较好表示生长较好,继代较好；继代较好；“+”表示继代最好表示继代最好.*表中数据取材于杨宁等人的当归愈伤组织的增殖与分化培养表中数据取材于杨宁等人的当归愈伤组织的增殖与分化培养 39.不同激素组合对当归愈伤组织增殖的影响不同激素组合对当归愈伤组织增殖的影响*注：注：“+”表示基本可以生长表示基本可以生长;“+”表示生长较好表示生长较好,继代较好；继代较好；“+”表示继代最好表示继代最好.*表中数据取材于杨宁等人的当归愈伤组织的增殖与分化培养表中数据取材于杨宁等人的当归愈伤组织的增殖与分化培养 40.1.3.1.2 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生 n 愈伤组织培养物在某些条件下，可以愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分再分化产生不定芽或根的分生组织化产生不定芽或根的分生组织甚至是甚至是胚状体胚状体，继之，由这些有结构的组织而发育成继之，由这些有结构的组织而发育成苗或完整苗或完整小植株。小植株。n 愈伤组织通过愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式再分化形成再生植株的方式主要有三种：主要有三种：1)、先产生、先产生芽，芽，后在茎的基部长后在茎的基部长根根；2)先长先长根根，再长，再长芽芽；3)愈伤组织的不同部愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。位分别形成根和芽。41.一）、一）、愈伤组织形成愈伤组织形成 1、器官的形成、器官的形成 一般愈伤组织开始分化时，由一般愈伤组织开始分化时，由大小不大小不等等的细胞开始逐渐形成的细胞开始逐渐形成大小均匀的细胞大小均匀的细胞，保，保持持相对稳定状态。相对稳定状态。在分化时，愈伤组织的在分化时，愈伤组织的表层和内部表层和内部都可都可形成形成分生中心。芽分生中心。芽多发生在愈伤组织的多发生在愈伤组织的表层表层，属属外起源外起源。42.n根根发生在组织的发生在组织的深处深处，与整体植株发生，与整体植株发生类似，是类似，是内起源内起源。愈伤组织的愈伤组织的外部形态也随分化而改外部形态也随分化而改变变，一般由，一般由疏松转向紧密疏松转向紧密。43.二）、激素对愈伤组织分化的影响二）、激素对愈伤组织分化的影响n 植物生长调节物质在分化过程中的植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的作用是极为明显的，合适的植物生长物植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用。质配比在器官分化中起着重要的作用。如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当当6-BA的浓度是的浓度是NAA的的50100倍时，倍时，茎段的愈伤组织可以茎段的愈伤组织可以再分化出仔球，再分化出仔球，而而6-BA浓度浓度过高过高(150倍倍)或或过低过低(10倍倍)则则无仔球形成。无仔球形成。44.愈伤分化愈伤分化不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响45.器官分化的植物激素控制理论器官分化的植物激素控制理论n大量的实验结果表明：大量的实验结果表明：大多数植物组织或器官的再生作用符合器大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。官分化的植物激素控制理论。即：生长素与细胞分裂素的即：生长素与细胞分裂素的比例比例小时则产生小时则产生苗苗，比例大比例大时则生时则生根根，而两种激素的比例，而两种激素的比例适中适中时，时，则产生无结构的愈伤组织。则产生无结构的愈伤组织。46.外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽芽根根再生植株再生植株脱分化脱分化再分化再分化高生长素高生长素(1,2-D)高高(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)低低(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)器官发生途径器官发生途径47.植物物种和品种基因型影响愈伤组织的分化植物物种和品种基因型影响愈伤组织的分化n 程林梅等（程林梅等（2001）的研究表明，利用不同）的研究表明，利用不同基因型大豆品种的下胚轴作外植体进行组培时，基因型大豆品种的下胚轴作外植体进行组培时，培养基对愈伤组织的影响不明显；细胞分裂素培养基对愈伤组织的影响不明显；细胞分裂素（KT）和）和NAA的配比浓度对其愈伤组织的分的配比浓度对其愈伤组织的分化影响显著；不同基因型大豆植株再生作用差化影响显著；不同基因型大豆植株再生作用差异明显；外植体取材时间和取材部位对再生植异明显；外植体取材时间和取材部位对再生植株的形成也具有较大的影响，再生能力最强的株的形成也具有较大的影响，再生能力最强的取材部位时从子叶节到下胚轴取材部位时从子叶节到下胚轴6mm区段区段,当下当下胚轴长到胚轴长到23cm时取材最佳（见表时取材最佳（见表3-6）48.不同基因型、激素浓度对大豆植株再生的影响不同基因型、激素浓度对大豆植株再生的影响*资料来源资料来源:基因型和激素浓度对大豆植株再生的影响基因型和激素浓度对大豆植株再生的影响.程林梅等，植物学通报程林梅等，植物学通报2001.18(3):367-370.49.木本植物愈伤组织形态发生的人为调控木本植物愈伤组织形态发生的人为调控n 第一步：第一步：利用分化培养基（含有利用分化培养基（含有6-BA、CPPU、KT）使愈伤组织形成不定）使愈伤组织形成不定芽，增加繁殖系数。芽，增加繁殖系数。n 第二步：第二步：当不定芽长大出现叶片后，当不定芽长大出现叶片后，再将伸长的苗从基部切下转入含生长素再将伸长的苗从基部切下转入含生长素类（如类（如IAA、NAA）的生根培养基上培）的生根培养基上培养诱导根的生成。养诱导根的生成。50.芦荟愈伤组织形态发生的人为调控芦荟愈伤组织形态发生的人为调控 1、先用、先用MS培养附加不同浓度的培养附加不同浓度的6BA，促进不定，促进不定芽的生成。芽的生成。不同浓度不同浓度6-BA对库拉索芦荟增殖的影响对库拉索芦荟增殖的影响51.芦荟愈伤组织形态发生的人为调控芦荟愈伤组织形态发生的人为调控2、然后将抽枝的小植株转移到、然后将抽枝的小植株转移到MS附加不同浓度附加不同浓度NAA培养基上培养，诱导根的发生与生长培养基上培养，诱导根的发生与生长。不同浓度不同浓度NAA对库拉索芦荟生根的影响对库拉索芦荟生根的影响52.影响愈伤组织分化的其他因素影响愈伤组织分化的其他因素1）、生长素对维管组织分化过程有显著影响）、生长素对维管组织分化过程有显著影响.法国植物学家法国植物学家Camus（1949）最早将小营养芽）最早将小营养芽嫁接在一种菊苣属植物根的愈伤组织（由薄壁细胞构成）嫁接在一种菊苣属植物根的愈伤组织（由薄壁细胞构成）表面，营养芽经培养一段时间后分化出维管组织。表面，营养芽经培养一段时间后分化出维管组织。Wetmore等许多人的研究也证实芽之所以能诱等许多人的研究也证实芽之所以能诱导愈伤组织分化是因为它在生长时合成了某些植物激素。导愈伤组织分化是因为它在生长时合成了某些植物激素。一般说来生长素浓度和木质部发生之间存在着一般说来生长素浓度和木质部发生之间存在着一种反比关系，低浓度的生长素能刺激木质部的发生。一种反比关系，低浓度的生长素能刺激木质部的发生。生长素对维管组织分化所起的作用在很大程度上取决于生长素对维管组织分化所起的作用在很大程度上取决于糖的存在。在洋丁香愈伤组织培养时，如果灌注到愈伤糖的存在。在洋丁香愈伤组织培养时，如果灌注到愈伤组织顶面缺口里的琼脂含有组织顶面缺口里的琼脂含有0.05mg/L的的IAA和和1%的的蔗糖，愈伤组织只能形成很少的木质部分子。若保持生蔗糖，愈伤组织只能形成很少的木质部分子。若保持生长素浓度不变，而将蔗糖水平增加到长素浓度不变，而将蔗糖水平增加到2%，则有利于木，则有利于木质部的分化，但韧皮部很少。当蔗糖增至质部的分化，但韧皮部很少。当蔗糖增至2.5%3.5%时，木质部与韧皮部都可以分化形成，时，木质部与韧皮部都可以分化形成，而当蔗糖增至而当蔗糖增至4%时，只有韧皮部的分化。时，只有韧皮部的分化。53.影响愈伤组织分化的其他因素影响愈伤组织分化的其他因素2）细胞分裂素细胞分裂素能刺激大豆子叶愈伤组织木质部能刺激大豆子叶愈伤组织木质部的分化。的分化。3）IAA与激动素与激动素之间能协同影响烟草愈伤组织木之间能协同影响烟草愈伤组织木质部的分化形成。生长素与赤霉素对植物愈伤组质部的分化形成。生长素与赤霉素对植物愈伤组织的分化形成也存在着协同作用。乙烯也参与木织的分化形成也存在着协同作用。乙烯也参与木质部的形成，有人研究发现缺乏乙烯的番茄突变质部的形成，有人研究发现缺乏乙烯的番茄突变体植株木质部内没有导管，但正常植株是具有导体植株木质部内没有导管，但正常植株是具有导管的。管的。4）硝酸银硝酸银能抑制大豆愈伤组织木质部的分化，能抑制大豆愈伤组织木质部的分化，加入蛋氨酸可以克服硝酸银的抑制作用。加入蛋氨酸可以克服硝酸银的抑制作用。54.四四、愈伤组织的培养愈伤组织的培养一）、培养基一）、培养基培养基培养基一般包括一般包括大量大量元素、元素、微量微量元素和一种元素和一种碳水化碳水化合物合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。，最常用的碳水化合物是蔗糖。这样简单的培养基这样简单的培养基(基本培养基基本培养基)只有很少几种植物只有很少几种植物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各种各样的附加物（种各样的附加物（完全培养基），完全培养基），如维生素、氨基如维生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、螯合剂酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、螯合剂如如EDTA、各种营养性的提取物如椰子汁等。、各种营养性的提取物如椰子汁等。55.注意：注意：选用完全已知的合成化合物，不大主张用复杂选用完全已知的合成化合物，不大主张用复杂的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。必须强调：必须强调：适合于诱发愈伤组织的培养基不一定适合于维适合于诱发愈伤组织的培养基不一定适合于维持这些愈伤组织；适合于液体培养的培养基也不一持这些愈伤组织；适合于液体培养的培养基也不一定适合于固体培养。定适合于固体培养。56.培养基中的培养基中的N，大多数都用，大多数都用硝态氮硝态氮，只有，只有MS培养培养基和基和B5培养基中才用培养基中才用硝态和铵态硝态和铵态的混合物。的混合物。K的水平在近代的培养基中有逐渐的水平在近代的培养基中有逐渐提高提高的趋势。的趋势。实验表明：各种离子浓度大为不同的培养基往往能实验表明：各种离子浓度大为不同的培养基往往能使相同的组织快速生长。使相同的组织快速生长。例如例如Hildebrandt培养基与培养基与MS培养基显著不同，但培养基显著不同，但二者都能培养烟草的愈伤组织。二者都能培养烟草的愈伤组织。57.n注意：注意：1）、激素的种类和用量的添加）、激素的种类和用量的添加2）、一般诱导愈伤常添加）、一般诱导愈伤常添加2.4-D58.二）、愈伤的培养方式：二）、愈伤的培养方式：1、按培养基的物理状态，愈伤组织培、按培养基的物理状态，愈伤组织培 养分养分为固体和液体培养两大类。为固体和液体培养两大类。液体培养又分液体培养又分静止和振荡培养静止和振荡培养的二类。的二类。固体培养固体培养液体静止培养液体静止培养59.l继代培养（传代）：继代培养（传代）：愈伤组织在培养基愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于养分的枯竭，上生长一段时间后，由于养分的枯竭，水分的散失，组织代谢产物的积累，影水分的散失，组织代谢产物的积累，影响愈伤组织生长，因此必须将组织转移响愈伤组织生长，因此必须将组织转移到新的培养基上。到新的培养基上。一般在一般在25-28下进行固体培养时，每下进行固体培养时，每隔隔4-5周进行一次继代培养。周进行一次继代培养。60.组织块较小时，继代培养时可将整块组织组织块较小时，继代培养时可将整块组织转移。组织块较大时，可先将组织分成几小块再转移。组织块较大时，可先将组织分成几小块再接种。接种。继代培养必须及时进行，长期不传代常常继代培养必须及时进行，长期不传代常常由于代谢产物的累积，对组织起毒害作用，某些由于代谢产物的累积，对组织起毒害作用，某些植物愈伤组织的褐化现象即往往由此引起的。褐植物愈伤组织的褐化现象即往往由此引起的。褐化的愈伤组织反复地进行继代培养，可使愈伤组化的愈伤组织反复地进行继代培养，可使愈伤组织恢复活力而迅速生长织恢复活力而迅速生长61.n理论上愈伤组织是可以无限制继代，但理论上愈伤组织是可以无限制继代，但愈伤组织继代次数增加，形态发生能力愈伤组织继代次数增加，形态发生能力逐渐丧失。逐渐丧失。n原因：原因：遗传因素即继代培养中通常出现遗传因素即继代培养中通常出现 染色体紊乱。染色体紊乱。62.易产生：易产生：染色体出现多倍体和非整倍体染色体出现多倍体和非整倍体遗传上表现不稳定：遗传上表现不稳定：63.n四、培养条件四、培养条件n光照：光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，分化愈伤组织的诱导需弱光或不需光，分化需需光。继代培养一般需光。此时光对器官的作用是光。继代培养一般需光。此时光对器官的作用是一种诱导反应。一种诱导反应。n温度：温度：一般采用一般采用2428的恒温条件进行。的恒温条件进行。n湿度：湿度：较大，以免引起培养基干缩。较大，以免引起培养基干缩。64.思考题思考题n思考题思考题1.名词解释：愈伤组织名词解释：愈伤组织 胚状体胚状体 脱分化脱分化2.愈伤组织培养对外植体有何要求？愈伤组织培养对外植体有何要求？3.愈伤组织形态发生有哪些情况？愈伤组织形态发生有哪些情况？4.简述愈伤组织细胞分化。简述愈伤组织细胞分化。65.