第十八章基因诊断与基因治疗gene课件

第十八章基因第十八章基因诊断与基因断与基因治治疗gene第十八章基因诊断与基因治疗gene第十八章基因诊断与基因治疗本章讨论二大方面内容 基因基因诊诊断断 基因治基因治疗疗2本章讨论二大方面内容 基因诊断2 一一.基因基因诊诊断概念断概念 ：利用利用现现代分子生物学和分子代分子生物学和分子遗传遗传学的技学的技术术方法，直接方法，直接检测检测基因基因结结构及其表达水平是否异常，从构及其表达水平是否异常，从而而对对疾病作出疾病作出诊诊断的方法。断的方法。第一第一节节 基基 因因 诊诊 断断3 第一节 二二.基因基因诊诊断特点：断特点：针对针对性性强强，特异性高，特异性高 检测检测灵敏度和精确性高灵敏度和精确性高 实实用性用性强强，诊诊断范断范围围广广 4二.基因诊断特点：4三三.基因基因诊诊断常用技断常用技术术方法方法 核酸分子核酸分子杂杂交技交技术术 聚合聚合酶酶链链反反应应（PCRPCR）技）技术术 生物芯片生物芯片 基因基因测测序序5三.基因诊断常用技术方法 （一）核酸分子（一）核酸分子杂杂交技交技术术 核酸分子核酸分子杂杂交交 是指是指单链单链核酸分子（核酸分子（DNA或或RNA）在特定条件下，与另一条互）在特定条件下，与另一条互补补的特异核酸的特异核酸链链形成形成稳稳定双定双链链的的过过程。程。主要依据：主要依据：碱基互碱基互补补、变变性和复性性和复性 DNA与与DNA杂杂交：交：A=T、GC;DNA与与RNA杂杂交交:A=U、GC;变变性：性：在一定温度下，使核酸双在一定温度下，使核酸双链链解开解开为为两条两条单链单链；复性：复性：随温度逐随温度逐渐渐恢复，恢复，变变性的两条性的两条单链单链重新形成互重新形成互补补双双链链碱基互碱基互补补6（一）核酸分子杂交技术碱基互补6 hybridizationDNA:DNA 5 A T G C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C7 hybridization 利用核酸双利用核酸双链链的碱基互的碱基互补补、变变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链单链核酸片段作核酸片段作为为探探针针，与待与待测样测样本中的本中的单链单链核酸互核酸互补补配配对对，以判断有无互，以判断有无互补补的同源核酸序列的存在。的同源核酸序列的存在。核酸探核酸探针针 是指是指带带有有标记标记的某一特定的某一特定DNA或或RNA片断，能与待片断，能与待测样测样本中本中单链单链核酸分子互核酸分子互补补配配对结对结合，合，进进而而检检测测同源序列。同源序列。探探针标记针标记物物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧荧光素等）两大光素等）两大类类。8 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可 1.1.核酸分子核酸分子杂杂交的分交的分类类 液相液相杂杂交：交：待待测测核酸核酸样样本与特异性探本与特异性探针针同同时时溶于溶于杂杂交液中交液中进进行行杂杂交反交反应应；固相固相杂杂交：交：待待测测核酸核酸样样本先本先结结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进针进行行杂杂交反交反应应。常用固相常用固相杂杂交支持物：交支持物：硝酸硝酸纤维纤维素膜、尼素膜、尼龙龙膜等膜等 9 1.核酸分子杂交的分类92.2.核酸分子核酸分子杂杂交（固相交（固相杂杂交）操作程序交）操作程序制制备备待待测测核酸核酸样样品品分离、分离、变变性、性、转转移、固化移、固化DNA片段片段杂杂交交加入加入标记标记核酸探核酸探针针检测杂检测杂交信号交信号标记标记核酸探核酸探针针预杂预杂交交制制备备核酸探核酸探针针漂洗去除未参与漂洗去除未参与杂杂交的交的标记标记探探针针102.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变 3.3.常用固相核酸常用固相核酸杂杂交方法交方法 Southern 印迹印迹杂杂交法（交法（Southern blotting）Northern 印迹印迹杂杂交法（交法（Northern blotting）斑点斑点杂杂交或狭交或狭缝杂缝杂交法交法 （Spot/Slot blot hybridization）菌落菌落杂杂交（交（colony hybridization）夹夹心心杂杂交法（交法（sanwich hybridization）原位原位杂杂交（交（nucleic acid hybridization in situnucleic acid hybridization in situ）11 3.常用固相核酸杂交方法11 (1)Southern 印迹印迹杂杂交法交法 （Southern blotting）限制性内切酶酶切 检测杂检测杂交信号交信号 提取提取DNADNA Southern 法可用于法可用于检测检测特异的特异的DNA序列片断、基因定位、分子量序列片断、基因定位、分子量测测定等。定等。12 (1)Southern 印迹杂交法 （Sout（2 2）Northern Northern 印迹印迹杂杂交法交法 （Northern blotting Northern blotting）（其基本（其基本过过程程类类似于上述似于上述SouthernSouthern法）法）提取提取RNARNA样样本本RNARNA变变性性琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳分离泳分离转转移至膜移至膜探探针针（标记标记DNADNA或或RNARNA）与之）与之杂杂交交显显影或影或显显色色检测检测信号。信号。Northern Northern法可用于法可用于检测组织细胞中胞中总RNARNA或或mRNAmRNA 13（2）Northern 印迹杂交法13（3 3）斑点）斑点杂杂交或狭交或狭缝杂缝杂交法：交法：基本基本过过程：程：将将变变性的性的DNADNA或或RNARNA直接点到固相支持直接点到固相支持滤滤膜上膜上用用标记标记探探针针与之与之杂杂交交自自显显影或影或显显色反色反应应检检测杂测杂交信号交信号分析分析结结果。果。优优点：点：简简便、快速、灵敏、便、快速、灵敏、样样本用量少；本用量少；缺点：缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。1414（4 4）菌落）菌落杂杂交（交（colony hybridizationcolony hybridization）该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。15（4）菌落杂交（colony hybridization）该（5 5）夹夹心心杂杂交法（交法（sanwich hybridizationsanwich hybridization）ABREREREREABAB固相支持物片段片段B捕捉探捕捉探针针 片断片断A 检测检测探探针针 本法本法优优点：点：特异性特异性强强，对样对样本本纯纯度要求不高，定量度要求不高，定量较较准确。准确。16（5）夹心杂交法（sanwich hybridization（6 6）原位）原位杂杂交（交（nucleic acid hybridization in situnucleic acid hybridization in situ）将将标记标记探探针针与与细细胞或胞或组织组织切片中的核酸切片中的核酸进进行行杂杂交，交，进进而而检测检测特异的特异的DNADNA或或RNARNA序列。序列。细细胞原位胞原位杂杂交交 组织组织切片原位切片原位杂杂交交 DNA-DNA DNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA 三三类杂类杂交交 RNA-RNA RNA-RNA 该该法法优优点：点：不需提取核酸，故可完整保持不需提取核酸，故可完整保持组织组织或或细细胞的形胞的形态态，因而更能准确地反映，因而更能准确地反映组织细组织细胞的功能状胞的功能状态态。有有17（6）原位杂交（nucleic acid hybridiza（二）聚合（二）聚合酶酶链链反反应应(PCR，polymerase chain reaction)技技术术 PCRPCR是体外基因是体外基因扩扩增技增技术术。它利用体内。它利用体内DNADNA复制的原理和复制的原理和DNADNA变变性与复性的性性与复性的性质进质进行目的基因行目的基因DNADNA的的大量大量扩扩增。增。1.PCR 1.PCR基本原理：基本原理：PCR技技术术在模板、在模板、dNTPdNTP、MgMg2+2+等条件下，用耐等条件下，用耐热热的的TaqTaq酶酶代替代替DNADNA聚合聚合酶酶，用合成的，用合成的DNADNA引物代替引物代替RNARNA引物，引物，经过经过DNADNA变变性、性、引物与引物与模板模板结结合（复性）和延伸合（复性）和延伸3 3个步个步骤骤的循的循环过环过程（程（2525 3030个循个循环环），目的），目的DNADNA可可扩扩增增100100万倍以上。万倍以上。18（二）聚合酶链反应(PCR，polymerase chain（1 1）DNADNA模板的模板的变变性性 将待将待扩扩增增DNADNA加加热热到到95950 0C C左右，使双左右，使双链链DNADNA解开成解开成为单链为单链（即：使模板（即：使模板DNADNA或延伸后的双或延伸后的双链链DNADNA发发生生热变热变性性），并游离于反），并游离于反应应体系中作体系中作为为模板；模板；（2 2）模板与引物的）模板与引物的结结合（退火或复性）合（退火或复性）将将体体系系温温度度降降至至合合适适温温度度（55550 0C C左左右右），使使加加入入的的引引物物与与模模板板DNADNA两两端端（33端端）碱碱基基序序列列互互补补结结合合。（由于加入的引物量（由于加入的引物量远远多于模板量，所以引物与模板的多于模板量，所以引物与模板的结结合比例合比例远远大于模板自身的复性）；大于模板自身的复性）；19（1）DNA模板的变性19（3 3）引物延伸）引物延伸 将将体体系系温温度度升升到到72720 0C C左左右右，TaqTaq聚聚合合酶酶催催化化dNTPdNTP按按碱碱基基互互补补原原则则连连接接在在DNADNA引引物物33端端，使使引引物物延延伸，形成两条与模板互伸，形成两条与模板互补补的新的新链链。以上以上为为一次一次PCRPCR循循环环（变变性、复性和延伸）性、复性和延伸）（新合成的（新合成的链链可作可作为为下一下一轮轮循循环环的模板）的模板）按照上述步按照上述步骤骤重复操作，重复操作，PCR产产物呈指数物呈指数扩扩增。模板增。模板DNA 扩扩增倍数增倍数T=2n(n:循循环环次数次数)。20（3）引物延伸20 PCRPCR技技术术原理示意原理示意图图21 PCR技术原理示意图21 2.PCR 2.PCR各要素及其作用各要素及其作用（1 1）模板模板 PCR PCR模板可以是模板可以是DNADNA或或RNARNA。以以线线性性DNADNA模板模板为为佳，量适中，一般佳，量适中，一般为为10102 2 10105 5个拷个拷贝贝；RNA RNA作作为为模板模板时时，需要：，需要：RNA cDNA PCR,RNA cDNA PCR,称此称此为为RT-PCR.RT-PCR.（2 2）耐）耐热热DNADNA聚合聚合酶酶(Taq DNA(Taq DNA聚合聚合酶酶)是是从从耐耐热热细细菌菌体体内内提提取取的的一一种种DNA聚聚合合酶酶，可可在在95稳稳定定30分分钟钟。从从而而保保证证PCR在在9494变变性性 55退火退火7171延伸延伸 循循环环30次次过过程中不程中不变变性失活。性失活。在在PCR中，中，Taq DNA聚合聚合酶酶应应用最广泛。用最广泛。逆逆转录转录22 2.PCR各要素及其作用 逆转录22（3 3）引物）引物 引物是根据已知序列的模板引物是根据已知序列的模板DNADNA待待扩扩增区两端而增区两端而设计设计的一的一对对寡核苷酸小片断，寡核苷酸小片断，长长度一般度一般为为1515 3030个碱基。个碱基。引物是引物是保保证证PCRPCR扩扩增增产产物的大小和特异性的关物的大小和特异性的关键键因素，其因素，其设计设计与合成与合成对对PCRPCR的成功至关重要。的成功至关重要。引物引物设计设计原原则则如下：如下：23（3）引物23 引物引物设计应设计应符合以下基本原符合以下基本原则则：长长度适宜，一般度适宜，一般为为15 30个碱基；个碱基；G+C含量，一般含量，一般为为40 60；4种碱基种碱基应应随机性分布；随机性分布；引物自身不引物自身不应应存在互存在互补补序列；序列；两个引物之两个引物之间间不不应应有多于有多于4个碱基的互个碱基的互补补；引物引物3端不端不应应有任何修有任何修饰饰；引物引物5可以修可以修饰饰。24 引物设计应符合以下基本原则：24（4 4）缓缓冲溶液与冲溶液与MgMg2+2+PCR PCR技技术术常用常用1010 50mmol/L Tris-HCl50mmol/L Tris-HCl、Ph8.3Ph8.3 8.888.88、偏碱、偏碱缓缓冲液；并含有一定量的冲液；并含有一定量的MgMg2+2+浓浓度；度；（5 5）dNTPdNTP浓浓度度 PCRPCR一般用一般用5050 200200mol/Lmol/L的的dNTPdNTP；并且；并且4 4种种dNTPdNTP浓浓度度应应相等；相等；25（4）缓冲溶液与Mg2+25（6 6）参数）参数 变变性温度与性温度与时间时间 一般一般选择选择：94 940 0C C，30 30秒秒 退火温度与退火温度与时间时间 取决于引物取决于引物长长度、度、浓浓度度 和和G+CG+C含量，含量，一般一般选择选择：Tm-5 Tm-5 延伸温度与延伸温度与时间时间 一般一般选择选择：70 70 7575循循环环次数次数 取决于模板取决于模板浓浓度，度，一般循一般循环环：3030次次26（6）参数26 PCRPCR操作操作 各种各种PCRPCR反反应应的操作基本相同，只是根据的操作基本相同，只是根据 引物与靶序列不同，引物与靶序列不同，选择选择不同的反不同的反应应体系和循体系和循环环参数。参数。将将PCRPCR反反应应管置于管置于DNADNA自自动动化化热热循循环仪环仪上，上，输输入各种循入各种循环环参数，使参数，使DNADNA扩扩增在增在热热循循环仪环仪上很方便地完成。上很方便地完成。PCR PCR技技术优术优点点 特异性特异性强强、灵敏度高、操作、灵敏度高、操作简简便、省便、省时时，对样对样本本质质量要求不高，能快速、特异地量要求不高，能快速、特异地扩扩增任何增任何DNADNA片断。片断。PCR PCR缺点缺点 由于高灵敏度，使易出由于高灵敏度，使易出现现假阴性或假阳性假阴性或假阳性结结果。果。27 3.PCR3.PCR产产物分析物分析（1 1）凝胶）凝胶电电泳分析法泳分析法 可用可用琼琼脂糖（脂糖（AgroseAgrose）或聚丙）或聚丙烯酰烯酰胺（胺（PAGEPAGE）凝胶）凝胶电电泳泳检测检测PCRPCR扩扩增增产产物的大小。物的大小。同同时时应应以以标标准准DNADNA分分子子量量作作平平行行对对照照，凝凝胶胶中中加加入入溴溴化化乙乙锭锭，电电泳泳后后，紫紫外外检检测测仪仪下下观观察察结结果果并拍照。并拍照。（在待（在待检检靶序列拷靶序列拷贝贝数多、且数多、且仅扩仅扩增出一条增出一条带时带时，用此法即可，用此法即可满满足足检测检测要求。）要求。）28 3.PCR产物分析28（2 2）点）点杂杂交分析法交分析法 该该法有法有2 2种：种：将将扩扩增增产产物直接固定在膜上，每一个探物直接固定在膜上，每一个探针针制制备备一一张张膜，然后用不同的特异探膜，然后用不同的特异探针进针进行行杂杂交；交；将不同的探将不同的探针针固定在膜上，再用有固定在膜上，再用有标记标记的的PCRPCR产产物物 与之与之杂杂交。交。本法有助于本法有助于检测检测突突变变DNADNA类类型，用于人型，用于人类遗传类遗传病病诊诊断合某些基因的分析。断合某些基因的分析。(当当扩扩增增产产物物时时多条多条带时带时，用此法更合适。，用此法更合适。)29（2）点杂交分析法29 (三三)生物芯片生物芯片 DNADNA芯片或基因芯片属于生物芯片的一芯片或基因芯片属于生物芯片的一类类。30 (三)生物芯片 30 (四四)基因基因测测序序 即，即，DNADNA碱基序列分析，碱基序列分析，这这是最确切、最直接的基因是最确切、最直接的基因诊诊断方法。断方法。目前常用的方法目前常用的方法为为Maxam-GilbertMaxam-Gilbert建立的化学裂解法和建立的化学裂解法和SangerSanger建立的双脱氧末端建立的双脱氧末端终终止法。止法。31 四四.基因基因诊诊断的断的临临床床应应用用(一一)遗传遗传病的基因病的基因诊诊断断(二二)肿肿瘤的基因瘤的基因诊诊断断(三三)感染性疾病的基因感染性疾病的基因诊诊断断32 四.基因诊断的临床应用(一)遗传病的基因 举举例：例：镰镰刀状刀状红细红细胞胞贫贫血血 珠蛋白基因的第六个密珠蛋白基因的第六个密码码子子A ATT 表达表达产产物：谷氨酸物：谷氨酸缬缬氨酸氨酸 一个碱基突一个碱基突变变缺失缺失1个个MstMst内切内切酶酶位点位点 正常人：正常人：1.1kb 1.1kb 患者：患者：1.3kb 1.3kb33 举例：33 53 53 1.1 kb 1.3kb Mst II酶酶切位点（切位点（CCTNATG）正常基因正常基因突突变变基因基因1.3kb1.1kb0.2kb123 1、正常人、正常人 2、突、突变变携携带带者者 3、患者、患者34 第二第二节节 基因治基因治疗疗 基因治基因治疗疗的概念的概念 基因治基因治疗疗的的总总体策略体策略 基因治基因治疗疗的基本程序的基本程序 基因治基因治疗疗的的现现状与展望状与展望35 第二节 基因治疗35一、基因治疗概念 狭狭义义概念概念 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。广广义义概念概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。36一、基因治疗概念36二、基因治二、基因治疗疗的的总总体策略体策略 基因基因矫矫正正 基因置基因置换换 基因增基因增补补 基因失活基因失活 “自自杀杀基因基因”的的应应用用 免疫基因治免疫基因治疗疗 耐耐药药基因治基因治疗疗 37二、基因治疗的总体策略37（一）基因（一）基因矫矫正（正（gene correctiongene correction）对对于致病基因中的异常碱基于致病基因中的异常碱基进进行精确修复，使其恢复正常功能；行精确修复，使其恢复正常功能；（二）基因置（二）基因置换换（gene replacementgene replacement）用正常基因在原位替用正常基因在原位替换换致病基因，使致病基因，使细细胞胞DNA完全恢复正常状完全恢复正常状态态；38（一）基因矫正（gene correction）38（三）基因增（三）基因增补补（gene augmentation）将正常基因将正常基因导导入患者体入患者体细细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿补偿缺陷基因的功能缺陷基因的功能，但致病基因未去除。但致病基因未去除。（四）基因失活（四）基因失活（gene inactivation）：）：指将特定的反指将特定的反义义核酸核酸导导入入细细胞，通胞，通过过碱基互碱基互补补作用与作用与mRNA结结合，阻断合，阻断肿肿瘤瘤细细胞中基因的胞中基因的异常表达，以抗异常表达，以抗肿肿瘤、抗病毒。瘤、抗病毒。反反义义RNA:干干扰扰mRNA的互的互补补RNA;反反义义DNA:干干扰扰DNA的互的互补补DNA.39（三）基因增补（gene augmentation）39（五）（五）“自自杀杀基因基因”的的应应用用 自自杀杀基因基因 这这种基因种基因导导入受体入受体细细胞后可胞后可产产生一种生一种酶酶，它可将，它可将原无原无细细胞毒性或低毒胞毒性或低毒药药物前体物前体转转化化为细为细胞毒物胞毒物质质，将，将细细胞受体胞受体细细胞胞杀杀死，死，这这种基因被称种基因被称为为“自自杀杀基因基因”。自自杀杀基因基因导导入入肿肿瘤瘤细细胞后，可将胞后，可将肿肿瘤瘤细细胞胞杀杀死。死。但但对对正常正常细细胞胞则则无无伤伤害作用。害作用。40（五）“自杀基因”的应用40（六）免疫基因治（六）免疫基因治疗疗 将某些将某些细细胞因子（胞因子（IL-2IL-2、GM-CSFGM-CSF等）基因等）基因导导入入肿肿瘤患者体内，以增瘤患者体内，以增强强患者的抵抗力。患者的抵抗力。（七）耐（七）耐药药基因治基因治疗疗 在在肿肿瘤化瘤化疗过疗过程中，程中，把把产产生抗生抗药药物毒性的基因物毒性的基因导导入患者体内，从而使患者能耐受更大入患者体内，从而使患者能耐受更大剂剂量的量的化化疗疗。41（六）免疫基因治疗41 三、三、基因治基因治疗疗的基本程序的基本程序（一）治（一）治疗疗性基因的性基因的获获得得 在了解疾病在了解疾病发发生的分子机制基生的分子机制基础础上，上，选择对选择对疾病有治疾病有治疗疗作用的特定基因。作用的特定基因。如，如，对单对单基因缺陷基因缺陷遗传遗传病，可用野生型（非突病，可用野生型（非突变变）基因即可用于治）基因即可用于治疗疗；对对于于肿肿瘤，最好瘤，最好选择选择某些与某些与该类肿该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗疗。治治疗疗性基因性基因获获得的方法很多：得的方法很多：用用酶酶切或探切或探针杂针杂交法从基因交法从基因组组DNADNA文文库获库获得，从得，从cDNAcDNA文文库获库获取，取，PCRPCR扩扩增，人工合成等。增，人工合成等。42 三、基因治疗的基本程序42（二）基因（二）基因载载体的体的选择选择 基因治基因治疗疗关关键键步步骤骤之一，是将治之一，是将治疗疗基因高效基因高效转转移移入患者体内、并能入患者体内、并能调调控其适度表达。控其适度表达。常用的常用的载载体有两体有两类类：病毒：病毒载载体和非病毒体和非病毒载载体。体。病毒病毒载载体：逆体：逆转录转录病毒病毒载载体，体，腺病毒腺病毒载载体，体，腺相关病毒腺相关病毒载载体等；体等；非病毒非病毒载载体：体：与病毒与病毒载载体的主要区体的主要区别别在于：采用理化方法将治在于：采用理化方法将治疗疗基因基因转转移入患者体内。移入患者体内。43（二）基因载体的选择43（三）靶（三）靶细细胞的胞的选择选择 基因治基因治疗疗的受体的受体细细胞有生殖胞有生殖细细胞和体胞和体细细胞两大胞两大类类。对对生殖生殖细细胞胞进进行基因治行基因治疗疗，可使，可使该该生殖生殖细细胞分化胞分化发发育成育成长长的个体及其后代均具有正常基因，的个体及其后代均具有正常基因，理理论论上上讲讲是根治是根治遗传遗传病的理想方法。病的理想方法。但由于涉及安全性和但由于涉及安全性和伦伦理学理学问题问题，目前基因治，目前基因治疗疗中禁止使用生殖中禁止使用生殖细细胞作胞作为为靶靶细细胞，只限于胞，只限于使用体使用体细细胞。胞。44（三）靶细胞的选择44 人人类类基因治基因治疗疗中，将治中，将治疗疗基因基因导导入靶入靶细细胞有两种胞有两种途径。途径。一种一种为为直接体内直接体内疗疗法（法（in vivoin vivo）：）：即，将治即，将治疗疗基因直接基因直接导导入体内有关入体内有关组织细组织细胞；胞；另一种另一种为间为间接体内接体内疗疗法（法（ex vivoex vivo）：）：即，在体外先将治即，在体外先将治疗疗基因基因导导入培养的靶入培养的靶细细胞内，再将已胞内，再将已获获得表达外源基因的得表达外源基因的遗传遗传修修饰细饰细胞回胞回输输入病人体内，达到治入病人体内，达到治疗疗目的。目的。45 人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种45 治治疗疗基因基因导导入受体入受体细细胞的方法胞的方法 化学方法化学方法物理方法物理方法膜融合法膜融合法病毒病毒载载体法体法质质粒粒DNA直接直接转转移法移法（四）基因（四）基因转转移方法移方法 磷酸钙法 DEAE葡聚糖法 电穿孔法 粒子轰击法（基因枪法）46 (五五)转导细转导细胞的胞的选择鉴选择鉴定定 标记标记基因技基因技术术 基因缺陷型受体基因缺陷型受体细细胞技胞技术术 基因共基因共转转染技染技术术 分子分子杂杂交技交技术术 外源基因表达外源基因表达鉴鉴定定 (六六)回回输输体内体内 将治将治疗疗性基因修性基因修饰饰的的细细胞以不同方式回胞以不同方式回输输体内。体内。47 (五)转导细 四、基因治四、基因治疗疗的的应应用与展望用与展望 (一一)基因治基因治疗应满疗应满足的条件：足的条件：1 1、单单基因缺陷疾病基因缺陷疾病 2 2、仅仅限体限体细细胞的基因治胞的基因治疗疗 3 3、靶、靶细细胞易胞易获获取、培养、及回取、培养、及回输输体内。体内。4 4、治、治疗疗效果效果应胜过对应胜过对病人的危害。病人的危害。5 5、表达水平无需、表达水平无需调调控且无副作用。控且无副作用。6 6、需、需经动经动物物实验验证实验验证安全可行。安全可行。48 四、基因治疗的应用与展望48 （二）基因治（二）基因治疗疗有待解决的有待解决的问题问题 1 1、难难以以获获得真正有治得真正有治疗疗作用的基因。作用的基因。2 2、外源基因的表达、外源基因的表达难难以在体内精确以在体内精确调调控。控。3 3、体、体细细胞胞经经体外培养后，其生物学特性会有体外培养后，其生物学特性会有 改改变变。4 4、过过多的外源蛋白多的外源蛋白对对机体机体带带来可能的影响。来可能的影响。5 5、随机整合潜在的威、随机整合潜在的威胁胁。49 （二）基因治疗有待解决的问题49 50 Eggs are coaxed to mature in a culture dish.Each has a remnant egg cell called the polar body and cumulus cells from the ovary clinging to it.51Eggs are coaxed to mature in a While an egg is held still with a pipette,a needle is used to drill through the zona pellucida,removing a plug.52 While an egg is held still After ejecting the zona plug,the needle is inserted back in the egg through the hole to withdraw and discard the polar body and the eggs genetic material.53 After ejecting the zona plug A cumulus cell from another egg is taken up into the needle.Cells called fibroblasts(or their nuclei)can also be used in this step.54 A cumulus cell from another The cumulus cell is injected deep into the egg that has been stripped of its genetic material.55 The cumulus cell is injected The injected egg is exposed to a mixture of chemicals and growth factors designed to activate it to divide.56 The injected egg is exposed After roughly 24 hours,the activated egg begins dividing.The cells contain genetic material only from the injected cumulus cell.57 After roughly 24 hours,the By the fourth or fifth day,a hollow ball of roughly 100 cells has formed.It holds a clump of cells called the inner cell mass that contains stem cells.58 By the fourth or fifth day,The blastocyst is broken open,and the inner cell mass is grown in a culture dish to yield stem cells.59 The blastocyst is broken ope The stem cells,in turn,can be coaxed to grow into a variety of cells that might one day be injected into patients.-60 The stem cells,in turn,can 基因基因诊诊断与基因治断与基因治疗疗（课课堂堂练习练习）1.1.核酸分子核酸分子杂杂交主要内容有交主要内容有A.A.制制备备核酸核酸样样本本 B.B.制制备备与与标记标记特异探特异探针针B.B.C.C.核酸核酸样样本的分离、本的分离、变变性、性、转转移和固定移和固定D.D.预杂预杂交、交、杂杂交和漂洗交和漂洗 E.E.检测杂检测杂交信号交信号2.2.下列是常用核酸下列是常用核酸杂杂交方法的用途，交方法的用途，错误错误的是的是A.A.Southern Southern 印迹印迹杂杂交法可用于交法可用于检测检测特异特异RNARNA序列片断序列片断 B.B.Southern Southern 印迹印迹杂杂交法可用于交法可用于检测检测特异特异DNADNA序列片断序列片断C.C.NorthernNorthern印迹印迹杂杂交法可用于交法可用于检测检测DNADNA或或RNARNAD.D.NorthernNorthern印迹印迹杂杂交法可用于交法可用于检测检测RNARNAE.E.原位原位杂杂交法可用于交法可用于检测组织细检测组织细胞中的胞中的DNADNA或或RNARNA61 基因诊断与基因治疗（课堂练习）613.3.以下是关于以下是关于PCRPCR技技术术的叙述，的叙述，错误错误是是A.A.PCR PCR技技术进术进行体外行体外DNADNA扩扩增，其增，其过过程不同于体内程不同于体内DNADNA复制复制过过程程B.B.需要目的需要目的DNADNA两条两条链为链为模板模板C.C.需需Taq Taq 酶酶代替代替DNADNA聚合聚合酶酶D.D.需需RNARNA引物代替引物代替DNADNA引物引物E.E.PCR PCR需要需要DNADNA变变性、复性和延伸性、复性和延伸3 3个步个步骤骤的反复循的反复循环环4.4.基因基因诊诊断常用技断常用技术术有有A.A.核酸分子核酸分子杂杂交交 B.B.聚合聚合酶酶链链反反应应C.C.基因芯片基因芯片 D.D.基因基因测测序序D.D.E.E.以上都可以以上都可以623.以下是关于PCR技术的叙述，错误是62谢谢观赏谢谢观赏谢谢观赏