荧光免疫技术的应用课件

荧光免疫技术的应用1荧光显微镜技术的应用荧光显微镜技术的应用荧光免疫测定的应用荧光免疫测定的应用荧光显微镜技术的应用2荧光免疫技术基本原理 采采用用荧荧光光素素标标记记抗抗体体与与组组织织或或细细胞胞抗抗原原反反应应，经经过过洗洗涤涤分分离离后后，荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察呈呈特特异异性性荧荧光光的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物及及其其存存在在部部位位，借借此此对对组组织织细细胞胞抗抗原原进进行行定定性性和和定定位位检检测测或或对对自自身身抗抗体体进进行行定定性性和和滴滴度度测测定定，又又称称荧光抗体技术。荧光抗体技术。荧光免疫技术基本原理 采用荧光素标记抗体与组3 利利用用一一定定波波长长的的激激发发光光对对样样品品进进行行激激发发，产产生生一一定定波波长长的的荧荧光光，对对样样品品结结构构或或其组分进行其组分进行定性、定位、定量定性、定位、定量观察检测。观察检测。荧光显微镜原理 利用一定波长的激发光对样品进行激发4荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜5荧光免疫技术的应用课件6采用荧光素标记抗体与组织或细胞抗原反应，经过洗涤分离后，荧光显微镜下观察呈特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测或对自身抗体进行定性和滴度测定，又称荧光抗体技术。测定：抗病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等德国产品（Schott）BG12、中国产品QB24、有的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530、滤板完全以数字命名，如 Corning厂的NO：5-58测定：蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原/抗体等荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动载玻片厚度应在0.8、使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。2、打开高压汞灯的电源控制箱开关。镧系元素寿命长:10s1000s 荧光显微镜的装置荧光显微镜的装置一、光源一、光源现在用高压汞灯作光源现在用高压汞灯作光源 二、滤色系统二、滤色系统 （激发滤板和压制滤板）（激发滤板和压制滤板）德国产品（德国产品（SchottSchott）BG12 BG12、中国产品、中国产品QB24 QB24、有的、有的滤板也可以透光分界滤长命名，如滤板也可以透光分界滤长命名，如K530 K530、滤板完、滤板完全以数字命名，如全以数字命名，如 Corning Corning厂的厂的NONO：5-58 5-58 三、反光镜三、反光镜反光镜的反光层一般是镀铝的反光镜的反光层一般是镀铝的 四、聚光镜四、聚光镜 （明视野聚光器（明视野聚光器 、暗视野聚光器和相、暗视野聚光器和相差荧光聚光器）差荧光聚光器）采用荧光素标记抗体与组织或细胞抗原反应，经过洗涤分离后，荧光7 五、物镜五、物镜 各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜 六、目镜六、目镜在荧光显微镜中多用低倍目镜，如在荧光显微镜中多用低倍目镜，如55和和6.3 6.3 七、落射光装置七、落射光装置 五、物镜 8 透射荧光显微镜光路透射荧光显微镜光路落射荧光显微镜光路落射荧光显微镜光路 透射荧光显微镜光路落射荧光显微镜光路9荧光显微镜的操作荧光显微镜的操作1 1、安装紫外防护罩。、安装紫外防护罩。2 2、打开、打开高压汞灯高压汞灯的电源控制箱开关。的电源控制箱开关。3 3、插入挡光板，中断光路。、插入挡光板，中断光路。4 4、预热、预热510510分钟。分钟。5 5、将载有样品的载玻片放到载物台上。、将载有样品的载玻片放到载物台上。6 6、选择接物镜、选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序按照先低倍，后高倍顺序)。7 7、旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件、旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件8 8、使用阻断滤片、使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)9 9、通过粗、细螺旋调整焦距。、通过粗、细螺旋调整焦距。1010、打开与显微镜连接的计算机，点击数码成像系统、打开与显微镜连接的计算机，点击数码成像系统软件，采集数码图像。软件，采集数码图像。荧光显微镜的操作1、安装紫外防护罩。10 国国产产高高压压汞汞灯灯GCQ-200GCQ-200型型性性能能良良好好，可可以以代代替替HBO-200HBO-200等等型型的的进进口口灯灯泡泡，平平均均寿寿命命在在200h200h以上，价格也比较低。以上，价格也比较低。国产高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以11 注意事项注意事项必须安装紫外防护罩必须安装紫外防护罩打开汞灯后不可立即关闭打开汞灯后不可立即关闭汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件汞灯的使用寿命达到汞灯的使用寿命达到300300小时，需更换新灯泡小时，需更换新灯泡 注意事项必须安装紫外防护罩12荧光显微镜标本制作要求荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片（一）载玻片载玻片厚度应在载玻片厚度应在0.80.81.2mm1.2mm之间之间（二）盖玻片（二）盖玻片盖玻片厚度在盖玻片厚度在0.17mm0.17mm左右，光洁左右，光洁（三）标本（三）标本组织切片或其他标本组织切片或其他标本不能太厚不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。（四）封裱剂（四）封裱剂封裱剂常用封裱剂常用甘油甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在在pH8.5pH8.59.59.5时较亮，不易很快褪去时较亮，不易很快褪去（五）镜油（五）镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的最好使用特制的无荧光镜油无荧光镜油荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片13数据记录及处理数据记录及处理数据记录及处理14荧光显微镜和普通显微镜的区别荧光显微镜和普通显微镜的区别 1.1.照照明明方方式式通通常常为为落落射射式式，即即光光源源通通过过物物镜镜投射于样品上；投射于样品上；2.2.光光源源为为紫紫外外光光，波波长长较较短短，分分辨辨力力高高于于普普通显微镜；通显微镜；3.3.有有两两个个特特殊殊的的滤滤光光片片，光光源源前前的的用用以以滤滤除除可可见见光光，目目镜镜和和物物镜镜之之间间的的用用于于滤滤除除紫紫外外线线，用以保护人目。用以保护人目。荧光显微镜和普通显微镜的区别 1.照明方式通常为落射式，即光15荧光显微镜技术的应用荧光显微镜技术的应用荧光显微镜技术的应用161 1、病原体检测、病原体检测快速检测病原体，也可检测患者血清中特快速检测病原体，也可检测患者血清中特异性抗体水平异性抗体水平1、病原体检测快速检测病原体，也可检测患者血清中特异性抗体水172 2、自身抗体检测、自身抗体检测抗核抗体抗核抗体(均质型均质型)抗核抗体抗核抗体(核膜型核膜型)抗核抗体抗核抗体(斑点型斑点型)2、自身抗体检测抗核抗体抗核抗体抗核抗体18用于检测学种种抗核抗体、抗平滑肌抗体、用于检测学种种抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等自身抗体抗线粒体抗体等自身抗体用于检测学种种抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等自身抗体193 3、免疫病理检测、免疫病理检测肿瘤肿瘤（人肝癌细胞）（人肝癌细胞）检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合物以及肿瘤组织中肿瘤相关抗原的坚定物以及肿瘤组织中肿瘤相关抗原的坚定3、免疫病理检测肿瘤检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合204、细胞表面抗原和受体检测细胞表面抗原和受体检测 荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CDCD抗原、抗原、抗原受体、补体受体、抗原受体、补体受体、FcFc受体受体等的检测以及淋等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。巴细胞及其亚群的鉴定和计数。5、特殊应用：流式细胞分析特殊应用：流式细胞分析 将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。自动处理各种数据。4、细胞表面抗原和受体检测21荧光免疫测定的应用荧光免疫测定的应用荧光免疫测定的应用22 23一、时间分辨荧光免疫测定一、时间分辨荧光免疫测定 利用具有双功能基团结构的利用具有双功能基团结构的螯合剂螯合剂，将镧系元素（将镧系元素（铕铕(Eu3+)(Eu3+)、钐、钐(Sm3+)(Sm3+)、铽、铽(Tb3+)(Tb3+)、钕、钕(Nd3+)(Nd3+)、镝、镝(Dy3+)(Dy3+)）标记到抗标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用结合的成分后，利用时间分辨荧光仪时间分辨荧光仪即可即可测定荧光强度，从而推测待测物含量测定荧光强度，从而推测待测物含量。一、时间分辨荧光免疫测定 利用具有双功能基团结构24 自发荧光寿命短自发荧光寿命短:1ns1ns10ns10ns镧系元素寿命长镧系元素寿命长:10s10s1000s1000s短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光 1、时间分辨、时间分辨 自发荧光寿命短:1ns10ns1、时间分25 2 2、stokesstokes位移位移(斯托克斯斯托克斯)激发光谱和发射光谱的波长差激发光谱和发射光谱的波长差镧系元素镧系元素StokesStokes位移大位移大(273nm273nm)，激发光谱和，激发光谱和发射光谱不重叠发射光谱不重叠3、发射光谱和激发光谱、发射光谱和激发光谱发射光谱带较窄：发射光谱带较窄：613nm10nm613nm10nm，干扰少，干扰少 激发光谱带较宽：激发光谱带较宽：300nm300nm350nm350nm，灵敏度高，灵敏度高 2、stokes位移(斯托克斯)激发光谱26荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。荧光显微镜和普通显微镜的区别汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动8、使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)激发光谱带较宽：300nm350nm，灵敏度高2、打开高压汞灯的电源控制箱开关。碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。3、发射光谱和激发光谱镧系元素寿命长:10s1000s荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜采用荧光素标记抗体与组织或细胞抗原反应，经过洗涤分离后，荧光显微镜下观察呈特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测或对自身抗体进行定性和滴度测定，又称荧光抗体技术。2、stokes位移(斯托克斯)汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动汞灯的使用寿命达到300小时，需更换新灯泡组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。4、荧光标记物的相对比活性、荧光标记物的相对比活性比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量荧光激发光源荧光激发光源10001000次次/S/S激发，比活性提高激发，比活性提高5、信号增强信号增强荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高 27 标记方法标记方法双抗体夹心法双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗体竞争法固相抗原竞争法固相抗原竞争法 标记方法双抗体夹心法28 测定：蛋白质、激素、药物、肿瘤测定：蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、标记物、病原体抗原病原体抗原/抗体等抗体等 测定：蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病29二、荧光偏振免疫测定二、荧光偏振免疫测定 利用荧光素经单一波长的偏振光照利用荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的关系关系而建立的免疫分析技术。而建立的免疫分析技术。二、荧光偏振免疫测定 利用荧光素经单一波长的偏振30 31 测定：药物、维生素和激素等测定：药物、维生素和激素等 测定：药物、维生素和激素等32三、荧光酶免疫测定三、荧光酶免疫测定碱碱性性磷磷酸酸酶酶标标记记抗抗体体或或抗抗原原，固固相相载载体体包包被被抗抗原原或或抗抗体体，酶酶分分解解4-MUP4-MUP，脱脱磷磷酸酸根根基基团团形形成成4-MU4-MU，360nm360nm激发光照射，发出激发光照射，发出450nm450nm荧光。荧光。三、荧光酶免疫测定碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原33 酶和荧光底物酶和荧光底物标记酶标记酶底物底物荧光产物荧光产物激发光激发光(nm)(nm)荧光荧光(nm)(nm)相应信号相应信号碱性磷酸酶碱性磷酸酶4-MUP4-MUP4-MU4-MU3603604504501010-半乳糖苷酶半乳糖苷酶4-MUG4-MUG4-MU4-MU3603604504501010辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HPAHPA二聚体二聚体3173174144140.030.03 酶和荧光底物标记酶底物荧光产物激发光(nm34 方法类型方法类型双抗体夹心法双抗体夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法固相抗原竞争法 方法类型双抗体夹心法35 测定：测定：抗病毒抗体、细菌和毒素抗原、抗病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等激素、肿瘤标志物等 测定：抗病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿36 非均相荧光免疫测定：非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定荧光酶免疫测定均相荧光免疫测定：均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定 非均相荧光免疫测定：37荧光免疫技术的优缺点荧光免疫技术的优缺点优点：特异性强、敏感性高、速度快优点：特异性强、敏感性高、速度快缺点：存在非特异性染色，结果判定缺点：存在非特异性染色，结果判定的客观性不足，技术程序也较复杂的客观性不足，技术程序也较复杂荧光免疫技术的优缺点优点：特异性强、敏感性高、速度快38荧光免疫技术的应用课件39荧光免疫技术的应用课件40