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腹腔镜全子宫切除护理查房徐晓凤腹腔镜全子宫切除护理查房徐晓凤腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房徐房徐晓凤晓凤1人体基因数目人体基因数目仅比低等生物比低等生物线虫多两倍。虫多两倍。如此少的基因是如何如此少的基因是如何创造出人体如此复造出人体如此复杂的生命活的生命活动？人体基因的主要功能是通人体基因的主要功能是通过蛋白蛋白质来来实现的，蛋白的，蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角扮演着构筑生命大厦的主要角色。人体中大色。人体中大约有有1010万种蛋白万种蛋白质。测定蛋白质结构的意义测定蛋白质结构的意义人体基因数目人体基因数目仅仅比低等生物比低等生物线线虫多两倍。如此少的基因是如何虫多两倍。如此少的基因是如何创创造出造出2蛋白质三维结构解析方法蛋白质三维结构解析方法vX-X-射线晶体衍射法：射线晶体衍射法：85.3%85.3%v核磁共振波谱：核磁共振波谱：14.7%14.7%v电镜三维重构、各种光谱技术、显微电镜三维重构、各种光谱技术、显微 技术和计算机模拟技术和计算机模拟 蛋白蛋白质质三三维结维结构解析方法构解析方法3蛋白质三维结构解析过程蛋白质三维结构解析过程蛋白蛋白质质三三维结维结构解析构解析过过程程4腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房房讲课讲课ppt课课件件5腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房房讲课讲课ppt课课件件6l1895年年11月月8日日,德国物德国物理学家，理学家，50岁的伦琴在岁的伦琴在自己的实验室中偶然发自己的实验室中偶然发现现一种从阴极射线管一种从阴极射线管中辐射出的新型射线，中辐射出的新型射线，由于对管子发出的由于对管子发出的“东东西西”性质不确定，伦琴性质不确定，伦琴就把这种射线命名为就把这种射线命名为“X射线射线”。图片出处:伦琴实验室伦琴实验室第一节第一节 X-X-射线衍射测定蛋白质结构射线衍射测定蛋白质结构1895年年11月月8日日,德国物理学家，德国物理学家，50岁岁的的伦伦琴在自己的琴在自己的实实7人类第一张人类第一张X光照片光照片图片出处:伦琴妻子之手伦琴妻子之手 人人类类第一第一张张X光照片光照片图图片出片出处处:伦伦琴妻子之手琴妻子之手 81896年年1月月23日伦日伦琴将这一重大发现在维琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报尔兹堡物理医学会上报告。告。Kolliker教授提议教授提议将该射线命名为将该射线命名为“伦琴伦琴射线射线”,但伦琴却说但伦琴却说“我还没有彻底解释这种我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还是射线的发生现象，还是称它为称它为X射线最恰当。射线最恰当。”威廉威廉康拉德康拉德伦琴伦琴WilhelmConradRntgen 1896年年1月月23日日伦伦琴将琴将这这一重大一重大发现发现在在维维尔尔兹兹堡物堡物9l1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时，年第一届诺贝尔物理学奖评选时，29封推荐信中就有封推荐信中就有17封集中推荐他。伦封集中推荐他。伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金图片出处 诺贝尔物理奖奖章诺贝尔物理奖奖章诺贝尔物理奖奖章诺贝尔物理奖奖章1901年第一届年第一届诺贝诺贝尔尔物理学物理学奖评选时奖评选时，29封推荐信中就有封推荐信中就有1710X射线本质射线本质X射线是一种短波长射线是一种短波长(0.005(0.0051010nm)、高能量高能量(2.510(2.5105 5 1.2101.2102 2eV)的电磁波。它是原子内层电子在高速运的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。磁辐射。X射射线线本本质质 X射射线线是一种短波是一种短波长长(0.00510n11l一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生X射线的真空管，射线的真空管，K是发射电子的热阴极，是发射电子的热阴极，A是由钼、钨或是由钼、钨或铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，使电子流加速，向阳极使电子流加速，向阳极A撞击而产生撞击而产生X射线。射线。A一般由高速一般由高速电电子撞子撞击击金属金属产产生。如生。如图图所示，是一种所示，是一种产产生生X射射线线的真空的真空12X射线衍射射线衍射l1912年年Max von Laue发现发现X射线具有衍射线具有衍射的现象。（射的现象。（1914年的诺贝尔物理学奖）年的诺贝尔物理学奖）图片出处图片出处:X射射线线衍射衍射1912年年Max von Laue发现发现X射射线线具有衍具有衍13劳厄的实验装置劳厄的实验装置 图片出处图片出处:劳劳厄的厄的实验实验装置装置 图图片出片出处处:14X X射线晶体结构分析基本原理射线晶体结构分析基本原理 lX射线衍射分析所依赖的基本原理是射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象射线衍射现象l X射线衍射现象利用射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。l当当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。l衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。积、有序或无序的排列等。X射射线线晶体晶体结结构分析基本原理构分析基本原理 X射射线线衍射分析所依衍射分析所依赖赖的基本原理是的基本原理是151957年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白的0.agrees well with structure特点m/z较分子离子小，碎片离子峰出现在分子离子峰的左侧。2、蛋白质结晶和晶体生长圆二色性当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就是圆二色性1H-1H COSY、1H-15N HSQC椭圆偏振光振幅不等的左、右圆偏振光合成3、衍射数据收集和处理X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象1永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制这种方法的原理可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象,然后测量所有相邻拐角间的距离和方位,据此就可以推知房屋的结构。核磁共振法中几个常用的参数目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。（2）透析法(Dialysis)74岁的美国科学家保罗劳特布尔和70岁的英国科学家彼得曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子，主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫键，另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性有影响。xa=80%,2005年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构X X射线通过红宝石晶体射线通过红宝石晶体(a)a)和硅单晶体和硅单晶体(b)b)所拍摄的劳厄斑所拍摄的劳厄斑图片出处图片出处:1957年肯特年肯特罗罗(Kendrew)完成肌完成肌红红蛋白的蛋白的0.X射射线线通通16劳伦斯劳伦斯布拉格布拉格(Lawrence Bragg)亨利亨利亨利亨利 布拉格布拉格布拉格布拉格(HenryHenry Bragg)Bragg)因在用因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献献,亨利亨利布拉格（布拉格（WilliamHenryBragg）和劳伦和劳伦斯斯布拉格（布拉格（WilliamLawrenceBragg）父子分享了父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖。年的诺贝尔物理学奖。图片出处图片出处 图片出处图片出处http:/nobelprize.org/physics/laureates/1915/wl-bragg-bio.html 劳伦劳伦斯斯布拉格布拉格(Lawrence Bragg)亨利亨利布拉格布拉格17l20世纪世纪60年代解析一个蛋白质结构可以获年代解析一个蛋白质结构可以获 得诺贝尔奖；得诺贝尔奖；l20世纪世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成年代解析一个蛋白质结构则可成 为轰动世界的新闻；为轰动世界的新闻；l20世纪世纪80年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；l20世纪世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；l今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。蛋白质结构解析的发展蛋白质结构解析的发展饶子和院士饶子和院士HIV基质蛋白基质蛋白 SARS20世世纪纪60年代解析一个蛋白年代解析一个蛋白质结质结构可以构可以获获蛋白蛋白质结质结构解析的构解析的发发展展18射线衍射用于蛋白质结构的测定射线衍射用于蛋白质结构的测定l1954年伯纳尔年伯纳尔(Bernal)获得第一张胃蛋白获得第一张胃蛋白酶晶体衍射图片。酶晶体衍射图片。射射线线衍射用于蛋白衍射用于蛋白质结质结构的构的测测定定1954年伯年伯纳纳尔尔(Bernal19l1957年肯特罗年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白的完成肌红蛋白的0.6 nm分辨率的蛋白质晶体结构分辨率的蛋白质晶体结构图片出处:图片出处:1957年肯特年肯特罗罗(Kendrew)完成肌完成肌红红蛋白的蛋白的0.6 nm20肌红蛋白的三维结构肌红蛋白的三维结构 肌红蛋白的三维结构模型肌红蛋白的三维结构模型图片出处:图片出处:http:/肌肌红红蛋白的三蛋白的三维结维结构构 肌肌红红蛋白的三蛋白的三维结维结构模型构模型图图片出片出处处:图图片出片出处处211959年佩鲁茨年佩鲁茨(Perute)完成血完成血红蛋白红蛋白0.55分辨分辨率的晶体结构率的晶体结构图片出处:1959年佩年佩鲁鲁茨茨(Perute)完成血完成血红红蛋白蛋白22血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构 模型模型图片出处 血红蛋白分子就是由二个由血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的个氨基酸残基组成的亚基和二个由亚基和二个由146个氨基酸残个氨基酸残基组成的基组成的亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象。子严密的空间构象。血血红红蛋白的四蛋白的四级结级结构构 模型模型图图片出片出处处 血血红红蛋白分子就是由二个由蛋白分子就是由二个由123 由于测定出蛋白质的精细结构由于测定出蛋白质的精细结构,两位英国科两位英国科学家学家M.F.M.F.佩鲁茨和佩鲁茨和J.C.J.C.肯德鲁获得肯德鲁获得19621962年的诺年的诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。图片出处：图片出处：由于由于测测定出蛋白定出蛋白质质的精的精细结细结构构,两位英国科学家两位英国科学家M.F.佩佩鲁鲁241997年年,核小体八组蛋白结构核小体八组蛋白结构 2004年年,菠菜捕光复合物菠菜捕光复合物LHC-II1997年年,核小体八核小体八组组蛋白蛋白结结构构 252005年，线粒体膜蛋白复合物年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构精细结构2005年，年，线线粒体膜蛋白复合物粒体膜蛋白复合物2精精细结细结构构26X射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计提供了全新方向射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计提供了全新方向中国科学家研制抗癌新药首获瑞典爱明诺夫奖X射射线线衍射衍射测测定蛋白和核酸精定蛋白和核酸精细结细结构，构，为为新新药设计药设计提供了全新方向中提供了全新方向中27施一公抗癌抗乙肝病毒新药施一公抗癌抗乙肝病毒新药Birinapant，进入临床二期，进入临床二期施一公抗癌抗乙肝病毒新施一公抗癌抗乙肝病毒新药药Birinapant，进进入入临临床二期床二期28核磁共振测深是MRI技术在地质勘探领域的延伸，通过对地层中水分布信息的探测，可以确定某一地层下是否有地下水存在，地下水位的高度、含水层的含水量和孔隙率等地层结构信息。X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象所谓三维电镜重构是指通过样品的一个或多个投影图得到样品中各组成部分之间的三维关系。这种方法的原理可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象,然后测量所有相邻拐角间的距离和方位,据此就可以推知房屋的结构。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基；目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。org/physics/laureates/1915/wl-bragg-bio.74岁的美国科学家保罗劳特布尔和70岁的英国科学家彼得曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主1896年1月23日伦琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报告。（2）透析法(Dialysis)1957年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白的0.然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像测定蛋白质结构的意义2102eV)的电磁波。如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房子的三维图形。核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance)，电子显微镜在三维电镜重构技术中起着十分重要的作用，电镜二维晶体学在膜蛋白的三维精细结构解析上有着特殊的优势。（1）批量结晶法（Batch crystallization）74岁的美国科学家保罗劳特布尔和70岁的英国科学家彼得曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。蛋白质蛋白质X X射线晶体结构测定程序射线晶体结构测定程序 l1、样品制备、样品制备 l2、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 l3、衍射数据收集和处理、衍射数据收集和处理 l4、位相求解、位相求解 l5、模型建立和修正、模型建立和修正 核磁共振核磁共振测测深是深是MRI技技术术在地在地质质勘探勘探领领域的延伸，通域的延伸，通过对过对地地层层中水中水291、样品制备、样品制备 l大量表达、分离和纯化目标蛋白大量表达、分离和纯化目标蛋白 一般要求纯度大于一般要求纯度大于97%，浓度达到浓度达到5mg/ml以上。以上。1、样样品制品制备备 大量表达、分离和大量表达、分离和纯纯化目化目标标蛋白蛋白 一般要求一般要求纯纯度度302、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 蛋白质结晶原理蛋白质结晶原理 与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆积起来形成晶体析出积起来形成晶体析出 2、蛋白、蛋白质结质结晶和晶体生晶和晶体生长长 蛋白蛋白质结质结晶原理晶原理31蛋白质晶体生长的影响因素蛋白质晶体生长的影响因素l物理因素温度、重力、压力、震动、时间、电场磁场、介物理因素温度、重力、压力、震动、时间、电场磁场、介质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等l化学因素化学因素pH值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类、值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类、离子强度、过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等离子强度、过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等ll生化因素蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传生化因素蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对称性、蛋白质的稳定性和等电点等称性、蛋白质的稳定性和等电点等蛋白蛋白质质晶体生晶体生长长的影响因素物理因素温度、重力、的影响因素物理因素温度、重力、压压力、震力、震动动、时间时间32蛋白质结晶方法蛋白质结晶方法（1）批量结晶法（）批量结晶法（Batchcrystallization）（2）透析法）透析法(Dialysis)（3）液相扩散法液相扩散法(Liquiddiffusion)（4）气相扩散法（气相扩散法（Vapourdiffusion）（5）蛋白质结晶新方法蛋白质结晶新方法蛋白蛋白质结质结晶方法晶方法（1）批量）批量结结晶法（晶法（Batch crystal33（1）批量结晶法（）批量结晶法（Batchcrystallization）l通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。液中结晶。（1）批量）批量结结晶法（晶法（Batch crystallization34腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房房讲课讲课ppt课课件件35（2）透析法）透析法(Dialysis)l利用半透膜允许小分子透过而大分子不能透利用半透膜允许小分子透过而大分子不能透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、pH或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形成过饱和状态以形成晶核。该法是培养蛋成过饱和状态以形成晶核。该法是培养蛋白质晶体的常用方法。白质晶体的常用方法。（2）透析法）透析法(Dialysis)利用半透膜允利用半透膜允许许小分子透小分子透36腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房房讲课讲课ppt课课件件37（3）液相扩散法液相扩散法(Liquiddiffusion)l利用液相平衡原理而设计的。由于蛋白质在利用液相平衡原理而设计的。由于蛋白质在不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和，从而促使晶核形成。饱和，从而促使晶核形成。（3）液相液相扩扩散法散法(Liquid diffusion)利用利用38（4）气相扩散法（气相扩散法（Vapourdiffusion）l把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需盐把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需盐浓度的溶液和低于这种浓度的盐溶液放在一浓度的溶液和低于这种浓度的盐溶液放在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶液中沉淀生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。质达到过饱和而析出晶体。（4）气相气相扩扩散法（散法（Vapour diffusion）把待）把待结结39目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制一般由高速电子撞击金属产生。质谱分析法在研究生物大分子特别是蛋白质方面已发展成为主要的技术手段之一，在蛋白质结构的研究中占据着十分重要的地位。xc=20%因此，下面介绍一些其他测定蛋白质结构的方法根据分子离子的质荷比可确定分子量及分子式。动力学全精（DER）研究技术是将两个核磁共振光谱和分子动力学结合起来的一种方法。在停止射频脉冲后，氢原子核按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量释放出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理获得图像.1959年佩鲁茨(Perute)完成血红蛋白0.特点m/z较分子离子小，碎片离子峰出现在分子离子峰的左侧。Kolliker教授提议将该射线命名为“伦琴射线”,但伦琴却说“我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还是称它为X射线最恰当。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基；Wilhelm Conrad RntgenWilhelm Conrad RntgenX射线晶体衍射技术要求蛋白质是晶体存在状态，而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质来说，比较难以得到所需的晶体结构。核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射(约4600MHz)的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。生物质谱的发展使人类基因组计划及其后基因组计划得以提前完成，对其实施也起着重要的推动作用。目前核磁共振成象技目前核磁共振成象技术术已能以活人已能以活人为观为观察察对对象，象，扫扫描身体中任何器官描身体中任何器官40（5）结晶新方法结晶新方法Nucleant生物玻璃生物玻璃（5）结结晶新方法晶新方法41晶体初步鉴定晶体初步鉴定偏光显微镜观察、染色、电泳等偏光显微镜观察、染色、电泳等晶体初步晶体初步鉴鉴定定偏光偏光显显微微镜观镜观察、染色、察、染色、电电泳等泳等423、衍射数据收集和处理、衍射数据收集和处理l第三代同步辐射光源的应用使得用第三代同步辐射光源的应用使得用2040um大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现实实l目前世界上比较著名的同步辐射工作站有多目前世界上比较著名的同步辐射工作站有多个个APS（USA）;ESRF（France）;SPring8（Japan）3、衍射数据收集和、衍射数据收集和处处理第三代同步理第三代同步辐辐射光源的射光源的应应用使得用用使得用204043上海同步辐射中心上海同步辐射中心同步辐射光源同步辐射光源上海同步上海同步辐辐射中心同步射中心同步辐辐射光源射光源44晶体收集和储存晶体收集和储存液氮气冷技术晶体收集和晶体收集和储储存液氮气冷技存液氮气冷技术术454、位相求解、位相求解 1.分子置换法分子置换法(MR)2.多对同晶型置换法多对同晶型置换法(MIR)3.多波长反常散射法多波长反常散射法(MAD)实验中经常联合使用实验中经常联合使用4、位相求解、位相求解 1.分子置分子置换换法法(MR)46分子置换法分子置换法(MR)l分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子放分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始结到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶体构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶体各个衍射点的相角的方法。各个衍射点的相角的方法。分子置分子置换换法法(MR)分子置分子置换换法就是把已知法就是把已知结结构的蛋白构的蛋白质质分子放到分子放到47多对同晶型置换法多对同晶型置换法(MIR)l在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属原在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属原子如子如Pb和和Hg等作为标志原子，制备出重原等作为标志原子，制备出重原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶胞子的衍生物，然后求出这些重原子在晶胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射波中的坐标，根据坐标计算出重原子散射波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白质在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白质分子在各个衍射中的位相。分子在各个衍射中的位相。多多对对同晶型置同晶型置换换法法(MIR)在蛋白在蛋白质质晶体中引入散射能力晶体中引入散射能力强强的重的重48多波长反常散射法多波长反常散射法(MAD)l利用同步辐射波长连续可变的特点，使用一利用同步辐射波长连续可变的特点，使用一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体就个重原子衍生物作为母体，用一个晶体就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的多套数据，并解出结构。多套数据，并解出结构。多波多波长长反常散射法反常散射法(MAD)利用同步利用同步辐辐射波射波长连续长连续可可变变的特点，的特点，495、模型建立和修正、模型建立和修正l晶体学晶体学R因子一般要求达到因子一般要求达到0.2以下以下l键长偏差大约为键长偏差大约为0.015l键角偏差约为键角偏差约为3l二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象分象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制布受到立体化学的限制5、模型建立和修正晶体学、模型建立和修正晶体学R因子一般要求达到因子一般要求达到0.2以下以下50lXRay晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的主要方法l优点分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构 l缺点只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测定溶液中的信息腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房房讲课讲课ppt课课件件51v成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。v核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法。可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法。v目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。一种引人注目的癌症早期诊断技术。第二节第二节 NMRNMR测定蛋白质结构测定蛋白质结构第二第二节节 NMR测测定蛋白定蛋白质结质结构构52核磁共振技术（核磁共振技术（NMR）v1946年年美美国国斯斯坦坦福福大大学学的的F.Bloch和和哈哈佛佛大大学学的的两两个个研研究究小小组组首首次次独独立立观观察察到到核核磁磁共共振振现现象象，为为此此他他们们两两人人获获1952年诺贝尔物理奖。年诺贝尔物理奖。v1983年年，瑞瑞士士科科学学家家Kurt Kurt W Wthrichthrich教教授授实实验验室室首首次次运运用用核核磁共振方法解析了胰高血糖素（磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagonglucagon）多肽的溶液构象多肽的溶液构象.发发明明了了利利用用核核磁磁共共振振(NMR)NMR)技技术术测测定定溶溶液液中中生生物物大大分分子子三三维维结构的方法获得了结构的方法获得了20022002年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖 v74岁的美国科学家保罗岁的美国科学家保罗劳特布尔和劳特布尔和70岁的英国科学家岁的英国科学家彼得彼得曼斯菲尔德为曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主诺贝尔医学奖的得主核磁共振技核磁共振技术术（NMR）1946年美国斯坦福大学的年美国斯坦福大学的F.Bloc53腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房房讲课讲课ppt课课件件54NMR基本原理基本原理核核 磁磁 共共 振振(Nuclear Nuclear Magnetic Resonance)Magnetic Resonance)，就是就是处于某个静磁于某个静磁场中的中的自旋核系自旋核系统受到相受到相应频率率的射的射频磁磁场作用作用时,共振共振吸收某一特定吸收某一特定频率的射率的射频辐射的物理射的物理过程。程。核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪核磁共振波核磁共振波谱是是测量原子核量原子核对射射频辐射射(约4 4 600MHz)600MHz)的吸收，的吸收，这种吸收只有在高磁种吸收只有在高磁场中才能中才能产生。生。NMR基本原理核磁共振基本原理核磁共振(Nuclear M55151556腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房房讲课讲课ppt课课件件57腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房房讲课讲课ppt课课件件58核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪核磁共振波核磁共振波谱仪谱仪59核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪1永久磁铁：提供外磁场，永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。扫场线圈。2射频振荡器：线圈垂射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。率的电磁辐射信号。60MHz或或100MHz。核磁共振波核磁共振波谱仪谱仪1永久磁永久磁铁铁：提供外：提供外603射频信号接受器（检测射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。线圈中产生毫伏级信号。4样品管：外径样品管：外径5mm的玻的玻璃管璃管,测量过程中旋转测量过程中旋转,磁磁场作用均匀。场作用均匀。3 射射频频信号接受器（信号接受器（检测检测器）：当器）：当质质子的子的进动频进动频率与率与辐辐射射频频率相率相61如果一个人知道了一如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房房子的所有尺寸，就可以画出房子的三子的三维图形。同形。同样，如，如图所示，通所示，通过测量蛋白量蛋白质中的中的大量的短距离，就可以画出其大量的短距离，就可以画出其结构的三构的三维图像。像。l瑞士科学家瑞士科学家库尔特特维特里希特里希则发明了明了“利用核磁共振技利用核磁共振技术测定溶定溶液中生物大分子三液中生物大分子三维结构法构法”。这种方法的种方法的优点是可点是可对溶液中的蛋溶液中的蛋白白质进行分析行分析,进而可而可对活活细胞中的蛋白胞中的蛋白质进行分析行分析,能能获得得“活活”蛋白蛋白质的的结构构,其意其意义非常重大。非常重大。l这种方法的原理可以用种方法的原理可以用测绘房屋的房屋的结构来比构来比喻首先首先选定一座房屋的所定一座房屋的所有拐角作有拐角作为测量量对象象,然后然后测量所有相量所有相邻拐角拐角间的距离和方位的距离和方位,据此据此就可以推知房屋的就可以推知房屋的结构。构。维特里希特里希选择生物大分子中的生物大分子中的质子子(氢原子原子核核)作作为测量量对象象,连续测定所有相定所有相邻的的2 2个个质子之子之间的距离和方位的距离和方位,这些数据些数据经计算机算机处理后就可形成生物大分子的三理后就可形成生物大分子的三维结构构图。如果一个人知道了一如果一个人知道了一间间房子的所有尺寸，就可以画出房子的三房子的所有尺寸，就可以画出房子的三维图维图形形62核磁共振法中几个常用的参数核磁共振法中几个常用的参数l化学位移化学位移 l耦合常数耦合常数 lNOE（核欧沃豪斯效应）信号强度（核欧沃豪斯效应）信号强度 l谱峰面积谱峰面积 l弛豫时间弛豫时间 核磁共振法中几个常用的参数化学位移核磁共振法中几个常用的参数化学位移 631.化学位移化学位移 l 值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；低场；值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。出现在高场。1.化学位移化学位移 值值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现现在低在低场场642.耦合常数耦合常数 核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数自旋自旋耦合常数,用用J表示。耦合常数用表示。耦合常数用来表征两核之间耦合作用的大小。来表征两核之间耦合作用的大小。J耦合常数大小主要与连接两个核的化学键耦合常数大小主要与连接两个核的化学键数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分布的因素有关。布的因素有关。2.耦合常数耦合常数 核与核之核与核之间间以价以价电电子子为为媒介相互耦合引起媒介相互耦合引起谱线谱线分裂的分裂的653.NOE信号强度信号强度l当分子内有两个空间距离小于当分子内有两个空间距离小于0.5nm的原子的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效核欧沃豪斯效应应（NOE）。）。3.NOE信号信号强强度度 当分子内有两个空当分子内有两个空间间距离小于距离小于0.5nm的的664.谱峰面积谱峰面积l谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数目的多少成正比，因此峰面积的积分值可目的多少成正比，因此峰面积的积分值可用来做定量分析的基础。用来做定量分析的基础。4.谱谱峰面峰面积积 谱谱峰面峰面积积和分子中同一化学和分子中同一化学环环境的原子核数目的多少境的原子核数目的多少675.弛豫时间弛豫时间l原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫时过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫时间。间。l自旋晶格弛豫处于高能态的氢核，把能量转自旋晶格弛豫处于高能态的氢核，把能量转给周围的分子，回到低能态。给周围的分子，回到低能态。l自旋自旋弛豫自旋自旋弛豫 两个进动频率相同，进动取两个进动频率相同，进动取向不同的磁性核，在一定距离内时，它们向不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。相互交换能量，改变进动方向。5.弛豫弛豫时间时间 原子核从激化的状原子核从激化的状态态回复到平衡排列状回复到平衡排列状态态的的过过程叫弛程叫弛68二维核磁共振二维核磁共振(2DNMR）NMR可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到等就需要用到2DNMR，它是它是2个频率变量的函数，吸收个频率变量的函数，吸收峰对峰对2个频率变量作图。个频率变量作图。1H-1HCOSY、1H-15NHSQC 二二维维核磁共振核磁共振(2DNMR）NMR可可69多维核磁共振多维核磁共振v1H，13C，15N核之间的化学键连接来得到核磁共振核之间的化学键连接来得到核磁共振相关信号。相关信号。CBCANH、HNCO、HCCH-COSYv核磁共振本身不能展示样体的内部结构。要得到内部核磁共振本身不能展示样体的内部结构。要得到内部的图像，就要将不同梯度的磁场加以结合，即改变穿过的图像，就要将不同梯度的磁场加以结合，即改变穿过样本的磁场强度。这样就有无数二维的图像，彼此重叠样本的磁场强度。这样就有无数二维的图像，彼此重叠后就得到样本内部空间的三维图像后就得到样本内部空间的三维图像 多多维维核磁共振核磁共振1H，13C，15N核核70核磁共振技术的应用核磁共振技术的应用l早期核磁共振主要用于对核结构和性质的研早期核磁共振主要用于对核结构和性质的研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋等等l后来广泛应用于分子组成和结构分析，生物后来广泛应用于分子组成和结构分析，生物组织与活体组织分析，病理分析、医疗诊组织与活体组织分析，病理分析、医疗诊断、产品无损监测等方面断、产品无损监测等方面核磁共振技核磁共振技术术的的应应用早期核磁共振主要用于用早期核磁共振主要用于对对核核结结构和性构和性质质的研究，的研究，7119851985年年,维特里希等人公布了第一次利用特里希等人公布了第一次利用NMR NMR 法法测定的溶定的溶液中蛋白液中蛋白质蛋白蛋白酶抑制抑制剂IIA(proteinase IIA(proteinase inhibitor IIA)inhibitor IIA)的的结构构1985年年,维维特里希等人公布了第一次利用特里希等人公布了第一次利用NMR 法法测测定的溶液定的溶液72NMR图谱得到的蛋白质三维结构图谱得到的蛋白质三维结构from：厦门大学生命科学学院：厦门大学生命科学学院 NMR图谱图谱得到的蛋白得到的蛋白质质三三维结维结构构from：73NMR的非破坏性使得的非破坏性使得NMR谱图可以确定完整生谱图可以确定完整生物大分子中某成分的存在和浓度从而与物大分子中某成分的存在和浓度从而与X-Ray晶体晶体衍射互为补充衍射互为补充.NMR的非破坏性使得的非破坏性使得NMR谱图谱图可以确定完整生物可以确定完整生物74核磁共振成像核磁共振成像 基本原理是将人体置于特殊的磁场中，用无线电基本原理是将人体置于特殊的磁场中，用无线电射频脉冲激发人体内氢原子核，引起氢原子核共射频脉冲激发人体内氢原子核，引起氢原子核共振，并吸收能量。在停止射频脉冲后，氢原子核振，并吸收能量。在停止射频脉冲后，氢原子核按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量释放按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量释放出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理获得图像获得图像.核磁共振成像核磁共振成像75核磁共振测深核磁共振测深核磁共振测深是核磁共振测深是MRI技术在地质勘探领域的技术在地质勘探领域的延伸，通过对地层中水分布信息的探测，可以延伸，通过对地层中水分布信息的探测，可以确定某一地层下是否有地下水存在，地下水位确定某一地层下是否有地下水存在，地下水位的高度、含水层的含水量和孔隙率等地层结构的高度、含水层的含水量和孔隙率等地层结构信息。信息。核磁共振核磁共振测测深深核磁共振核磁共振测测深是深是MRI技技术术在地在地质质勘探勘探领领域的延域的延76优优缺缺点点v优点：可以在水溶液或优点：可以在水溶液或有机相中研究生物大分子有机相中研究生物大分子结构，研究溶液条件的改结构，研究溶液条件的改变对生物大分子三维结构变对生物大分子三维结构的影响以及生物大分子内的影响以及生物大分子内部动力学的特点部动力学的特点v缺点：分辨率不高。目缺点：分辨率不高。目前，前，NMR只能用于测定只能用于测定小分子和中型蛋白质的结小分子和中型蛋白质的结构构from：厦门大学生命科学学院：厦门大学生命科学学院 优优 缺缺77NMR法测定蛋白质结构的基本实验步骤法测定蛋白质结构的基本实验步骤:1、样品制备，一般应采用液态样品样品制备，一般应采用液态样品，CCl4溶解溶解2、一维一维NMR实验实验3、二维二维NMR实验实验4、三维三维NMR实验实验5、有的还要做四维有的还要做四维NMR实验实验NMR法法测测定蛋白定蛋白质结质结构的基本构的基本实验实验步步骤骤:1、样样品制品制备备，一般，一般应应78腹腔腹腔镜镜全子全子宫宫切除切除护护理理查查房房讲课讲课ppt课课件件79X-射线晶体衍射法、核磁共振波谱的关系射线晶体衍射法、核磁共振波谱的关系vNMR法一般只能解析相对较小的蛋白质，法一般只能解析相对较小的蛋白质，X-射射线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质。线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质。v有些蛋白质水溶性很差，却很容易培养成晶体，有些蛋白质水溶性很差，却很容易培养成晶体，另一些蛋白质则水溶性很好，培养成晶体很困难。另一些蛋白质则水溶性很好，培养成晶体很困难。X-射射线线晶体衍射法、核磁共振波晶体衍射法、核磁共振波谱谱的关系的关系80第三节第三节 蛋白质结构测定的其他方法蛋白质结构测定的其他方法nX射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白质射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白质空间结构测定的主要方法，空间结构测定的主要方法，但它们都存在一些不但它们都存在一些不足。足。nX射线晶体衍射技术要求蛋白质是晶体存在状态，射线晶体衍射技术要求蛋白质是晶体存在状态，而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质来说，比较难以得到所需的晶体结构。来说，比较难以得到所需的晶体结构。n核磁共振技术能测出溶液状态下分子量较小蛋白核磁共振技术能测出溶液状态下分子量较小蛋白质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理显得比较复杂。显得比较复杂。第三第三节节 蛋白蛋白质结质结构构测测定的其他方法定的其他方法X射射线线晶体衍射技晶体衍射技术术和核磁共振和核磁共振81l因此，下面介绍一些其他测定蛋白质结构的因此，下面介绍一些其他测定蛋白质结构的方法方法l现代光谱技术现代光谱技术l三维电镜衍射技术三维电镜衍射技术l动力学全精研究技术动力学全精研究技术因此，下面介因此，下面介绍绍一些其他一些其他测测定蛋白定蛋白质结质结构的方法构的方法82一、现代光谱技术一、现代光谱技术l除传统的紫外可见差光谱法和荧光光除传统的紫外可见差光谱法和荧光光谱法外，圆二色谱、激光拉曼光谱以谱法外，圆二色谱、激光拉曼光谱以及质谱也在测定蛋白质溶液构象方面及质谱也在测定蛋白质溶液构象方面发挥着重要的作用。发挥着重要的作用。一、一、现现代光代光谱谱技技术术除除传统传统的紫外可的紫外可见见差光差光谱谱法和法和荧荧光光光光谱谱法外，法外，圆圆二二83圆二色谱圆二色谱（Circular Dichroism，CD）l圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。快速而又较准确的方法。l圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。光率的不同来分析蛋白质的结构。l1969年，年，Greenfield用圆二色光谱数据估计了蛋白用圆二色光谱数据估计了蛋白质的二级结构。此后，关于利用圆二色谱研究蛋质的二级结构。此后，关于利用圆二色谱研究蛋白质空间结构的报道逐渐增多。白质空间结构的报道逐渐增多。圆圆二色二色谱谱（Circular Dichroism，CD）圆圆二二84平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光l平面偏振光指振动方向在同一平面内的电磁波。平面偏振光指振动方向在同一平面内的电磁波。l圆偏振光当两束振幅相等、互相垂直的偏振光位相圆偏振光当两束振幅相等、互相垂直的偏振光位相相差相差1/4波长波长(90)时，其合成矢量绕光传播方向旋时，其合成矢量绕光传播方向旋转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量E末端轨末端轨迹为圆形，所以称之为圆偏振光。电场矢量方向顺迹为圆形，所以称之为圆偏振光。电场矢量方向顺时针方向旋转的称为右圆偏振光，逆时针方向旋转时针方向旋转的称为右圆偏振光，逆时针方向旋转的则称左圆偏振光。的则称左圆偏振光。l椭圆偏振光振幅不等的左、右圆偏振光合成椭圆偏振光振幅不等的左、右圆偏振光合成平面偏振光、平面偏振光、圆圆偏振光和偏振光和椭圆椭圆偏振光平面偏振光指振偏振光平面偏振光指振动动方向在同一平方向在同一平85圆二色性和圆二色谱圆二色性和圆二色谱l圆二色性当左、右圆偏振光进入物质时，光学活圆二色性当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就是圆二色性是圆二色性l光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的光成为椭圆偏振光，用椭圆度或吸收差表示光成为椭圆偏振光，用椭圆度或吸收差表示l圆二色谱指椭圆度圆二色谱指椭圆度(或比椭圆度等或比椭圆度等)与波长的关系，与波长的关系，它在本质上与旋光色散谱是一样的。它在本质上与旋光色散谱是一样的。圆圆二色性和二色性和圆圆二色二色谱圆谱圆二色性当左、右二色性当左、右圆圆偏振光偏振光进进入物入物质时质时，光学活，光学活86圆二色谱的应用圆二色谱的应用l在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测定在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测定生物大分子的空间结构。生物大分子的空间结构。l生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在溶液状态下的二级结构溶液状态下的二级结构。圆圆二色二色谱谱的的应应用在分子生物学中，用在分子生物学中，圆圆二色二色仪仪主要主要应应用于用于测测定生物大分定生物大分87l蛋白蛋白质或多或多肽是由氨是由氨基酸通基酸通过肽键连接而接而成的具有特定成的具有特定结构的构的生物大分子，主要的生物大分子，主要的光学活性生色基光学活性生色基团是是肽链骨架中的骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二芳香氨基酸残基及二硫硫键，另外，有的蛋，另外，有的蛋白白质辅基基对蛋白蛋白质的的圆二色性有影响。二色性有影响。肽键的不的不对称性使得它称性使得它总有光活性有光活性蛋白蛋白质质或多或多肽肽是由氨基酸通是由氨基酸通过肽键连过肽键连接而成的具有特定接而成的具有特定结结构的生物大构的生物大88l蛋白蛋白质的的圆二色性主要由活性生色基二色性主要由活性生色基团及折叠及折叠结构两方面构两方面圆二色性的二色性的总和。根据和。根据电子子跃迁能迁能级能能量的大小，蛋白量的大小，蛋白质的的CD光光谱分分为三个波三个波长范范围:l1）250nm以下的以下的远紫外光紫外光谱区，区，圆二色性主要由二色性主要由肽键的的n*电子子跃迁引起；迁引起；远紫外紫外CD主要主要应用于用于蛋白蛋白质二二级结构的解析构的解析l2）250300nm的近紫外光的近紫外光谱区，主要由区，主要由侧链芳芳香基香基团的的*电子子跃迁引起；近紫外迁引起；近紫外CD主要揭示主要揭示蛋白蛋白质的三的三级结构信息构信息l3）300700nm的紫外可的紫外可见光光光光谱区，主要由蛋区，主要由蛋白白质辅基等外在生色基基等外在生色基团引起。紫外可引起。紫外可见光光CD主主要用于要用于辅基的偶合分析。基的偶合分析。蛋白蛋白质质的的圆圆二色性主要由活性生色基二色性主要由活性生色基团团及折叠及折叠结结构两构两89l肽键是高度有是高度有规律排列律排列的，其排列的方向性决的，其排列的方向性决定了定了肽键能能级跃迁的分迁的分裂情况。具有不同二裂情况。具有不同二级结构的蛋白构的蛋白质或多或多肽所所产生生CD谱带的位置、的位置、吸收的吸收的强弱都不相同。弱都不相同。因此，根据所因此，根据所测得蛋白得蛋白质或多或多肽的的远紫外紫外CD谱，能反映出蛋白，能反映出蛋白质或或多多肽链二二级结构的信息，构的信息，从而揭示蛋白从而揭示蛋白质或多或多肽的二的二级结构。构。肽键肽键是高度有是高度有规规律排列的，其排列的方向性决定了律排列的，其排列的方向性决定了肽键肽键能能级跃级跃迁的分迁的分90 螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带，在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；折叠的CD光谱在216nm有一负谱带，在185200nm有一正谱带；转角在206nm附近有一正CD谱带，而左手螺旋P2结构在相应的位置有负的CD谱带，如上图和表所示。-band(nm)+band(nm)