植物逆境生理第六章植物盐胁迫响应及耐盐的分子机制课件

第六章 植物盐胁迫响应及耐盐的分子机制第一节 植物与盐胁迫第二节 植物耐盐的分子 机理第三节 盐胁迫信号的传导途径第六章 植物盐胁迫响应及耐盐的分子机制第一节 植物与盐胁迫第一节 植物与盐胁迫v一、盐碱土与土壤盐渍化v二、盐生植物及其系统演变v三、植物的盐害第一节 植物与盐胁迫一、盐碱土与土壤盐渍化 一些干旱和半干旱地区，由于蒸发强烈，地下水上升，使地下水所含有的盐分残留在土壤表层；又由于降水量小，不能将土壤表层的盐分淋溶排走，致使土壤表层的盐分越来越多，特别是一些易溶解的盐类，例如NaCl和Na2CO3等，结果就形成盐碱土壤。一些海滨地区，由于海堤崩塌，海水倒流，也会形成盐碱土壤。一般来说土壤中盐的种类决定土壤的性质，钠盐是造成盐害的主要盐类，NaCl和Na2SO4 含量较多称为盐土，Na2CO3与NaHCO3 含量较多称为碱土。而在自然界，这两种情况常常同时出现，统称为盐碱土。我国盐土通常分为滨海盐土、草甸盐土、沼泽盐土、洪积盐土、残余盐土和碱化盐土6个亚类，碱土包括草甸碱土、草原碱土和龟裂碱土3个亚类。中国盐碱地区主要分布在地势比较低平，径流较滞缓或较易汇集的排水不良地段，河流冲积平原、盆地、湖泊沼泽地区。如大西北的银川平原、河西走廊、甘肃和新疆的各河流沿岸的阶地、吐鲁番盆地、塔里木盆地、准噶尔盆地、哈密倾斜平原以及青藏高原的柴达木盆地和湟水流域、东北的松嫩平原等。土壤盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题。据世界粮农组织和教科文组织的统计，全球有各种盐渍土约9.5亿公顷，占全球陆地面积的10%，广泛分布于100多个国家和地区，亚洲约有3.2108公顷，约占全球的1/3。而且，由于土壤的次生盐渍化，世界盐渍土面积还在不断增加，据巴基斯坦Nazir Ahmad（1965）的统计，巴基斯坦3500万亩总灌溉土地中，次生盐渍化面积达530万亩，叙利亚每年约有20000公顷土地因次生盐渍化而丢弃，美国每年新增盐渍土约80000至120000公顷。我国尽管尚未见有这方面全国性的统计资料，但有关黄河三角洲的一项区域性调查表明，该地区每年约有5%的农耕地因土壤次生盐渍化而撂荒。来自世界粮农组织和教科文组织的一项统计报告表明，全球灌溉土地面积中，约50%的土地不同程度上遭受着土壤的次生盐渍化和水淹的危害，每年约有1000万公顷的土地由于土壤的次生盐渍化而丢弃。土壤盐渍化问题可谓触目惊心！但更值得警觉的是，土壤盐渍化总是发生在干旱、半干旱地区的绿洲地带,和经济比较发达的沿海地区、各大河流三角洲和土壤肥沃的冲积平原，其生态破坏性和对人类生存的危害显而易见。由于土壤次生盐渍化导致生态破坏、危害农业生产和人类生存的例子屡见不鲜：我国70年代中后期在莱州湾地区发生的海水入侵灾害，导致约6万亩土地次生盐渍化，因土壤盐渍化每年减产粮食达40%，十年间造成经济损失数十亿元，土壤中有机质、速效磷、速效氮和全氮大幅度下降，区域生态系统严重破坏，据世界粮农组织1971年的调查，因土壤盐渍化叙利亚每年约有30000公顷土地产量下降50%，约60000公顷土地产量下降20%，古美索不达米亚文明和先哥伦比亚文明的消亡很大程度上也是土壤盐渍化的结果。另据联合国环境规划署（UNEP）的调查统计，在旱地土壤退化中，因土壤盐渍化造成的土地荒漠化约为111.5万km2，仅次于风蚀和水蚀，居第三位。而土地荒漠化是目前世界上最严重的资源与环境问题之一，仅19841985年间，因土地荒漠化导致非洲约1000万人离乡背井，约3000万人因此受到饥饿，因荒漠化每年生产损失达260亿美元，为防止荒漠化，每年还要投资45亿美元。这些实例表明，土壤盐渍化已经，并还在成为危及人类生存的重大资源与环境问题。土壤盐渍化这一古老的生态灾难再一次向人类提出了严峻警告。二、盐生植物及其系统演变二、盐生植物及其系统演变 盐胁迫可能是地球上生命在进化中遇到的第一个化学胁迫，因为生命是起源于海洋的，受到盐胁迫的植物通常也受到渗透胁迫、水胁迫和低氧压胁迫等。生活在高盐地区的植物也都进化出一些相应对策来适应和对抗盐胁迫。以往的研究已经发现，盐胁迫会诱发植物体内多种结构和功能的改变，以利于植物适应新环境。近年来，分子生物学、基因工程技术、膜片钳技术、突变体筛选等研究方法的应用，使人们对植物耐盐分子机制有了进一步认识。尽管没有详细资料记载，人类是何时开始认识盐渍土、改造盐渍土的，但可以肯定地说，人类与盐渍土之间的斗争历史是悠久的。总结已有经验，人类治理和利用盐渍土不外乎两种途径：一是基于对盐渍土本性的探索和认识，通过工程的、化学的、物理的和生物的措施，治理和改良盐渍土，使其适应更多作物的生长；二是通过对植物抗盐机理的深入研究，选择、引种和培育新的抗盐经济作物，使其适应盐渍土环境。对第一种途径的探索和尝试，可以说人类付出了巨大努力，目前对盐渍土的形成机理、发生发展规律已经有了深刻的了解，工程治理盐渍土在某些地区也取得了巨大成功。然而，盐渍土治理过程中，人们发现，抬高地面、淡水压碱、淡水洗盐等工程治理措施的应用，受到气候、水文条件的严重限制，它只适合降水较大和淡水资源丰富的地区，而且投资巨大，易造成土壤反盐。经历长期、反复的探索和实践之后，第二种途径越来越引起人们的重视和青睐，20世纪30年代以来，地中海、南美洲、北美洲、墨西哥、巴林岛、阿拉伯地区、澳大利亚、以色列等国家和地区都加快了对本地区盐生植物资源的调查和开发利用。关于盐生植物的概念，目前有着不同的定义。实践中，人们常把生长在盐沼、盐碱荒漠等含盐环境中的植物称做盐生植物（halophyte）。19世纪，阿拉伯人把体内含盐的植物称为盐生植物，相 应 地，不 含 盐 的 植 物 就 叫 作 甜 土 植 物（glycophyte）；1980年Greenway给盐生植物的定义则是：能在3.3 bar（相当于70 mmol/l单价盐）渗透压盐水生境中自然生长的植物区系。Greenway的定义目前被较多地采用，但该定义没有区分盐渍土类型。事实上不同类型的盐渍土对植物的危害程度差异很大。植物的耐盐力不仅与土壤盐分含量有关，而且还受到盐分组成、土壤质地、当地气候条件的影响，因此，盐生植物应该是指在当地重盐渍土生境中正常生长并完成其生活史的自然植物区系，这一定义与当地盐渍土的划分相联系，便于实际应用。更科学的定义应该根据植物的耐盐能力来划分，这一划分首先要基于对众多植物耐盐生态生理及耐盐能力的测试和排序，限于目前仅有很少一些植物的耐盐能力通过测定，因此，对盐生植物的定义和划分，目前也只能是定性的描述，尚缺乏定量的分析。有很多文献对滨海盐生植物和内陆盐生植物进行过研究。Aronson汇集了许多人的研究，在其“世界盐生植物”一书中，收集到盐生植物1560余种，隶属117科，550余属，其中，沉水植物6科，40余种，低海岸盐生植物8科12属。从对这些盐生植物的生活型分布和科属分布看，大约90%的种为多年生植物，一年生植物及其他类型的种约占10%12%，多年生植物中，乔木与灌木约占47%。尽管在某些特定的地理区域，一年生盐生植物占据绝对优势，但多数环境中，多年生的盐生植物常常构成盐生植物群落的优势种。目前，记载的盐生植物中，绝大部分为被子植物，被子植物中又以双子叶植物居多。被子植物中约1/3的科属有盐生植物分布，约一半的盐生植物集中分布于20个科中。裸子植物中很少有盐生植物分布（4属），被认为是缺乏比较进化的气孔和表皮。基于对已记载的盐生 植物的分析，黎科植物中盐生植物最多，仅滨藜属植物大约400余种，其次是番杏科、石竹科、十字花科、禾本科、菊科、豆科和白花丹科。许多区域性的调查，如墨西哥、北美洲、非洲、地中海、前苏联、澳大利亚、以色列、埃及、中国等，也都反映出同样的规律：藜科中的滨藜属、藜属、碱蓬属、猪毛菜属、盐角草属、盐节木属、盐穗木属，禾本科的碱茅属、鼠尾粟属、网茅属、大米草属，以及菊科、豆科、白花丹科、柽柳科植物在区域盐生植物群落组成中占据支配地位，而很少见到盐生裸子植物。这些结果提示，盐生植物的进化可能是一种次生进化，是沿海藻 淡水藻 甜土植物（被子植物、裸子植物、蕨类、苔藓）陆生盐生植物海生大型植物的过程进化而来。然而，也有观察支持相反的观点，认为 非盐生植物是从盐生植物进化而来。这些观察 包括：对芒麦草（Hordeum jubatum）起源的认识，Chapman（1970）对 栽 培 甜 菜（Beta vulgaris）祖先盐生甜菜（Beta vulgaris ssp.maritima）的发现，以及非盐生植物抗盐机理脉内再循环的发现。三、植物的盐害三、植物的盐害 土壤中盐分过多，危害植物的正常生长，称为盐害。一般来说，当土壤中的盐浓度足以使土壤水势显著降低（降低0.050.1 MPa）时，即被认为是盐害。实际上，当土壤中盐分过多时，其水势的降低远远超过0.1 MPa。一般将植物盐害分为原初盐害和次生盐害。在原初盐害中又可分为直接原初盐害和间接原初盐害。直接原初盐害主要指盐胁迫对质膜的直接影响，如膜的组分、透性和离子运输等发生变化，使膜的结构和功能受到伤害。质膜受到伤害后，进一步影响细胞的代谢，从而不同程度地破坏细胞的生理功能，这就是间接原初盐害。次生盐害是由于土壤盐分过多，使土壤水势进一步下降，从而对植物产生渗透胁迫。另外，由于离子间的竞争也可引起某种营养元素的缺乏，从而干扰植物的新陈代谢。图6-1概括了盐害类型及其相互关系。图 6-1 盐分过多对植物的伤害（Levitt,1980）盐害原初盐害次生盐害直接盐害（质膜变化）间接盐害（代谢变化）渗透效应营养缺乏降低彭压生长抑制其他脱水效应透性或运输变化 增大蛋白质疏水性和降低蛋白质静电强度离子外渗 酶活化或钝化干扰所以代谢过程（一）原初盐害 1原初直接盐害 在20世纪50年代，人们开始注意到盐的原初伤害作用。一般认为这种盐害是由盐离子直接诱导的质膜透性增大和对质膜的某种效应形成的，并且推测这种伤害变化发生在膜脂和膜蛋白方面。原初直接伤害的证据是，生长在25 mmol/L NaCl或Na2SO4溶液中的菜豆，其叶片中的K+强烈外流，如果在这种溶液中加入2 mmol/L Ca2+，则可以阻止这种Na+诱导的K+的外流；如果用200 mmol/L甘露醇溶液处理，则对大麦根保持K+的能力没有影响。因此认为这种K+的外流不是渗透效应，而是盐离子破坏质膜透性的结果。（1）离子毒害 一般植物不能在高盐度盐渍化土壤上正常生长的原因之一是高浓度Na+对植物的毒害作用。高浓度Na+可置换质膜和细胞内膜系统所结合的Ca2+，膜所结合的离子中Na+/Ca2+比增加，膜结构完整性及膜功能受到破坏，致使细胞内+、磷和有机溶质的外渗，细胞+/Na+下降，抑制液泡膜+-PPase(焦磷酸酶)活性和胞质中的+跨液泡膜运输，跨液泡膜运输的pH梯度下降，液泡碱化，不利于Na+在液泡内积累。（2）活性氧伤害 在盐胁迫等逆境条件下，植物体内活性氧代谢系统的平衡受到影响，增加活性氧如O2-、H2O2、OH的产生量，破坏或降低活性氧清除剂，如SOD、CAT、POD、Vit E、GSH等的活性和含量水平。体内活性氧含量增高能启动膜脂过氧化或膜脂脱脂作用，膜脂过氧化分解和膜脂脱脂作用导致膜的完整性降低，差别透性丧失，电解质及小分子有机物大量渗漏，细胞物质交换平衡破坏，进而导致一系列生理生化代谢紊乱，使植物受到伤害。2原初间接盐害 (1)光合作用受抑制 盐分过多使PEP羧化酶和RuBP羧化酶活性降低，叶绿体趋于分解，叶绿素被破坏。叶绿素和类胡萝卜素的生物合成受阻，气孔关闭，使光合速率下降，影响作物产量。在土壤含盐量超过0.35%时，土壤中大量的可溶性盐分可导致土壤水势及水分有效性显著降低，使作物立苗困难。高盐造成植物叶片气孔失水关闭，以保持叶片内相对较高的水势，进而严重阻碍了CO2进入叶肉细胞，降低了植物的光合作用。研究表明，NaCl短期处理，菠菜光合作用的下降以气孔限制为主，而在长期处理下光合作用的非气孔限制增大。(3)呼吸作用改变 一般来说，低盐时植物呼吸受到促进，而高盐时受到抑制。盐分过多时总的趋势是呼吸消耗量多，净光合生产率低，不利于植物生长。(4)蛋白质合成受抑制 盐分过多对蛋白质代谢影响比较明显，抑制合成促进分解。抑制蛋白质合成的直接原因可能是由于破坏了氨基酸的合成，如蚕豆在盐胁迫下叶内半胱氨酸和蛋氨酸合成减少，从而使蛋白质含量减少。(5)积累有毒物质 盐胁迫使植物体内积累有毒的代谢产物，如蛋白质分解的产物游离的氨基酸、胺、氨等的积累，这些物质对植物有毒害作用，致使植物叶片生长不良，抑制根系生长，组织变黑坏死等。毒素积累是盐害的重要原因。（二）次生伤害 1水分亏缺 土壤盐分过多使植物根际土壤溶液渗透势降低，根据水从高水势向低水势流动的原理，这就给植物造成一种水逆境，植物吸水困难，此时植物要吸收水分，必须形成一个比土壤溶液更低的水势，否则植物将受到与水分胁迫相类似的危害，处于生理干旱状态。如一般植物在土壤盐分超过0.2%0.5%时出现吸水困难，盐分高于0.4%时植物体内水分易外渗，生长速率显著下降，甚至导致植物死亡(图6-2)。图图 6-2 6-2 盐胁迫对植物生长的影响盐胁迫对植物生长的影响 2营养亏缺(养分离子吸收不平衡)盐分胁迫所诱导的营养亏缺，主要是由于植物在吸收矿质元素的过程中盐与各种营养元素相互竞争，从而阻止植物对一些矿质元素的吸收而造成的。最常见的就是由NaCl所引起的缺K。例如，西葫芦和白香草木樨（Melilo-tusalba）用NaCl处理后，植株的下部缺K。原因是Na+与具有低亲和性机制的K+吸收竞争，以及在盐碱土壤中K+的量比Na+少得多。如果足够的Ca2+存在，有利于K+运输的高亲和性吸收系统能够更好地运转，植物能获得足够的K和限制Na的吸收。近几年来，还发现Ca2+能克服Na+的有害作用。例如，玉米根的生长对75mmol/L NaCl高度敏感，假如在NaCl处理前提供10mmo1/L Ca2+，这种效应就能完全被Ca2+抵消。一些实验表明，Ca2+能保护膜不受Na+的毒害，维持膜的完整性和减少细胞质K+的渗漏。盐胁迫下造成养分不平衡的另一方面在于Cl-抑制植物对NO3-及H2PO4-的吸收，其原因可能是这些阴离子之间存在着吸收竞争性抑制作用。第六章 植物盐胁迫响应及耐盐的分子机制第一节 植物与盐胁迫第二节 植物耐盐的分子 机理第二节 植物耐盐的分子机理v一、植株形态上的盐适应v二、细胞的渗透调节v三、拒盐机理v四、盐分的外排和细胞内区隔化v五、调控钾离子运输系统v六、调控水通道蛋白v七、改变光合作用途径v八、活性氧的清除第二节第二节 植物耐盐的分子机理植物耐盐的分子机理 植 物 的 盐 适 应 主 要 有 排 盐（salt excretion）、积盐（salt accumulation）和拒盐（salt exclusion）三种。盐生植物一般为排盐或积盐型，淡土植物通常为拒盐型。植物抗盐性并不只在种属间才存在差异，由于所处生态环境的不同，长期的驯化适应可以在同种植物不同生态型之间，甚至同一群体的不同个体之间都存在广泛的差异。然而，迄今为止，植物耐盐的分子机理仍不十分清楚。一、植株形态上的盐适应一、植株形态上的盐适应 泌盐盐生植物的叶片或茎表皮细胞可分化成盐腺，以此来排除体内多余的盐分,从而减轻盐对植物的伤害。盐腺有单细胞和多细胞两类，如滨藜属植物的盐腺是由一个囊泡组成，补血草的盐腺则由20个细胞组成，而红树植物桐花树的盐腺则是由5个部分的细胞组成的。稀盐的盐生植物，其叶和茎不断地肉质化，体内能储存大量的水分，使盐分浓度降低到不至使植物受到伤害的水平，如碱蓬属植物就是靠叶和茎的肉质化来实现其抗盐的。近年的研究发现，稀盐植物叶和茎的肉质化是由Na+来启动的，其原因可能与Na+诱导ATP的合成促进薄壁组织细胞分裂和原生质膨胀有关。拒盐盐生植物抗盐机理，一般认为与其根细胞的质膜组成有关。Kuiper发现盐生植物细胞膜脂中单半 乳糖二甘油脂(MGDG)含量低，盐离子不易通过质膜，提高了抗盐性。另外，盐生植物根细胞膜的不饱和度小，盐离子也不易通过，可能也与其抗盐有关。陆静梅等发现了松嫩平原的4种盐生植物中，它们的根都发育出不同程度的通气组织，提出与盐生植物对盐分的适应性有一定的关系。二、细胞的渗透调节二、细胞的渗透调节 渗透调节能力是植物耐盐的最基本特征之一。与耐旱性不同，参与盐胁迫植物渗透调节过程的渗调物质基本上分为两大类，一是外界环境进入植物细胞内的无机离子，如微生物和盐生植物中的K+和Cl-，高等淡土植物的有机酸钾；二是在细胞内合成的有机溶质。有机和无机渗透调节物质在植物对盐胁迫的适应中都有重要作用。虽然从能量消耗的角度看，积累有机溶质需要多消耗几十倍的能量，但作为“亲和性溶质”，对于植物生存是必须的。植物受到渗透胁迫时，通常在细胞内积累渗透保护物质(osmo-protectant)以降低细胞的渗透势（图6-3），由于它们不干扰细胞内正常的生化反应，因此，将它们统称为相容性溶质(compatible solute)。有机渗调物质大致可分为三类，即 图图 6-3 6-3 盐胁迫下植物细胞的渗透调节盐胁迫下植物细胞的渗透调节 氨基酸及其衍生物(如甘氨酸甜菜碱、脯氨酸、甘氨酸、-丙氨酸、-氨基丁酸、苏氨酸等)、糖类及其衍生物(如山梨糖醇、甘油、甘露糖醇、赤藓糖苷、异赤藓糖苷等)和叔硫酰化合物(如-二甲基硫代丙酸)。人们设想利用分子生物学方法，改变非盐生植物的代谢途径，诱导相容性溶质的生物合成，从而提高非盐生植物抵御渗透胁迫的能力。维管植物主要积累脯氨酸和甘氨酸甜菜碱。据报道，许多植物，特别是藜科和禾本科植物在盐分胁迫条件下，细胞中积累甜菜碱，其积累水平与植物抗胁迫能力成正比。甜菜碱是另一种广受关注的有机渗透调节物质。甜菜碱的生理功能主要有，参与细胞渗透调节功能，参与稳定生物大分子的结构和功能，影响离子在细胞内的分布。其他相容性物质的特殊功能有，参与胁迫条件下的光呼吸过程，参与羟自由基的清除等。在高等植物体内，甜菜碱是在叶绿体基质中，由胆碱经两步氧化合成的，它的积累可保持细胞渗透平衡和稳定复合蛋白的四级结构，但 其机理尚不清楚。高粱中甜菜碱的含量在缺水时可增加26倍。有关多胺类物质与植物耐盐性的关系也得到了普遍关注，详情见本书第九章。三、拒盐机理三、拒盐机理 是指在确保其他离子吸收的条件下，植物细胞选择性地排斥Na+，不让其透过质膜。研究显示，介导Na+跨质膜吸收的途径可能有三种，即高亲和K+转运体（HKT1），低亲和阳离子转运体（LCT1）和非选择性阳离子通道（NSCC），其中由非选择性阳离子通道介导的Na+跨质膜吸收进入植物体内的途径得到了较为普遍的认识（图6-4）。研究表明，耐盐植物在盐胁迫下质膜非选择性阳离子通道的运输活性下降，以减少Na+进入细胞。降低地上部分盐分浓度也是植物耐盐的重要机理之一。盐胁迫后耐盐植物杜梨幼株可以将根系吸收的Na+留在根系和根茎部位，减少向茎、叶片部位的运输。耐盐大麦叶片中Na+、Cl-含量低的原因主要是根系对Cl-的吸收较低，而所吸收的Na+留存于根中较多，向地上部分运输较少。Durand和Lacan(1994)研究发现，进入栽培大豆木质部液流中的Na+在向叶片运输过程中可被木质部薄壁细胞截留，并重新吸收，跨膜横向运输至韧皮部，再运送到根系，所以茎基部Na+含量显著高于叶片，但对Cl-无此作用，并且他们于1996年提出了Na+通过质膜Na+/H+逆向运输方式进入木质部薄壁细胞的假说。耐盐芦苇最明显的特征是限制Na+向地上部运输，即使在500 mmol/L NaCl盐度下，其叶渗透溶质也主要是K+、Cl-和蔗糖，Na+还不到10%。四、盐分的外排和细胞内区隔化四、盐分的外排和细胞内区隔化 Na+从细胞内排出需要逆着其电化学势转运，是一个主动运输的过程。海藻质膜上存在Na+-ATPase，通过水解ATP驱动Na+向胞外运输。高等植物的排Na+机制主要与质膜Na+/H+逆向转运蛋白有关，质膜H+-ATPase用水解ATP释放的能量把质子从细胞内泵出细胞，产生跨膜的质子电化学势梯度，提供能量驱动膜上的Na+/H+逆向转运蛋白，使质子顺电化学势梯度进入细胞，同时Na+逆化学势排出细胞（图6-4）。Shi等（2002）从拟南芥中克隆了SOS1基因，它编码的蛋白与细菌和真菌的质膜Na+/H+逆向转运蛋白具有非常高的同源性，拟南芥SOS1突变体对盐超敏感，表明SOS1在植物耐盐机制中起重要作用。图图 6-4 6-4 盐离子进入植物细胞的途径及在细胞内的区隔化分布盐离子进入植物细胞的途径及在细胞内的区隔化分布 液泡是植物成熟细胞内的最大细胞器，体积占细胞总体积的80%以上。液泡在膨压调节、代谢产物储存、有毒物质积累和信号转导等方面起重要作用。盐生植物和较耐盐的淡土植物细胞所吸收的Na+和Cl-主要分布在液泡内作为渗压素。液泡膜上存在两类质子泵，分别为H+-ATPase和H+-PPase，它们分别通过水解ATP和PPi，向液泡内转运质子，在膜两侧形成质子梯度，作为驱动力通过液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白，将细胞质中的Na+泵入液泡内（图6-4），减轻细胞质中Na+对蛋白质的毒害作用，同时又起到渗透调节作用，缓解水分胁迫。进入根细胞内的Na+在液泡中积累后，可以减少向地上部运输，减轻对地上部光合功能的影响。因此，液泡膜上的Na+/H+逆向转运是细胞 盐分区室化的基础，也是植株层次上盐分区域化分配的重要组成部分。液泡膜Na+/H+逆向转运活性首次在甜菜贮存组织中被发现，此后在盐生和耐盐淡土植物上也发现了逆向转运体活性。目前已从拟南芥中克隆了Na+/H+逆向转运体基因（AtNHX1），转入该基因的拟南芥植株在200mmol/L NaCl胁迫下正常生长和发育，表明Na+/H+在植物耐盐性中具有重要功能。在根、茎、叶和花组织中均能检测到AtNHX1基因的转录。五、调控钾离子运输系统五、调控钾离子运输系统 棉花耐盐性的一个重要特点是Na+在茎中和叶柄中滞留和积累，根中的K+向上部选择运输，以维持叶片较高的K+/Na+。K+是高等植物中含量最丰富的阳离子，对于植物营养、生长、向性、酶平衡和渗透调节至关重要。植物从土壤中吸收K+主要通过高亲和性的钾离子运输系统。当土壤中钾离子含量很高时，也可以由钾离子通道来吸收。目前，已从植物中分离、纯化到了高亲和性钾离子运输系统和离子通道，并对它们的结构和功能进行了分析，高亲和性钾离子运输系统采用K+/H+共同吸收的方式来吸收K+，而K+离子通道可以选择地吸收K+。当细胞中盐分过多时，盐分就会干扰植物对K+的吸收。因此，在渗透胁迫下，提高编码高亲和性钾离子运输系统 和钾离子通道基因的表达量，增加细胞内K+的含量，把过多的盐分排出细胞外，将会提高植物的耐盐能力。六、调控水通道蛋白六、调控水通道蛋白 渗透胁迫下的水分供应，对于细胞进行正常代谢活动是非常重要的。水分胁迫下，冰草(ice plant)细胞内主要内在蛋白(MIP)量增加。这种蛋白与已知的动物或植物中的水通道蛋白具有很高的同源性。水通道蛋白可以形成选择性的水运输通道，允许水自由出入，而将离子或其它有机物拒之门外。目前，已从冰草中分离到编码水通道蛋白基因MIP。在盐胁迫下，MIP基因的转录水平大大提高。盐胁迫下，提高水通道的表达量，提高细胞膜的透水性，便于水分摄入，在没有蒸腾作用下，将水分迅速吸收到根中，并长距离运输到地上组织器官，将是耐盐基因工程的一条新途径。植物水通道蛋白可分为三类：TIP，MIP和NLM。拟南芥中30个基因编码水通道蛋白，12种属于TIP，12种属于MIP，6种属于NLM。有些是组成性表达的，有些能为干旱和盐诱导；也有的为激素如ABA，GAs等诱导。水通道蛋白的活性还受磷酸化调节，如大豆种子液泡a-TIP菠菜质膜PM28A都能被磷酸化，而且这种磷酸化依赖Ca2+，估计此磷酸激酶是一种CDPK。此外水通道蛋白还能够缓冲胞质中的渗透震荡，这是因为液泡膜比质膜更易透水。有人通过构建拟南芥水通道蛋白基因AthH2的反义载体，降低了拟南芥内AthH2的表达，导致质膜的透水性下降约3倍，只有通过增加根的数量(约5倍)来补偿。七、改变光合作用途径七、改变光合作用途径 一些肉质植物，如豆瓣绿属植物、马齿苋科植物以及番茄科植物冰草等，在盐渍或水分胁迫下可以改变光合碳同化途径，即由C3途径变为CAM途径。CAM植物在夜间开放气孔进行CO2的吸收和固定，白天气孔关闭减少蒸腾失水，这是一种对环境干旱的适应。Winter等测量CO2固定和PEP羧化酶活性证实光合作用转变是受盐诱导的。整个光合作用途径转变是一个十分复杂的过程，涉及到的基因很多，利用改变植物光合作用的途径提高植物耐盐性将十分困难。八、活性氧的清除八、活性氧的清除 植物的膜系统主要是由膜脂和膜蛋白组成的。当植物受到盐胁迫时，体内会产生大量的氧自由基，既活性氧，从而引起膜脂的氧化伤害。植物体内存在有抗氧化的过氧化酶系统，当受盐胁迫时，过氧化酶系统活动加强，以清除过多的活性氧。Huang(1995)报 道，经 高 渗 锻 炼 的 大 豆Kaoshium品种幼苗较未受锻炼的幼苗有较多的谷胱甘肽还原酶(GR)、抗坏血酸过氧化物酶(APOX)和脱氢抗坏血酸还原酸(DasAR)活性,有利于降低膜脂氧化程度，从而减轻盐胁迫伤害。第六章 植物盐胁迫响应及耐盐的分子机制第一节 植物与盐胁迫第二节 植物耐盐的分子 机理第三节 盐胁迫信号的传导途径第三节 盐胁迫信号的传导途径v一、渗透胁迫信号传导途径v二、SOS信号传导途径 第三节 盐胁迫信号的传导途径 高等植物体内盐胁迫信号传导途径包括两部分：渗透胁迫信号传导途径和调控细胞内外离子平衡的信号（即SOS信号）传导途径，其中渗透胁迫信号传递途径又包括ABA介导的信号传导和不依赖于ABA的信号传导（图6-5）。离子胁迫SOS途径离子转运体离子平衡盐胁迫 细胞平衡 渗透胁迫 ABA 渗透平衡 图 6-5 盐胁迫信号传导过程 一、渗透胁迫信号传导途径一、渗透胁迫信号传导途径 渗透胁迫会使植物丧失一定的水分并导致细胞膨压降低。这一变化可能会改变植物细胞壁与细胞膜的相互作用，并引起细胞膜上一些蛋白构象的变化，从而识别外界环境中的渗透胁迫信号。有关渗透胁迫的信号传导，目前对酵母的研究比较充分，从而为研究高等植物提供了有益的借鉴。植物和酵母相似之处颇多，如质膜、液泡膜H+-ATPase，K+转运体(Trk-HKT和HAT)，Na+H+逆转运体，外整流K+通道(Tokl-ORK)和C1-道(Gefl-CLC)，不同之处在于酵母无内整流型K+离子通道和液泡膜H+-PPase，植物无Na+-ATPase。在酵母中已经全面阐明了两条渗透胁迫的信号通路：Calcineurin途径和HOG1途径。Calcineurin是一种Ca2+和CAM依赖的蛋白磷酸酶，包括催化亚单位CnA和调节亚单位CnB。CnB有4个高亲Ca2+的EF手形结构，CnA的完全活化需要Ca-CnB、Ca-CaM复合物。Calcineurin调节Na+、K+、Ca2+离子的平衡。CnB的功能丧生导致对Na+、Li+的高敏感性。Calcineurin通过磷酸化Na+和Ca2+-ATPase基因转录因子CRZ1TCNl调节CRZ1TCN1的核内定位，从而调控上述基因表达的。Calcineurin的最初信号输人是盐害引起的Ca2+浓度升高，而Na+的感受器(sensor)至今仍不明。酵母calcineurin也参与调控K+运输，盐害下K+吸收转变为高亲K系统(HKT1)，而Calcin-eurin直接或间接的调节高亲K+系统的磷酸化状态而影响K+的吸收。其功能可能是磷酸化一些受ABA诱导的转录因子，调节其活性使其识别渗透胁迫相关调控渗透胁迫HOG1途径包括感受低渗胁迫的途径SHO1PBS2 HOGl和感受高渗的SLNlSSKlSSK2或SSK22 PBS2HOG1。SLNl是感受器，SSK1是调节器，构成双组分系统。下游的SSS2/SSK22，PBS2和HOG1组成MAPK通路，分别相当于MAPKKK、MAPKK和MAPK。磷酸化的HOG1转运至细胞核，并磷酸化一个或多个转录因子，从而诱导GPD1(甘油-3磷酸脱氢酶)及其他基因的表达，最终导致甘油的合成，而甘油是酵母中主要的渗透调节剂。在高等植物体内，存在两条渗透胁迫信号传递途径，一条为ABA介导，一条不依赖于ABA。Anderberg等(1992)从小麦中克隆了一个受ABA和脱水胁迫诱导的蛋白激酶同源蛋白PKABAl。PKABA1含有丝氨酸苏氨酸蛋白激酶保守的结构域。基因启动子中的ABA反应元件，从而调节这些基因的表达。Leung(1997)分离了一些对ABA不敏感的拟南芥突变体。在突变体中受ABA诱导的脯氨酸含量下降。两个突变基因abil和abi2被克隆。序列分析表明这两种基因编码蛋白相互同源，而且均为蛋白磷酸酶同源蛋白(PP2C类型)。其结构中含有保守的丝氨酸/苏氨酸结构域及Ca2+结合位点EF手象结构域。由于abil和abi2基因突变均能使拟南芥突变体对ABA不敏感，表明abil和abi2编码的蛋白磷酸酶是ABA介导的拟南芥渗透胁迫信号传递途径的一个组成部分。由以上分析可知在植物中存在一个由ABA介导的渗透胁迫信号传递途径，信号的传递可能是由蛋白激酶和蛋白磷酸化酶协同完成的。在植物中除了由ABA介导的渗透胁迫信号传递途径外，可能还存在一种不依赖于ABA的渗透胁迫信号传递途径。Jonak等(1996)研究报道在植物苜蓿中存在一种蛋白激酶MMK4。MMK4是MAP信号途径MAPKKK、MAPKK、MAPK中MAPK的同源蛋白。干旱胁迫能诱导MMK4基因转录水平升高，但干早胁迫不能诱导MMK4蛋白的积累，表明MMK4激酶的活性是翻译后水平调控的。ABA不能诱导MMK4基因mRNA水平升高，而且MMK4激酶活性也不能被ABA激活，表明苜蓿中MMK4激酶介导的干旱胁迫信号传递途径不依赖于ABA。研究还发现尽管干早胁迫能激活MMK4激酶，但MMK4激酶活性却不能被其它一些胁迫因子，如盐胁迫所诱导，表明在苜蓿中不同的胁迫信号可能由不同的信号传递途径介导。二、SOSSOS信号传导途径 SOS(salt overly sensitive)信号传导途径是由Arizona大学的朱健康研究室最先从拟南芥体内发现的，该途径介导了盐胁迫下细胞内Na+的外排及向液泡内的区域化分布。通过快中子轰击或T2 DNA诱变方法得到了大约250 000株拟南芥，然后在含NaCl的琼脂培养基上对它们进行根部弯曲检测，结果获得了40多个SOS突变体。在这些SOS突变体之间又进行等位性检测，最后把这些突变体归为5组，定义了5个耐盐基因：SOS1、SOS2、SOS3、SOS4 和SOS5，其中SOS1、SOS2 和SOS3 三个基因参与介导了细胞内离子平衡的信号传递途径。（一）SOS1基因 1SOS1基因的定位克隆 SOS1基因是植物耐盐性的一个必需基因，SOS1突变体是通过T2 DNA插入法得到的，这些SOS1突变体使拟南芥对高浓度Na+或低浓度K+环境相当敏感。运用分子标记技术SSL P对SOS1突变体进行检测、标记。发现SSL P标记NGA1145靠近2号染色体，并与SOS1突变体紧密连锁。又借助于BAC克隆技术，把SOS1定位在70kb 范围内，位于SSL P分子标记T23K3到1和F14H20到3之间。从SOS1突变体中扩增出这个区域的候选基因，并对它们进行测序，利用快中子轰击进一步分析发现：其中一个候选基因含有一个在所有SOS1突变体中都含有的变异。每个变异都导致核苷酸变化。互补实验进一步证实了这个假定的基因是SOS1。它位于2号染色体上。2SOS1 编码一个假定的质膜Na+/H+逆向转运因子 SOS1编码了一个1146个氨基酸残基的多肽，该多肽的分子量是127KD，SOS1的N端具有高度疏水特性，并带有12个转膜区域。SOS1的转膜区域和动物或微生物的Na+/H+逆向转运因子相当相似。例如：SOS1与来自于中国大鼠(Chinese hamster)的NHE1具有26%同一性和45%相似性；SOS1与来自于P.aeruginosa 的Nhap具有31%同一性和48%的相似性，SOS1的C-端具有亲水性并残留在细胞质中，这个长的亲水的C-端尾部使SOS1成为已知的最大的Na+/H+逆向转运因子。3盐胁迫正调控SOS1 基因的表达 运用Northern分析检测SOS1基因在盐胁迫下的表达情况：在没有盐胁迫因子存在的情况下，检测到SOSmRNA；盐胁迫因子正调控SOS1 mRNA，SOS1转录的稳定态是由盐胁迫反应基因正调节的，这个调控是针对NaCl的，它不发生在ABA或冷害处理的条件下。SOS1mRNA在拟南芥的根部的含量比在枝叶中多，在根部和地上部，SOS1的表达都是由NaCl胁迫因子正调节的，这个正调控是与SOS1耐Na+离子的作用相一致的。NaCl胁迫因子也正调节着编码质膜H+-ATP酶的基因的表达，H+-ATP酶表达的加强能提高质子转运的能力，这对提高Na+/H+逆向转运因子的活性具有重大意义。（二）SOS2 基因 1SOS2 基因的定位克隆 SOS2基因是拟南芥中的重要耐盐基因，SOS2基因的突变完全降低植物在高浓度Na+和低浓度K+环境下的忍耐性，根据这个突变特性，SOS2可能编码一个调控蛋白，该蛋白能控制和激活K+和Na+转运蛋白，该蛋白能控制和激活K+和Na+转运蛋白的活性。SOS2基因是通过定位克隆得到的，通过与SOS2-2突变体进行杂交，SOS2与SOS2landsbery生态型等杂交得到SOS2基因图谱，在分析1230个重组染色体的基础上，SOS2基因被定位在5号染色体上，一个60kb范围内。2SOS2编码一个假定的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 SOS2基因编码一个446氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白激酶分子质量为51KD。其N-端大约有270氨基酸，它组成激酶的催化区域，SOS2的C-端是它的调控区域。催化区与酵母SNF1(sucrose nonfermentingl)和哺乳动物AmP-活性蛋白激酶(AmPK)非常相似。但是，SOS2与SNF1/AmPK在序列、功能和调控作用方面有明显的不同：首先，SOS2功能主要体现在Na+和K+体内平衡和耐盐(Na+)方面，而不是体现在新陈代谢方面；第二，SOS2 的调控区与SNF1/AmPK的有明显的不同；第三，SOS2的活性是Ca2+调控的，而不是由AmP调节的，SOS2的C-端调控区域在植物耐盐功能方面也起着必不可少的作用。3盐胁迫正调控SOS2基因在根部的表达 为了分析研究SOS2基因在盐胁迫下表达情况，从培养基中取出10天大小的拟南芥幼苗，将它们放在经过处理的滤纸上分别被处理3、6或12小时(这些滤纸是用含200mmol/LNaCl的Murashing和Skoog培养液浸泡过的)。作对照实验的植物用同样的方法进行处理，惟一不同的是浸泡滤纸的培养液中无NaCl。处理后，根部和地上部在下胚轴处被分开，运用SOS cDNA作探针进行Northern印迹分析。检测SOSmRNA结果显示，在根部和地上部存在SOS2的转录。这与SOS2突变体植物的根部和地上部对NaCl胁迫因素超敏感相一致的。SOS2在根部的表达是受NaCl胁迫因子正调节的。SOS2在缺少压力下的表达与它在最初信号转导产生盐适应性的作用是一致的。SOS2转录的正调控对在胁迫条件下保持足够重量的SOS2蛋白起着重要的作用。（三）SOS3 基因 1SOS3基因的定位克隆 SOS3基因是耐盐的必需基因，也是植物在低K+培养基上生长的必需基因，SOS3 基因位于5号染色体上，在分子标记NGAL39和CDPK9之间，AFL P分析把SOS3 位置限定在120 kb区域内，运用BAC标记方法发现，BAC毗连序列群与这个区域相连。运用互补测试的手段从SOS3突变体植物中鉴定出候选基因，进一步测序分析证明这个基因是SOS3基因。2SOS3 基因编码钙结合蛋白 SOS3基因编码带有3个EF-臂的钙结合蛋白，这个蛋白与钙调磷酸酶的B-亚基和动物神经传感器(NCA)最相似。钙调磷酸酶，含有一个具催化作用的A-亚基(Catalyti cA-Subunit(CnA)和一个具调控作用的B-亚基(CnB)，带有4个高亲和的EF-臂钙结合位点。钙调控过程包括T-细胞活化、嗜中性的趋化性和细胞程序化死亡，尽管这种蛋白的序列与钙调磷酸酶调控亚基(CnB)相似，但是它的功能却与CnB不同。SOS3 的钙结合特性在决定植物在Na+离子胁迫下钙信号的特殊性方面可能起重要作用。3SOS3基因编码了一个假定的N-豆蔻酸化序列 SOS3基因编码的氨基酸序列的最主要的特点是含有一个豆蔻酰化序列，位于氨基一端，SOS3的这个氨基酸序列与钙调蛋白酶的B-亚基(CNB)和动物神经钙传感器(NCS)相似。CNB和NCS都含有豆蔻酰化的鲜明特征。在作体外放射性标记时，要在豆蔻酸和N-豆蔻酰转移酶存在的情况下进行。SOS mRNA翻译实验结果表明：SOS3豆蔻酰化发生在甘氨酸-2。豆蔻酰化是SOS3功能所必需的，因为当甘氨酸-2突变成丙氨酸即能阻止豆蔻酰化作用，总之，豆蔻酰化作用能加强SOS3与一些膜区域的联系。（四）SOS基因的调控途径 运用大量遗传筛选的方法可从具有SOS表型的SOS突变体中分离基因。生长测量方法证明SOS 突变体对Na+或Li+高度敏感，而不是对一般的渗透压力超敏感。因为SOS2突变体不能生长在K+浓度低的培养基上。SOS1、SOS2和SOS3突变体的耐盐性与它们的组织中K+含量相关，而不是Na+含量。双突变体杂交实验表明，SOS基因家族在同样的途径上行使功能。SOS1和SOS3突变体在对Na+和Li+离子高度敏感和不能生长在低浓度K+培养基方面具有相似表型。因此，这两个SOS基因在调节K+营养和耐盐方面以相同的途径行使功能的。SOS3 钙传感器与SOS2蛋白激酶相互作用，SOS3与SOS2蛋白激酶结合后促进该酶活性增强，从而对SOS1进行正向调控（图6-6）。此外，激活的SOS2也可以对液泡膜上的AtNHX1(编码液泡膜Na+/H+逆向转运因子)进行正向调控，对液泡膜上的AtNHX1(编码液泡膜Na+/H+逆向转运因子)进行正向调控，在SOS2 中突变体，SOS1的正调控体现在地上部，而不是在根部。SOS2与SOS3调控途径也能在翻译后水平控制SOS1和 AtNHX1以 及 质 膜 AtHKT1活 性(图 6-6)，对AtHKT1的调控属于负调控，从而控制细胞内外Na+的平衡。也有证据显示，ABA介导的渗透胁迫信号传递途径也参与了细胞内离子的平衡过程，依赖于ABA的途径更可能调控了盐胁迫下液泡膜的AtNHX1基因的表达，而SOS途径则调控了表达产物Na+/H+逆向转运蛋白的运输活性。图图 6-6 SOS6-6 SOS基因家族介导的植物细胞内盐胁迫信号基因家族介导的植物细胞内盐胁迫信号的传导（的传导（Jian-Kang Zhu,2003Jian-Kang Zhu,2003）第六章 植物盐胁迫响应及耐盐的分子机制第一节 植物与盐胁迫第二节 植物耐盐的分子机理第三节 盐胁迫信号的传导途径思考题：1、盐碱土与土壤盐渍化防治？2、盐胁迫信号的传导途径与机理？