真菌感染与实验室诊断进展科室讲培训课程课件

真菌感染与实验室诊断进展科室讲真菌感染与实验室诊断进展科室讲1（优选）真菌感染与实验室诊断进展科室讲（优选）真菌感染与实验室诊断进展科室讲2 2条件致病菌机会来了！机会来了！念珠菌念珠菌曲霉菌曲霉菌Candida条件致病菌Aspergillus机会来了！念珠3 3条件致病真菌感染危险因素国外国外国外国外血液系统肿瘤病人血液系统肿瘤病人血液系统肿瘤病人血液系统肿瘤病人 粒细胞减少粒细胞减少粒细胞减少粒细胞减少 _ _骨髓移植骨髓移植骨髓移植骨髓移植器官移植器官移植器官移植器官移植ICUICUHIVHIV感染感染感染感染 国内国内:广谱抗生素应用广谱抗生素应用ICU皮质激素皮质激素糖尿病糖尿病静脉插管静脉插管条件致病真菌感染危险因素国外国内:4 4脓毒血症的发病率+600%+300%+300%脓毒血症的发病率+600%+300%+300%Martin 5 578798081828384858687888990919202468Aspergillus spp.Candida spp.All otherPrevalence at Autopsy%Groll et al,J Infect 1996;33:23-32.经经尸尸检证实检证实的侵的侵袭袭性真菌感染性真菌感染7879808182838485868788899091926 6国内侵袭性真菌感染的发病情况中华医学杂志中华医学杂志2003年年3月第月第83卷第卷第5期期国内侵袭性真菌感染的发病情况中华医学杂志2003年3月第837 720042008年中国年中国5家中心的家中心的念珠菌分布念珠菌分布百分比（）真菌20042008年中国5家中心的念珠菌分布百分比（）8 8侵侵袭袭性曲霉患者在血液科和性曲霉患者在血液科和ICU最最为为常常见见流行病学流行病学流行病学流行病学1994-19991994-1999年法国一项前瞻性调查结果年法国一项前瞻性调查结果年法国一项前瞻性调查结果年法国一项前瞻性调查结果Cornet m et al.J Hosp infect.2002;514:288-296侵袭性曲霉患者在血液科和ICU最为常见流行病学1994-19 9混合型真菌感染的混合型真菌感染的发发病率也逐年上升病率也逐年上升念珠菌念珠菌念珠菌念珠菌/曲霉混合感染曲霉混合感染曲霉混合感染曲霉混合感染8 811111212尸检检出率尸检检出率尸检检出率尸检检出率(%)(%)(%)(%)1989-19931989-1993年年年年1994-19981994-1998年年年年1999-20031999-2003年年年年Chamilos G,et al.Haematological.2006;91:986-989Chamilos G,et al.Haematological.2006;91:986-989一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示混合型真菌感染的发病率也逐年上升念珠菌/曲霉混合感染8111010MB80 微生物快速动态测定系统4th Trends in Medical Mycology.（13）D葡聚糖检测（G试验）血培养、骨髓培养2次生长同一种酵母菌；可疑感染10 20 pg/ml 25例ICU患者的尸体解剖研究曲霉是继念珠菌之后的第二常见真菌病原体卡氏肺孢子菌无法体外培养Clinical Infectious Diseases 2008;46:87885 EORTC/MSG定义：Clin Infect Dis 1998;26:781-805;Andriole VT.非白念珠菌和霉菌不断增加侵袭性曲霉患者在血液科和ICU最为常见Senn et al.美国大多数研究限于念珠菌菌血症 阳性结果代表存在侵袭性真菌感染新近出新近出现现少少见见真菌尸真菌尸检检检检出率也有所上升出率也有所上升足放线菌足放线菌足放线菌足放线菌镰刀菌镰刀菌镰刀菌镰刀菌0.20.20.90.90.40.40.70.70.70.71.41.4尸检检出率尸检检出率尸检检出率尸检检出率(%)(%)(%)(%)1989-19931989-1993年年年年1994-19981994-1998年年年年1999-20031999-2003年年年年Chamilos G,et al.Haematological.2006;91:986-989Chamilos G,et al.Haematological.2006;91:986-989一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示MB80 微生物快速动态测定系统新近出现少见真菌尸检检出率也1111Epidemiology and Outcomes of Candidemia in 2019 PatientsClinical Infectious Diseases 2009;48:1695703美国美国PATH网网络络：侵：侵袭袭性真菌病数据性真菌病数据库库念珠菌血症念珠菌血症2019例例(2004-2008)念珠菌血症菌种比例念珠菌血症菌种比例大部分患者为非粒缺患者大部分患者为非粒缺患者(占占92.7%)Epidemiology and Outcomes of C1212Epidemiology and Outcome of Invasive Fungal Infection in Adult Hematopoietic Stem Cell Transplant RecipientsClinical Infectious Diseases 2009;48:26573John Bartlett.2009 ICAAC.美国美国PATH网网络络：侵：侵袭袭性真菌病数据性真菌病数据库库成人成人HSCT患者的侵患者的侵袭袭性真菌病性真菌病(2004-2007)共共234例患者发生例患者发生250次侵袭性真菌感染次侵袭性真菌感染(确诊或临床诊断确诊或临床诊断)Epidemiology and Outcome of In1313真菌感染流行特点真菌感染流行特点 危险因素不断增多，发生率逐年增高危险因素不断增多，发生率逐年增高 白念珠菌仍然是最常见的致病菌白念珠菌仍然是最常见的致病菌 非白念珠菌和霉菌不断增加非白念珠菌和霉菌不断增加 曲霉已成为重要的致死真菌曲霉已成为重要的致死真菌真菌感染流行特点1414曲霉感染曲霉感染:日益日益严严重的重的问题问题曲霉是继念珠菌之后的第二常见真菌病原体虽然经过治疗，免疫抑制患者的死亡率仍达90%Andriole VT.J Antimicrob Chemother 1999;44:151-162;Groll AH et al.Adv Pharmacol 1998;44:343-500;Denning Andriole VT.J Antimicrob Chemother 1999;44:151-162;Groll AH et al.Adv Pharmacol 1998;44:343-500;Denning DW.Clin Infect Dis 1998;26:781-805;Andriole VT.Curr Clin Top Infect Dis 1998;18:19-36;Lin S-J et al.Clin Infect DW.Clin Infect Dis 1998;26:781-805;Andriole VT.Curr Clin Top Infect Dis 1998;18:19-36;Lin S-J et al.Clin Infect Dis 2001;32:358-366;Paterson DL,Singh N.Medicine(Baltimore)1999;78:123-138Dis 2001;32:358-366;Paterson DL,Singh N.Medicine(Baltimore)1999;78:123-138.曲霉感染:日益严重的问题曲霉是继念珠菌之后的第二常见真菌病1515深部真菌感染的诊断标准EORTC/MSG2008修订版宿主因素宿主因素宿主因素宿主因素临床特征临床特征临床特征临床特征病原学病原学病原学病原学真菌镜检真菌镜检真菌镜检真菌镜检真菌培养真菌培养真菌培养真菌培养组织病理学检查组织病理学检查组织病理学检查组织病理学检查血清学检查方法（间接证据）血清学检查方法（间接证据）血清学检查方法（间接证据）血清学检查方法（间接证据）CSF CSF隐球菌抗原阳性隐球菌抗原阳性隐球菌抗原阳性隐球菌抗原阳性确诊确诊确诊确诊 GMtest,Gtest GMtest,Gtest临床诊断临床诊断临床诊断临床诊断Clinical Infectious Diseases 2008;46深部真菌感染的诊断标准EORTC/MSG2008修订版宿1616其他微生物、动物及人的细胞不含该成份 25例ICU患者的尸体解剖研究Microbiol.O Marchetti.46:10091013Microbiol.阳性结果代表存在侵袭性真菌感染（13）D葡聚糖检测（抗真菌药物治疗后）The lancet,2003,3:230-240 阳性结果代表存在侵袭性真菌感染采用不染色湿片如KOH涂片或Gram染色涂片。只有2例（8）是真正的假丝酵母菌肺炎MB80 微生物快速动态测定系统 不能检测隐球菌和接合菌；虽然经过治疗，免疫抑制患者的死亡率仍达90%1,3-Beta-D-glucan antigenemia for early diagnosis of IFIs in neutropenic patients with acute leukemia.曲霉菌半乳甘露聚（GM）Diagnosis of invasive aspergillosis using a galactomannan assay-a meta-analysis.IFI诊断标准确诊确诊:病人有感染的危险因素病人有感染的危险因素;有临床症状有临床症状;微生物培养阳性微生物培养阳性;组组织检测阳性织检测阳性;临床诊断临床诊断:病人有感染的危险因素病人有感染的危险因素;高分辨高分辨CTCT出现阳性的影象特征出现阳性的影象特征.13D13D葡聚糖试验葡聚糖试验(G(G试验试验)阳性阳性.并值上升并值上升;广谱抗生素应用无效广谱抗生素应用无效;疑似疑似:病人有感染的危险因素病人有感染的危险因素;有临床症状或微生物检测有临床症状或微生物检测+其他微生物、动物及人的细胞不含该成份IFI诊断标准确诊:1717确诊符合下列符合下列1 1项即为有可靠的微生物学和项即为有可靠的微生物学和/或组织病理学证据。或组织病理学证据。肺活检标本真菌培养阳性和肺活检标本真菌培养阳性和/或组织病理学检查病变组织或组织病理学检查病变组织中发现真菌；中发现真菌；血培养、骨髓培养血培养、骨髓培养2 2次生长同一种酵母菌；次生长同一种酵母菌；血培养、骨髓培养生长双相型真菌；血培养、骨髓培养生长双相型真菌；骨髓涂片发现双相型真菌。骨髓涂片发现双相型真菌。确诊符合下列1项即为有可靠的微生物学和/或组织病理学证据。1818临床希望能鉴别念珠菌或丝状真菌白色念珠菌或非白念曲霉菌或毛霉菌是否卡氏肺囊虫临床希望能鉴别念珠菌或丝状真菌1919 微生物实验室检查真菌镜检真菌镜检真菌培养真菌培养组织病理组织病理生理生化生理生化血清学方法血清学方法分子生物学分子生物学 微生物实验室检查真菌镜检2020 真菌标本镜检 最简单也是最有用的实验室诊断方法最简单也是最有用的实验室诊断方法最简单也是最有用的实验室诊断方法最简单也是最有用的实验室诊断方法优点简便、快速，阳性结果可确定真菌感染，阴性结果不能排优点简便、快速，阳性结果可确定真菌感染，阴性结果不能排优点简便、快速，阳性结果可确定真菌感染，阴性结果不能排优点简便、快速，阳性结果可确定真菌感染，阴性结果不能排除诊断。除诊断。除诊断。除诊断。采用不染色湿片如采用不染色湿片如采用不染色湿片如采用不染色湿片如KOHKOH涂片或涂片或涂片或涂片或GramGram染色涂片。染色涂片。染色涂片。染色涂片。如在无菌体液的直接镜检中发现真菌，常可确立深部真菌病的如在无菌体液的直接镜检中发现真菌，常可确立深部真菌病的如在无菌体液的直接镜检中发现真菌，常可确立深部真菌病的如在无菌体液的直接镜检中发现真菌，常可确立深部真菌病的诊断。诊断。诊断。诊断。真菌标本镜检 最简单也是最有用的实验室诊断方法2121真菌直接涂片的真菌直接涂片的诊诊断价断价值值 有意义的涂片结果有意义的涂片结果 机体内部标本如血液、腹水、机体内部标本如血液、腹水、CSFCSF、脓肿穿刺液等、脓肿穿刺液等 新鲜尿液见到大量菌丝及孢子新鲜尿液见到大量菌丝及孢子 组织真菌涂片组织真菌涂片 直接镜检患者痰、喉或气管分泌物阳性率为直接镜检患者痰、喉或气管分泌物阳性率为10%10%到到30%30%真菌直接涂片的诊断价值 有意义的涂片结果2222真菌直接涂片的真菌直接涂片的诊诊断价断价值值诊断阳性率高诊断阳性率高BALFBALF培养阳性率培养阳性率4040，涂片，涂片6464，涂片培养，涂片培养6767(Ann Intern Med(Ann Intern Med 1997,29:535;Respir Med 1992,86:243)1997,29:535;Respir Med 1992,86:243)快速快速:24hr:24hr可以报告结果可以报告结果有助于鉴别感染类型有助于鉴别感染类型有隔菌丝曲霉菌属有隔菌丝曲霉菌属唑类抗真菌药（伊曲康唑、伏立康唑）有效唑类抗真菌药（伊曲康唑、伏立康唑）有效无隔菌丝无隔菌丝 根毛霉属、根霉属、毛霉属、犁头霉属、小克银汉霉属根毛霉属、根霉属、毛霉属、犁头霉属、小克银汉霉属 两性霉素两性霉素B B敏感敏感The lancet,2003,3:230-240真菌直接涂片的诊断价值诊断阳性率高The lancet,22323真菌直接涂片的真菌直接涂片的诊诊断价断价值值肺毛霉菌病肺毛霉菌病真菌培养的阳性率不高真菌培养的阳性率不高怕怕“冷冷”组织匀浆可能会破坏毛霉菌，组织匀浆可能会破坏毛霉菌，“假阴性假阴性”有时，直接涂片是唯一诊断手段有时，直接涂片是唯一诊断手段诊断肺毛霉菌病的治疗价值诊断肺毛霉菌病的治疗价值首选肺叶切除首选肺叶切除次选两性霉素次选两性霉素B B（唑类抗真菌药无效）（唑类抗真菌药无效）卡氏肺孢子菌无法体外培养卡氏肺孢子菌无法体外培养The lancet,2003,3:230-240真菌直接涂片的诊断价值肺毛霉菌病The lancet,202424用于对系统性真菌病的诊断筛查；用于侵袭性真菌感染的早期诊断84%(78-88%)烟曲霉、构巢曲霉等数种曲霉卡氏肺孢子菌无法体外培养110例ICU患者纳入分析，其中中性粒细胞减少患者仅占22%1,3D葡聚糖检测诊断侵袭性真菌感染(G试验)最简单也是最有用的实验室诊断方法可疑感染10 20 pg/ml微生物培养技术 人类口腔正常定植菌，正常人2055痰中可分离出假丝酵母菌属真菌直接涂片的诊断价值 最简单也是最有用的实验室诊断方法MB80 微生物快速动态测定系统主机反应器，数据处理分析软件，计算机，打印机，电子恒温加热仪等4th Trends in Medical Mycology.O Marchetti.白念珠菌仍然是最常见的致病菌 10例（40）假丝酵母菌培养阳性The lancet,2003,3:230-240Ostrosky-Zeichner et al.美国PATH网络：侵袭性真菌病数据库 微生物培养技术有意义的真菌培养标本有意义的真菌培养标本非经口痰标本非经口痰标本非插管尿标本非插管尿标本血液或其他无菌体液、血液或其他无菌体液、(胆汁、胸腹水、脑脊液）胆汁、胸腹水、脑脊液）用于对系统性真菌病的诊断筛查；微生物培养技术有意义2525 微生物培养技术无菌部位采集的标本无菌部位采集的标本(如血如血,CSF,CSF、胸腹水、关节液等、胸腹水、关节液等)中中分离的任何酵母都必须鉴定到种，均有诊断意义。分离的任何酵母都必须鉴定到种，均有诊断意义。同一部位反复分离出同一菌种也具重要意义。同一部位反复分离出同一菌种也具重要意义。从非无菌部位从非无菌部位(粪、痰、咽拭等粪、痰、咽拭等)分离到的条件致病菌分离到的条件致病菌(如如白念珠菌白念珠菌)，如直接镜检大量菌丝，如直接镜检大量菌丝(+)(+)，须结合临床认定，须结合临床认定具致病性。具致病性。微生物培养技术无菌部位采集的标本(如血,CSF、胸2626培养阳性率最高的培养阳性率最高的丝丝状真菌状真菌曲霉菌属曲霉菌属185185种，约种，约2020种被种被报道过，其中烟曲霉、黄曲报道过，其中烟曲霉、黄曲霉是常见的致病菌霉是常见的致病菌可从痰、支气管灌洗液、血、可从痰、支气管灌洗液、血、脑脊液、角膜刮出物、外耳脑脊液、角膜刮出物、外耳道、鼻窦、腹膜液、玻璃体道、鼻窦、腹膜液、玻璃体中分离到中分离到烟曲霉烟曲霉黄曲霉黄曲霉培养阳性率最高的丝状真菌曲霉菌属185种，约20种被报道过，2727重要的真菌感染的表现表现表现念珠菌念珠菌曲霉菌曲霉菌发热发热多发性关节炎多发性关节炎血脲素氮血脲素氮皮肤损害皮肤损害肝损害肝损害罕见罕见窦道窦道呼吸系统呼吸系统中枢系统中枢系统 稀少稀少John R.Wingard，IDSA，2005重要的真菌感染的表现表现念珠菌曲霉菌发热多发2828合理判断实验室的结果在无菌条件下获取的体液，如检测出真菌，应考虑到在无菌条件下获取的体液，如检测出真菌，应考虑到有侵入性真菌感染，可作为临床开始治疗真菌的充分有侵入性真菌感染，可作为临床开始治疗真菌的充分依据。依据。在腹腔中分离到既有细菌又有念珠菌时，只有当抗细在腹腔中分离到既有细菌又有念珠菌时，只有当抗细菌治疗无效时才考虑抗真菌治疗。（高危患者则需要菌治疗无效时才考虑抗真菌治疗。（高危患者则需要给予抗真菌治疗）。给予抗真菌治疗）。合理判断实验室的结果在无菌条件下获取的体液，如检测出真菌，2929合理判断实验室的结果 尿液未进行过泌尿系统操作，没有留置过尿管的病人，出现尿液未进行过泌尿系统操作，没有留置过尿管的病人，出现明显念珠菌尿，提示有血源性的肾感染。明显念珠菌尿，提示有血源性的肾感染。注意无糖尿病、泌尿生殖系统异常或没有肾移植的病人，注意无糖尿病、泌尿生殖系统异常或没有肾移植的病人，如导尿管中出现念珠菌尿，但无临床症状，不治疗，应尽如导尿管中出现念珠菌尿，但无临床症状，不治疗，应尽量除去假体材料或导管。量除去假体材料或导管。合理判断实验室的结果 尿液未进行过泌尿系统操作，没有留置过3030合理判断实验室的结果白色念珠菌是正常寄植菌，其临床意义与监测部位及白色念珠菌是正常寄植菌，其临床意义与监测部位及集落形成的数量有关。粪白色念珠菌计数集落形成的数量有关。粪白色念珠菌计数10105 5cfu/gcfu/g或或尿尿10105 5cfu/mlcfu/ml为致病性。为致病性。其他念珠菌、隐球菌、曲霉菌等不属于其他念珠菌、隐球菌、曲霉菌等不属于正常菌群，一正常菌群，一旦阳性并排除污染后即有意义。旦阳性并排除污染后即有意义。两个或两个以上非相邻解剖部位的播散性念珠菌感染两个或两个以上非相邻解剖部位的播散性念珠菌感染较菌血症的危险性和死亡率均高。较菌血症的危险性和死亡率均高。合理判断实验室的结果白色念珠菌是正常寄植菌，其临床意义与监3131呼吸道标本分离到真菌有意义吗?这是困扰临床医生的一个难题。这是困扰临床医生的一个难题。分析该真菌的临床价值应该由临床医生和微生物专家共同分析该真菌的临床价值应该由临床医生和微生物专家共同完成，应结合病人基础病进行分析。完成，应结合病人基础病进行分析。呼吸道标本分离到真菌有意义吗?3232气道分泌物中分离出假丝酵母菌意义 人类口腔正常定植菌，正常人人类口腔正常定植菌，正常人人类口腔正常定植菌，正常人人类口腔正常定植菌，正常人20205555痰中可分离出假丝酵母痰中可分离出假丝酵母痰中可分离出假丝酵母痰中可分离出假丝酵母菌属菌属菌属菌属 假丝酵母菌肺炎少见假丝酵母菌肺炎少见假丝酵母菌肺炎少见假丝酵母菌肺炎少见 发病率大约发病率大约发病率大约发病率大约0.230.234.54.5 25 25例例例例ICUICU患者的尸体解剖研究患者的尸体解剖研究患者的尸体解剖研究患者的尸体解剖研究 10 10例（例（例（例（4040）假丝酵母菌培养阳性）假丝酵母菌培养阳性）假丝酵母菌培养阳性）假丝酵母菌培养阳性 只有只有只有只有2 2例（例（例（例（8 8）是真正的假丝酵母菌肺炎）是真正的假丝酵母菌肺炎）是真正的假丝酵母菌肺炎）是真正的假丝酵母菌肺炎 用肺泡灌洗液或毛刷作真菌计数用肺泡灌洗液或毛刷作真菌计数用肺泡灌洗液或毛刷作真菌计数用肺泡灌洗液或毛刷作真菌计数,在在在在2424例例例例103cfu/ml103cfu/ml无一例是念无一例是念无一例是念无一例是念珠菌感染珠菌感染珠菌感染珠菌感染 实验室报告会增加唑类药物的应用和耐药性。实验室报告会增加唑类药物的应用和耐药性。实验室报告会增加唑类药物的应用和耐药性。实验室报告会增加唑类药物的应用和耐药性。气道分泌物中分离出假丝酵母菌意义 人类口腔正常定植菌，正3333痰和痰和BAL检查检查的的诊诊断意断意义义 上气道念珠菌定植常见，气道分泌物（痰和上气道念珠菌定植常见，气道分泌物（痰和BALFBALF）培养阳性不能作为侵袭性感染的证据。培养阳性不能作为侵袭性感染的证据。EORTC/MSGEORTC/MSG定义：定义：痰和痰和BALFBALF中丝状真菌和隐球菌镜检和培养阳性作中丝状真菌和隐球菌镜检和培养阳性作为感染的微生物学证据，而念珠菌培养阳性（无论为感染的微生物学证据，而念珠菌培养阳性（无论3 3次次还是更多）只是定植。还是更多）只是定植。痰和BAL检查的诊断意义 上气道念珠菌定植常见，气道分泌3434镜检和培养方法敏感性低敏感性低敏感性低敏感性低 血培养在肿瘤和血液病病人中，血培养在肿瘤和血液病病人中，血培养在肿瘤和血液病病人中，血培养在肿瘤和血液病病人中，50%50%尸检证实深部尸检证实深部尸检证实深部尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。念珠菌感染的病例血培养阴性。念珠菌感染的病例血培养阴性。念珠菌感染的病例血培养阴性。培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难 培养时间长培养时间长培养时间长培养时间长 有些标本采集困难有些标本采集困难有些标本采集困难有些标本采集困难镜检和培养方法敏感性低 血培养在肿瘤和血液病病人中，503535近年来诊断的进展？胸部CT扫描 Pulmonary CT scan非培养微生物检查技术 Nonculture based近年来诊断的进展？胸部CT扫描 Pulmonary C3636非培养诊断的方法简介真菌细胞壁成分真菌细胞壁成分真菌细胞壁成分真菌细胞壁成分 （1313）D D葡聚糖检测（葡聚糖检测（葡聚糖检测（葡聚糖检测（G G试验）试验）试验）试验）真菌抗原检查真菌抗原检查真菌抗原检查真菌抗原检查 半乳甘露聚糖（半乳甘露聚糖（半乳甘露聚糖（半乳甘露聚糖（galactomannan)galactomannan)抗原（抗原（抗原（抗原（GM)GM)甘露聚糖甘露聚糖甘露聚糖甘露聚糖(mannan)(mannan)抗原抗原抗原抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）真菌特异的代谢产物（真菌特异的代谢产物（真菌特异的代谢产物（真菌特异的代谢产物（D D阿拉伯糖醇）阿拉伯糖醇）阿拉伯糖醇）阿拉伯糖醇）真菌真菌真菌真菌DNADNA的检测的检测的检测的检测非培养诊断的方法简介真菌细胞壁成分3737（13）D葡聚糖检测葡聚糖检测（13）D葡聚糖检测3838（13）D葡聚糖葡聚糖检测检测 1,6glucans 1,3PPL bilayerchitinergosterol 1,3 glucansynthasemannoproteins真菌细胞壁成份，占真菌细胞壁成份，占50%50%以上以上其他微生物、动物及人的细胞不含该成份其他微生物、动物及人的细胞不含该成份用于侵袭性真菌感染的早期诊断用于侵袭性真菌感染的早期诊断（13）D葡聚糖检测b1,3PPL bilayerc3939BG检测检测的特点的特点 可检测多种致病真菌感染可检测多种致病真菌感染念珠菌念珠菌,曲霉曲霉,肺孢子菌肺孢子菌,镰刀菌镰刀菌,地霉地霉,组织胞浆菌组织胞浆菌,毛孢子菌等毛孢子菌等 阳性结果代表存在侵袭性真菌感染阳性结果代表存在侵袭性真菌感染 真菌对数生长期释放量最大真菌对数生长期释放量最大,可被体内葡聚糖可被体内葡聚糖 酶降酶降解。解。每周检测每周检测2 2次次BG检测的特点 可检测多种致病真菌感染4040定量测定13D葡聚糖的设备MB80微生物快速动态测定系统主机反应器，数据处理分析软件，计算机，打印机，电子恒温加热仪等定量测定13D葡聚糖的设备 MB80 微生物快速动态测定4141MB80 微生物快速动态测定系统 快速定量检测深部真菌和内毒素，帮助临床早期快速定量检测深部真菌和内毒素，帮助临床早期诊断目前常规方法难以确诊的侵袭性真菌感染、革诊断目前常规方法难以确诊的侵袭性真菌感染、革兰氏阴性菌感染兰氏阴性菌感染 。可检测标本可检测标本 血液、尿液、脑脊液、胸腔积液、腹水等血液、尿液、脑脊液、胸腔积液、腹水等MB80 微生物快速动态测定系统4242定量测定13D葡聚糖的原理凝固蛋白原凝固蛋白动态浊度法动态浊度法凝固酶凝固酶原活化因子G因子G1-3-D-葡聚糖全过程全过程2小时内完成，可及时小时内完成，可及时提供结果，指导临床提供结果，指导临床定量测定13D葡聚糖的原理凝固蛋白原凝固蛋白动态浊度法凝固4343BG检测检测用于念珠菌血症用于念珠菌血症 BGBG检测敏感度明显高于检测敏感度明显高于MannanMannan检测检测79.6%vs 42%79.6%vs 42%阳性早于血培养阳性和临床症状出现阳性早于血培养阳性和临床症状出现对于念珠菌血症对于念珠菌血症,BG,BG检测是首选检查检测是首选检查Clin.Infect.Dis.2005.41:654659.J.Clin.Microbiol.2005.43:59575962J.Clin.Microbiol.2008.46:10091013BG检测用于念珠菌血症 BG检测敏感度明显高于Mannan检4444酵母菌、丝状真菌细胞壁成分；美国大多数研究限于念珠菌菌血症Andriole VT.美国FDA已批准，欧洲部分国家已注册假丝酵母菌肺炎少见早于临床症状2天，早于确诊9天；敏感度为55%100%Clin Infect Dis 2001;32:358-366;Paterson DL,Singh N.Microbiol.Epidemiology and Outcomes of Candidemia in 2019 Patients82%(70-90%)肺活检标本真菌培养阳性和/或组织病理学检查病变组织中发现真菌；混合型真菌感染的发病率也逐年上升1,3D葡聚糖检测诊断侵袭性真菌感染(G试验)The lancet,2003,3:230-240G试验检测不同念珠菌属的敏感度（60pg/ml）阳性结果代表存在侵袭性真菌感染组织匀浆可能会破坏毛霉菌，“假阴性”可疑感染10 20 pg/ml其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少（13）D葡聚糖(BG)检测用于侵袭性曲霉感染（IPA)敏感度为敏感度为55%100%55%100%特异度为特异度为52%100%52%100%对于确诊对于确诊IPAIPA，阳性率为，阳性率为85.7100%85.7100%高度可疑高度可疑IPAIPA，阳性率为，阳性率为52.466%52.466%Med.Mycol.2006.44:51635172J.Clin.Microbiol.2008.46:10091013J.Clin.Microbiol.2005.43:299305酵母菌、丝状真菌细胞壁成分；（13）D葡聚糖(BG)检测4545D葡聚糖（G试验）的价值 酵母菌、丝状真菌细胞壁成分；用于对系统性真菌病的诊断筛查；不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属等；不能检测隐球菌和接合菌；D葡聚糖（G试验）的价值 酵母菌、丝状真菌细胞壁成分；4646D葡聚糖（G试验）的价值 敏感性敏感性63100%63100%；特异性；特异性74100%74100%美国大多数研究限于念珠菌菌血症美国大多数研究限于念珠菌菌血症 其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少 缺点易引起假阳性（血液透析；接受血制品治疗等），而且无法区分真菌种类。缺点易引起假阳性（血液透析；接受血制品治疗等），而且无法区分真菌种类。动态监测可避免假阳性动态监测可避免假阳性 D葡聚糖（G试验）的价值 敏感性63100%；特异4747 D D葡聚糖（葡聚糖（G G试验）的缺陷试验）的缺陷标本采集标本采集不能鉴定何种真菌感染不能鉴定何种真菌感染真菌感染与实验室诊断进展科室讲培训课程课件4848 D D葡聚糖参考葡聚糖参考值值健康人健康人 10 pg/ml 20 pg/ml 20 pg/mlD葡聚糖参考值健康人 60ug/ml)60ug/ml)SennSenn等等1 1,单中心单中心WAKOWAKO试剂盒试剂盒(两次连续两次连续7pg/ml)7pg/ml)真菌病类型真菌病类型主要为念珠菌病主要为念珠菌病(确诊确诊+临床诊断临床诊断)非粒缺患者非粒缺患者n=107n=107念珠菌病念珠菌病+曲霉病曲霉病(确诊确诊+临床临床)粒缺患者粒缺患者 n=30 n=30敏感度敏感度89%89%63%63%特异度特异度80%80%96%96%阳性预测值阳性预测值 87%87%79%79%阴性预测值阴性预测值81%81%91%91%1,3D葡聚糖检测诊断侵袭性真菌感染(G试验)1.Senn et al.1,3-Beta-D-gluc5151Ostrosky-Zeichner et al.Multicenter clinical evaluation of the(1-3)beta-D-glucan assay as an aid to diagnosis of IFIs.Clinical Infectious Diseases 2005;41:65491,3D葡聚糖检测诊断侵袭性真菌感染(G试验)全部念珠全部念珠菌菌n=92n=92白念白念n=36n=36近平滑近平滑n=18n=18热带热带n=11n=11光滑光滑n=26n=26克柔克柔n=3n=3敏感度敏感度%82.682.683.383.372.272.290.990.980.880.8100.0100.0G试验检测不同念珠菌属的敏感度近似（试验检测不同念珠菌属的敏感度近似（60pg/ml,近平滑念珠菌稍低）近平滑念珠菌稍低）G试验检测不同念珠菌属的敏感度（试验检测不同念珠菌属的敏感度（60pg/ml）念珠菌念珠菌n=92n=92曲霉菌曲霉菌n=10n=10隐球菌隐球菌n=12n=12镰刀菌镰刀菌n=3n=3接合菌接合菌n=3n=3敏感度敏感度%82.682.680.080.025.025.0100.0100.00 0Ostrosky-Zeichner et al.Multi5252曲霉菌半乳甘露聚（曲霉菌半乳甘露聚（GM）曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原可以从血清、脑脊液、胸水、BALF检测到方法ELISA（BioRad）敏感性高1ng/mlLatexagglutination15ng/ml曲霉菌半乳甘露聚（GM）曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原5353半乳甘露聚糖检测诊断侵袭性曲霉病(GM试验)Diagnosis of invasive aspergillosis using a galactomannan assay-a meta-analysis.Clin Infect Dis,2006;42:141727O Marchetti.New Developments and Challenges in Diagnostics of Invasive Fungal Infections.4th Trends in Medical Mycology.1996-20051996-2005年年2727项研究的项研究的MetaMeta分析分析患者类型患者类型样本量样本量敏感度敏感度(95%CI)(95%CI)特异度特异度(95%CI)(95%CI)恶性血液病恶性血液病2960296070%(62-77%)70%(62-77%)92%(90-93%)92%(90-93%)异基因异基因HSCTHSCT90390382%(70-90%)82%(70-90%)86%(83-88%)86%(83-88%)实体器官移实体器官移植植22422422%-40%(3-60%)22%-40%(3-60%)84%(78-88%)84%(78-88%)半乳甘露聚糖检测诊断侵袭性曲霉病(GM试验)Diagnos5454支气管肺泡灌洗液半乳甘露聚糖检测O Marchetti.New Developments and Challenges in Diagnostics of Invasive Fungal Infections.4th Trends in Medical Mycology.Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid-a tool for diagnosing aspergillosis in ICU patients.Am J Resp Crit Care Med,2008;177:27-34ICUICU曲霉病患者诊断的有效工具曲霉病患者诊断的有效工具曲霉病患者诊断的有效工具曲霉病患者诊断的有效工具BAL GM阈值阈值0.5敏感度敏感度 88%特异度特异度 87%血血GM阈值阈值0.5敏感度敏感度 42%特异度特异度 78%110例例ICU患者纳入分析，其中中性粒细胞减少患者仅占患者纳入分析，其中中性粒细胞减少患者仅占22%支气管肺泡灌洗液半乳甘露聚糖检测O Marchetti.N5555合适的判定折点1.0,0.8,0.5?在儿童的应用价值？食物中的GM可以被吸收，假阳性？哌拉西林/他唑巴坦治疗，假阳性？非血液病患者应用不多抗真菌治疗对结果的影响？半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖(GM)(GM)检测检测存在的存在的问题问题合适的判定折点1.0,0.8,0.5?半乳甘露聚糖(GM)5656酵母菌、丝状真菌细胞壁成分酵母菌、丝状真菌细胞壁成分不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属毛孢子菌、支顶孢属不能检测隐球菌和接合菌不能检测隐球菌和接合菌美国美国FDAFDA已批准，欧洲部分国家已注册已批准，欧洲部分国家已注册敏感性、特异性敏感性、特异性9090左右左右 D葡聚糖（葡聚糖（G试验试验）的价）的价值值酵母菌、丝状真菌细胞壁成分D葡聚糖（G试验）的价值5757 上气道念珠菌定植常见，气道分泌物（痰和BALF）培养阳性不能作为侵袭性感染的证据。不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属等；假丝酵母菌肺炎少见 EORTC/MSG定义：对于确诊IPA，阳性率为85.1,3-Beta-D-glucan antigenemia for early diagnosis of IFIs in neutropenic patients with acute leukemia.阳性结果代表存在侵袭性真菌感染国内侵袭性真菌感染的发病情况Microbiol.（高危患者则需要给予抗真菌治疗）。真菌直接涂片的诊断价值46:10091013支气管肺泡灌洗液半乳甘露聚糖检测快速:24hr可以报告结果（高危患者则需要给予抗真菌治疗）。mannoproteinsSenn et al.其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少国内侵袭性真菌感染的发病情况可疑感染10 20 pg/ml用于侵袭性真菌感染的早期诊断两种试验敏感性、特异性相当都可以在早期诊断侵袭性曲霉病，但是都可以在早期诊断侵袭性曲霉病，但是 D D葡聚葡聚糖可能出现更早糖可能出现更早两者结合，可以互补两者结合，可以互补 弥补弥补GMGM假阴性可能假阴性可能同样在粒细胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖(GM)与与 D葡聚糖（葡聚糖（G试验试验）比）比较较 上气道念珠菌定植常见，气道分泌物（痰和BALF）培养阳性5858PCRPCR技术用于诊断种特异种特异-PCR非特异非特异 PCR杂交杂交Standart singlenestedPCR-EIAReal-time标本标本全血全血血浆血浆血清血清BAL最低检测范围最低检测范围4-10 cfu/ml25-100 fg DNA原位杂交原位杂交目的基因目的基因多拷贝基因多拷贝基因PCRPCR技术用于诊断种特异-PCRStandart s5959PCR过筛试验诊过筛试验诊断断IA每周监测每周监测2 2次次通用引物通用引物;确定采用巢式和实时定量确定采用巢式和实时定量;敏感性敏感性100%100%，特异性，特异性65%;65%;早于临床症状早于临床症状2 2天，早于确诊天，早于确诊9 9天；天；动态观察持续阴性可排除。动态观察持续阴性可排除。Dr.Maschmeyer G.in 2nd Trends in Medical Mycology,23-26 October 2005,Berlin,Germany.PCR过筛试验诊断IA每周监测2次通用引物;Dr.Masc6060气道分泌物中分离出假丝酵母菌意义如在无菌体液的直接镜检中发现真菌，常可确立深部真菌病的诊断。新鲜尿液见到大量菌丝及孢子 25例ICU患者的尸体解剖研究敏感性100%，特异性65%;in 2nd Trends in Medical Mycology,23-26 October 2005,Berlin,Germany.4-10 cfu/mlLatex agglutination 15ng/ml（13）D葡聚糖检测（G试验）3连续2次采血进行G试验真菌直接涂片的诊断价值 10例（40）假丝酵母菌培养阳性GMtest,Gtest临床诊断46:10091013有意义的真菌培养标本GMtest,Gtest临床诊断Aspergillus其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少用于侵袭性真菌感染的早期诊断突破方向对基因组序列和功能的了解，找出特异处对基因组序列和功能的了解，找出特异处改进目前方法，提高敏感性改进目前方法，提高敏感性Realtime PCRRealtime PCR多重多重PCRPCR芯片技术芯片技术其它特异抗原其它特异抗原气道分泌物中分离出假丝酵母菌意义突破方向对基因组序列和功能的6262