核酸的生物合成课件

第十章第十章 核酸的生物合成核酸的生物合成S DNADNA的生物合成的生物合成S RNARNA的生物合成的生物合成 基因工程及分子 生物学技术简介（自学）6/30/20241 DNADNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在息以密码的形式编码在DNADNA分子上，表现为特定的核苷酸分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过排列顺序，并通过DNADNA的复制由亲代传递给子代。在后代的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自的生长发育过程中，遗传信息自DNADNA转录给转录给RNA,RNA,然后翻译然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。亲代相似的遗传性状。中中 心心 法法 则则1964-1970 劳氏肉瘤病毒的遗传方式致癌RNA病毒、植物RNA病毒病毒（复制）病毒（复制）复制复制转录DNA RNA 蛋白质翻译逆转录逆转录1958年，遗传信息的单向自我复制自我复制转录转录反转录反转录自我复制自我复制翻译翻译蛋白质蛋白质遗传信息的传递遗传信息的传递6/30/20242 复制：复制：亲代亲代DNADNA或或RNARNA在一系列酶的作用下，生成在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代与亲代相同的子代DNADNA或或RNARNA的过程。的过程。转录：转录：以以DNADNA为模板，按照碱基配对原则将其所为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给含的遗传信息传给RNARNA，形成一条与形成一条与DNADNA链链互补的互补的RNARNA的过程。的过程。翻译：翻译：亦叫转译，以亦叫转译，以mRNAmRNA为模板，将为模板，将mRNAmRNA的的密码密码解读成蛋白质的解读成蛋白质的AAAA顺序的过程。顺序的过程。逆转录：逆转录：以以RNARNA为模板，在逆转录酶的作用下，为模板，在逆转录酶的作用下，生成生成DNADNA的过程。的过程。Reverse transcription6/30/20243第一节 DNA的生物合成 DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）逆转录（RNA指导下的DNA的合成）DNA 突变 DNA的损伤与修复6/30/20244一、DNA的半保留复制（Semi-Conservation ReplicationSemi-Conservation Replication）u概念和实验证据uDNA的复制的起点和方向u与DNA复制有关的酶及蛋白质因子u DNA的半不连续复制u E.coli.DNA复制过程u 真核生物DNA的复制6/30/20245n(一一)定义和实验证据定义和实验证据：由亲代由亲代DNADNA生成子代生成子代DNADNA时，每时，每个新形成的子代个新形成的子代DNADNA中，一条链来自亲代中，一条链来自亲代DNADNA，而另一而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。半保留复制。半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据:19581958年年MeselsonMeselson和和StahlStahl用同位素用同位素1515N N标记大肠杆菌标记大肠杆菌DNA,DNA,首先证明了首先证明了DNADNA的半的半保留复制。保留复制。子代子代DNADNA双螺旋与亲代双螺旋与亲代DNADNA的碱基顺序完全一样的碱基顺序完全一样6/30/20246细胞在细胞在1515N N标记培养基标记培养基中（中（NHNH4 4ClCl）连续培养）连续培养1515代，使所有代，使所有DNADNA分子分子均标记上均标记上1515N N，转入，转入1414N N标记的培养基标记的培养基CsClCsCl密度梯度离心密度梯度离心 浮力密度浮力密度 1515N NDNA 1.742g/mlDNA 1.742g/ml 14 14N NDNA DNA 1.710g/ml1.710g/ml1515N/N/1414NDNA 1.717g/mlNDNA 1.717g/ml6/30/20247DNADNA的半保留复制的生物学意义：的半保留复制的生物学意义：nDNADNA的半保留复制表明的半保留复制表明DNADNA在代谢上的稳定性，在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。DNADNA在代谢上的稳定性并非指在代谢上的稳定性并非指DNADNA是一种惰性物质是一种惰性物质:在细在细胞内外各种物化因子均可导致胞内外各种物化因子均可导致DNADNA损伤，需要修复；在损伤，需要修复；在复制和转录过程中复制和转录过程中DNADNA会会发生损耗，必须进行更新；在发生损耗，必须进行更新；在发育和进化过程中发育和进化过程中DNADNA可能进行修饰、删除、扩增和重可能进行修饰、删除、扩增和重排；在进化的角度上，排；在进化的角度上，DNADNA更是处在不断的变异和发展更是处在不断的变异和发展中。中。6/30/20248（二）复制起点、方向和方式1、复制起点（origin，ori或或 o，复制原点）复制原点）原核生物染色体DNA（或真核生物的细胞器DNA）单复制起点，即整个染色体只有一个复制单位。真核生物染色体DNA:多复制起点 一个genome中有多个复制单位复制起点：复制起点：复制开始处复制开始处DNADNA分子的特定位置分子的特定位置复制子复制子(RepliconReplicon)（复制单位（复制单位 ）：从一个起点到一个：从一个起点到一个终点所包含的终点所包含的DNADNA区域，是区域，是基因组基因组独立进行复制的单位。独立进行复制的单位。许多生物的复制起点都是富含A、T的区段6/30/202492 2、复制方向及方式复制方向及方式复制叉（Replication fork）：DNA复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点(growth point)，叫复制叉。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制体（replisome）大大多多数数复复制制是是双双向向的的，形形成成两个复制叉；两个复制叉；真核染色体DNA 线环状双链E.coli染色体DNA 环状双链 复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛6/30/202410（三）与（三）与DNADNA复制有关的酶和蛋白质复制有关的酶和蛋白质1 1、DNADNA聚合酶聚合酶2 2、拓扑异构酶、拓扑异构酶3 3、DNADNA解旋酶解旋酶4 4、单链结合蛋白、单链结合蛋白5 5、引发酶及引发体、引发酶及引发体6 6、DNADNA连接酶连接酶目前已发现目前已发现3030多种酶及蛋白质因子参与多种酶及蛋白质因子参与DNADNA复制复制6/30/202411n复制体复制体：在：在DNADNA合成的生长点（既复合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在酶和辅助因子，它们在DNADNA的模板链的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制。高度精确的复制。6/30/2024121 1、DNADNA聚合酶聚合酶（1 1）反应需要有）反应需要有模板模板的指导；的指导；（2 2）4 4种种dNTPdNTP为底物，需要引物，为底物，需要引物，需要有需要有3 3-OH-OH存在存在；（3 3）合成方向为）合成方向为5 5 3 3 （4 4）需要）需要MgMg2+2+催化反应的特点：催化反应的特点：在大肠杆菌中发现有在大肠杆菌中发现有五五种种DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶 、6/30/2024136/30/202414在大肠杆菌中发现主要有三种在大肠杆菌中发现主要有三种DNADNA聚聚合酶，分别为：合酶，分别为：DNADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 E.coliE.coli DNA DNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶IVIV和和V V：19991999年发现，当年发现，当DNADNA严重损伤严重损伤 时，诱导产生。时，诱导产生。6/30/202415 DNADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 亚基数目 1（单体酶）1（单体酶）多亚基酶53聚合活性 +中 +很低 +很高35外切活性 +53外切活性 +_ _6/30/202416DNADNA聚合酶聚合酶n是原核生物是原核生物DNADNA复制的主要聚合酶，复制的主要聚合酶，该酶由该酶由1010种种亚基组成，其中亚基组成，其中、形成全酶的核心酶形成全酶的核心酶。具。具有有5 5 3 3 DNA DNA聚合酶活性（聚合酶活性（亚基，亚基，速率高）；速率高）；具有具有3 3 5 5 外切酶（外切酶（亚基）亚基）的校对功能，的校对功能，提高提高DNADNA复制的保真性复制的保真性（聚合酶对底物的专一性、（聚合酶对底物的专一性、3 3 5 5 外切酶的校对功能）外切酶的校对功能）。6/30/20241753聚合酶活性DNApolDNApol 复制中新链的延长子链子链DNA延伸方向只能是延伸方向只能是5 36/30/2024183355错配碱基错配碱基3-5核酸外切核酸外切酶水解位点酶水解位点3 5外切酶活性切除单链切除单链DNA3-DNA3-末端核苷酸，而对双链末端核苷酸，而对双链DNADNA不起作用不起作用聚合过程中，若新加入的核苷酸不对，聚合过程中，若新加入的核苷酸不对，DNApolDNApol 3535外切酶的活性可将其除去（校对功能，提高外切酶的活性可将其除去（校对功能，提高DNADNA复制保复制保真性）真性）。6/30/2024195 3外切酶活性 从双链DNA一条链的5末端开始水解下单核苷酸或寡核苷酸。DNApolDNApol切除切除RNARNA引物（引物（53 53 外切酶活性）外切酶活性）填补其留下的空填补其留下的空隙隙（53 53 聚合酶活性）聚合酶活性）6/30/202420 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNADNA复制时复制时53 53 外切酶活性外切酶活性切除切除RNARNA引引物，物，53 53 聚合酶活性聚合酶活性填补其留下的空填补其留下的空隙隙;DNADNA损伤修复；损伤修复；DNADNA损伤损伤修复修复(紫外光引起紫外光引起)DNA DNA 复制的主要酶复制的主要酶53 53 聚合活性催化链的延长聚合活性催化链的延长3 35 5 外切酶活性的校对功能外切酶活性的校对功能，6/30/202421拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNADNA一条链发生断裂和再连接一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超作用是松解负超螺旋螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录转录有关。有关。拓扑异构酶拓扑异构酶：使使DNADNA两条链发生断裂和再连接。两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋当引入负超螺旋时需要由时需要由ATPATP提供能量，同提供能量，同复制复制有关。有关。二者共同控制二者共同控制DNADNA的的拓扑拓扑结构。结构。2.2.拓扑异构酶：拓扑异构酶：催化催化DNADNA的拓扑的拓扑链环数链环数发生变化的酶，在发生变化的酶，在DNADNA重组修复和其他转变重组修复和其他转变方面起重要作用。方面起重要作用。除链环数不同外其它性质均相同的除链环数不同外其它性质均相同的DNADNA分子称为拓扑异构体，引起分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶拓扑异构酶6/30/2024223 3、解螺旋酶、解螺旋酶 （解链酶）（解链酶）：通过水解：通过水解ATPATP将将DNADNA两条链打开。两条链打开。E.coliE.coli中的中的reprep蛋白就是解螺蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶旋酶，还有解螺旋酶I I、IIII、IIIIII。每解开一每解开一对碱基需要水解对碱基需要水解2 2个个ATPATP分子。分子。4 4、单链结合蛋白、单链结合蛋白(SSB-single-strand binding(SSB-single-strand binding protein)protein)：稳定已被解开的稳定已被解开的DNADNA单链，阻止复性单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。和保护单链不被核酸酶降解。6/30/2024235 5、引发酶及引发体、引发酶及引发体引发前体引发前体:它由多种蛋白质它由多种蛋白质dnaAdnaA、dnaBdnaB、dnaCdnaC、n n、n n、n n 和和i i组成。组成。引发酶：引发酶：此酶以此酶以DNADNA为模板合成一段为模板合成一段RNA,RNA,这段这段RNARNA作为合作为合成成DNADNA的引物（的引物（Primer)Primer)。实质是以。实质是以DNADNA为模板的为模板的RNARNA聚合聚合酶酶。引发酶与引发前体结合才有活性引发酶与引发前体结合才有活性。引发前体再与引发酶引发前体再与引发酶结合组装成引发体。结合组装成引发体。引发体可以沿模板链引发体可以沿模板链5533方向移动方向移动,具有识别具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发发RNARNA引物的合成。引物的合成。移动和引发均需要移动和引发均需要ATPATP提供能量，引发体的移动与提供能量，引发体的移动与复制叉复制叉移动的方向相同，与移动的方向相同，与冈崎片段冈崎片段的合成方向的合成方向相反。相反。6/30/202424 DNADNA中一条链有切口，切口一端是中一条链有切口，切口一端是3 3-OH-OH，另一，另一端是端是5 5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，使二酯键，使切口切口连接。连接。不能将两条游离的不能将两条游离的DNADNA单单链连接起来。链连接起来。3535OHOH P P6 6、DNADNA连接酶连接酶大肠杆菌和其它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNADNA连接酶要求连接酶要求NAD+NAD+提供能量，在高提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求等生物和噬菌体中，则要求ATPATP提供能量。提供能量。T4T4噬菌体的噬菌体的DNADNA连连接酶接酶不仅能在模板链上连接不仅能在模板链上连接DNADNA和和DNADNA链之间的切口，而且能链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链连接无单链粘性末端的平头双链DNADNA。6/30/202425v连接酶的反应机制连接酶的反应机制：酶酶 +NAD+NAD+(ATP)(ATP)酶酶-AMP+-AMP+烟酰胺单核苷酸烟酰胺单核苷酸（PPiPPi）酶酶-AMP+P-5-DNA -AMP+P-5-DNA 酶酶 +AMP+AMP-P-5-DNAP-5-DNADNA-3-OH+AMPDNA-3-OH+AMP-P-5-DNA DNA-3-O-P-5-DNA+AMPP-5-DNA DNA-3-O-P-5-DNA+AMPvDNADNA连接酶连接酶在在DNADNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用用6/30/202426拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物DNA双链双链 5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质6/30/202428拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物拓扑异构酶拓扑异构酶与与DNA双链双链结合，解开结合，解开超螺旋。超螺旋。5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质6/30/202429拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物解链酶解开解链酶解开DNA双螺旋双螺旋 5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质6/30/202430拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物单链结合蛋白单链结合蛋白防止复螺旋防止复螺旋 5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质6/30/202431拓扑异构酶拓扑异构酶解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白DNA聚合酶聚合酶引物酶及引发体引物酶及引发体DNA连接酶连接酶引物引物引物酶合成引物引物酶合成引物 5 3 5 3DNA复制有关的酶和蛋白质6/30/202432(四四)DNA DNA的半不连续复的半不连续复制制 19681968年由冈崎通过实验证明年由冈崎通过实验证明 DNADNA复制是半不连续的复制是半不连续的6/30/202433 1 1、冈崎片段的发现、冈崎片段的发现（19681968）：）：n 同位素实验，同位素实验，3 3HdTHdT 短时间内为短时间内为DNADNA小片段小片段一一段时间后段时间后检测到检测到 DNADNA大片段。当用大片段。当用DNADNA连接酶连接酶的变异株时，检测到大量的变异株时，检测到大量DNADNA片段的积累片段的积累 证明证明DNADNA复制中有小片段合成。复制中有小片段合成。n由于由于U U替代替代dTdT，被尿嘧啶，被尿嘧啶-DNA-DNA-糖苷酶切除。糖苷酶切除。测定测定DNADNA小片段，远远大于合成小片段，远远大于合成DNADNA的一半。的一半。n在缺少尿嘧啶在缺少尿嘧啶-N-N-糖基酶的突变植株中，糖基酶的突变植株中，检测到检测到一半一半3 3H H标记出现在小片段（冈崎片段）中。标记出现在小片段（冈崎片段）中。后两个实验表明：在后两个实验表明：在DNA复制时只有一条链是不连续的！复制时只有一条链是不连续的！6/30/202434领头链领头链在在DNADNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链（一致并连续合成的链（前导链前导链）。）。随后链随后链在在DNADNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNADNA链（链（滞后链滞后链）。这些）。这些不连续的片断，称为不连续的片断，称为冈崎片断冈崎片断。每个冈崎片段的合成也都需要引物。每个冈崎片段的合成也都需要引物。冈崎片段：冈崎片段：真核生物中真核生物中100-200100-200个核苷酸（核小体的个核苷酸（核小体的DNADNA单位）。单位）。原核生物中原核生物中1000-20001000-2000个核苷酸。个核苷酸。半不连续复制半不连续复制在在DNADNA复制时，领头链是连续合成的复制时，领头链是连续合成的,而而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。复制。6/30/202435335533552、半不连续复制、半不连续复制6/30/202436冈崎片段合成后由DNA聚合酶切除RNA引物并催化合成一段DNA填补留下的空隙。再由DNA连接酶把他们连成一条完整的子代链，称为滞后链。6/30/202437(五五)E.coli.E.coli.染色体染色体DNADNA复制过程复制过程 起 始 延 伸 终 止6/30/202438解链引发延长复制复制起点起点RNARNA前体前体1、复制的起始 6/30/202439n大肠杆菌复制的起点由245个bp构成，其序列 很保守，有两组短的重复：3个13 bp的序列和4个9 bp的序列6/30/202440u20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。u三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。uDnaB（解螺旋酶）在DnaC协助下与开放复合物结合，进一步解链。u解链时带来的扭曲张力还需DNA旋转酶（属DNA拓扑异构酶）引入负超螺旋消除。6/30/202441u单链结合蛋白(SSB）结合在单链区，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解u引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子构成的复合体（引发体），以DNA为模板合成RNA引物（6-10个碱基）引发6/30/202442复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引物引物在在DNADNA的复制原点，的复制原点，双股双股螺旋解开螺旋解开，成单链状态，成单链状态，分别作为模板，合成其互分别作为模板，合成其互补单链。补单链。解链6/30/202443 引发体在复制叉上引发体在复制叉上移动，识别合成的起始位点，移动，识别合成的起始位点，引发引发RNARNA引物的合成。引物的合成。领头链领头链先引发开始合成，以原来一先引发开始合成，以原来一条条DNADNA单链为模板（单链为模板（3 3 5),5),按按5 5 3 3的方向合的方向合成一段成一段RNARNA引物链。领头链开引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合始合成后，随后链也开始合成其引物。在引物的成其引物。在引物的33端为端为游离的羟基。游离的羟基。复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引物引物RNA引物合成引物合成6/30/202444大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质SSB解链酶解链酶引物引物引物酶引物酶拓扑异构酶拓扑异构酶打开打开DNA超螺链超螺链打开双螺旋打开双螺旋合成合成防止复螺旋防止复螺旋6/30/202445复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引引物物在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，的催化下，以脱氧核糖核苷酸为底物，以脱氧核糖核苷酸为底物，在在RNARNA引物的引物的3 3端端加上脱加上脱氧核糖核苷酸。氧核糖核苷酸。2 2、DNADNA链的延伸链的延伸6/30/202446DNADNA链的延伸链的延伸v以复制叉向前移动的方向为标准，以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是一条模板链是3 3 5 5 走向，与走向，与之互补的之互补的DNADNA能以能以5 3 5 3 的方向的方向连续合成，称为连续合成，称为前导链（领头链）前导链（领头链）。v另一条模板链是另一条模板链是5 3 5 3 走向，走向，与其互补的与其互补的DNADNA也是也是5 3 5 3 方向方向合成，与复制叉移动方向合成，与复制叉移动方向正好相反正好相反，随复制叉的移动，形成许多不连续随复制叉的移动，形成许多不连续的片断，称为的片断，称为冈崎片断冈崎片断。每个冈崎。每个冈崎片段的合成也都需要引物。片段的合成也都需要引物。6/30/202447延 伸前前导导链链只只需需要要一一个个RNARNA引引物物，随随后后链链的的每每一一个个冈冈崎崎片片段都需要一个段都需要一个RNARNA引物。引物。链的延长反应由链的延长反应由DNA DNA polpol.催化。催化。6/30/202448复制体沿着复制叉方向前进，同时进行前导链和滞后链的合成。一分子的 DNA pol III.协同合成前导链和滞后链，因此滞后链必须绕成一个突环。5 5333355、和和三种亚基组成核心酶三种亚基组成核心酶,核心酶形成二聚体核心酶形成二聚体-亚基犹如一个夹子夹住亚基犹如一个夹子夹住DNADNA分分子，并向前滑动，使子，并向前滑动，使DNADNA聚合酶在聚合酶在完成复制前不再脱离完成复制前不再脱离DNADNA6/30/2024493 3、DNADNA合成的终止合成的终止EnE.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终 止蛋白 tus 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC共6个终止位点。6/30/202450每个区域只对一个方向的复制叉起作用TusTus蛋白蛋白-terter复合物阻止一个方复合物阻止一个方向的复制叉前移向的复制叉前移(通过抑制DNA解旋酶而发挥终止作用)终 止两个复制叉向前移动，最后在终止区相遇并停止复制，由DNA聚合酶填补空隙，最后由连接酶封口。结果形成两个DNA双股螺旋分子。6/30/202452原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解解链酶链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB335前导链前导链随后链随后链35复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5RNA引物引物33DNA连连接酶接酶6/30/202453(六六)确保确保DNADNA复制忠实性的机制复制忠实性的机制1 1、采用、采用DNADNA聚合酶催化聚合反应聚合酶催化聚合反应2 2、依赖、依赖DNADNA聚合酶核酸外切酶活性聚合酶核酸外切酶活性3 3、使用、使用RNARNA引引物物4 4、依赖核苷酸代谢库调节系统、依赖核苷酸代谢库调节系统(保证保证dNTPdNTP的正常水平的正常水平)多种修复系统多种修复系统6/30/202454（七）真核生物染色体（七）真核生物染色体DNADNA的复制的复制 1 1、真核和原核、真核和原核DNADNA复制比较复制比较、负责核负责核DNADNA的复制的复制负责线粒体负责线粒体DNA的复制的复制较慢较慢较快较快6/30/202455 在真核细胞内有五种在真核细胞内有五种DNADNA聚合酶聚合酶 （与细菌（与细菌DNADNA聚合聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）定位定位 细胞核细胞核 细胞核细胞核 线粒体线粒体 细胞核细胞核 细胞核细胞核3 3-5-5 外切外切 -+-+酶活性酶活性功能功能引物引物 合成合成修复修复作用作用线粒体线粒体DNADNA的复制的复制核核DNADNA的复制的复制修复修复作用作用6/30/2024562 2、真核生物中、真核生物中DNADNA的复制特点的复制特点1 1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。多复制子。2 2、冈崎片段长约、冈崎片段长约200bp.200bp.3 3、真核生物真核生物DNADNA复制速度比原核慢。复制速度比原核慢。4 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。物快速生长时，往往采用更多的复制起点。5 5、真核生物有多种、真核生物有多种DNADNA聚合酶。聚合酶。6 6、真核生物线性染色体两端有、真核生物线性染色体两端有端粒端粒结构，防止染色体间的末端结构，防止染色体间的末端连接。由连接。由端粒酶端粒酶负责新合成链负责新合成链5 5 端端RNARNA引物切除后的填补，引物切除后的填补，以保持以保持端粒端粒的一定长度的一定长度。6/30/2024573 3、真核生物染色体、真核生物染色体DNADNA末端复制的问题末端复制的问题真真核核生生物物线线状状染染色色体体在在复复制制最最后后，5 5末末端端RNARNA引引物物被被切切除除后后，无无法法向向原原核核那那样样填填补补空空缺缺，如如果果没没有有特特殊殊的的机机制制合合成成末末端端序序列列，将将造造成成5 5 末末端端序序列列缩缩短短，染染色色体体就就会会在在细细胞胞传代中变得越来越短。传代中变得越来越短。通过通过端粒酶端粒酶催化形成端粒结构来解决催化形成端粒结构来解决6/30/202458复制叉复制叉复制叉复制叉终止区终止区 端粒结构端粒结构3 3 5 5 3 3 5 5 端粒结构端粒结构端粒酶是含端粒酶是含RNARNA的逆转录酶的逆转录酶端粒酶与细胞老化有关端粒酶与细胞老化有关端粒（端粒（telomerestelomeres）：是真核细胞染色体末：是真核细胞染色体末端所特有的结构，有许多串（端所特有的结构，有许多串（10001000串或更多）串或更多）短的重复序列组成，通常短的重复序列组成，通常3 3末端链是富含末端链是富含G G的的短序列。短序列。端粒酶端粒酶:含有含有RNARNA和蛋白质（起和蛋白质（起DNADNA聚合酶的聚合酶的作用）两种组分，作用）两种组分，RNARNA分子约分子约150b150b，含有与重，含有与重复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合成的模板。成的模板。6/30/202459（八）、（八）、DNADNA复制的其它方式复制的其它方式n大肠杆菌双链环状大肠杆菌双链环状DNADNA的复制的复制（一个复制起点，双向复（一个复制起点，双向复制）制）n真核细胞线状染色体真核细胞线状染色体DNADNA的复制方式的复制方式（多个复制起点，（多个复制起点，双向复制）双向复制）n单向滚环式复制单向滚环式复制（噬菌体（噬菌体 X174DNAX174DNA单链环状单链环状P400P400）3 D-D-环式复制方式环式复制方式（线粒体双链环状（线粒体双链环状DNADNA：两条链的复制起两条链的复制起点不同位置，且复制不同步；或同步为点不同位置，且复制不同步；或同步为2-D2-D环）环）切开正链，以负链切开正链，以负链为模板开始复制为模板开始复制6/30/202460（一）定义（一）定义:以以RNARNA为模板，按照为模板，按照RNARNA中的核苷酸顺序合成中的核苷酸顺序合成DNADNA称为逆转录，由称为逆转录，由逆转录酶逆转录酶催化进行。催化进行。v19701970年年TeminTemin和和BaltimoreBaltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病小白鼠白血病病毒等致病RNARNA病毒中分离出逆转录酶，病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌迄今已知的致癌RNARNA病毒都含有逆转录酶。病毒都含有逆转录酶。用特异抑制物（放线菌素用特异抑制物（放线菌素D D）能抑制致癌能抑制致癌RNARNA病毒的复病毒的复制，而对一般制，而对一般RNARNA病毒的复制无影响。病毒的复制无影响。已知已知放线菌素放线菌素D D专门抑制以专门抑制以DNADNA为模板的反应为模板的反应，可见致癌，可见致癌RNARNA病毒的复病毒的复制过程必然涉及到制过程必然涉及到DNADNA。所以所以TeminTemin于于19641964年提出前病年提出前病毒的假说。毒的假说。因发现逆转录酶因发现逆转录酶19751975年两人获得诺贝尔生理学与医学奖年两人获得诺贝尔生理学与医学奖二、逆转录二、逆转录（reverse transcriptionreverse transcription）6/30/202461（二）病毒（二）病毒RNARNA的逆转录过程的逆转录过程 （以（以前病毒前病毒cDNA形式整合到宿形式整合到宿主细胞主细胞DNADNA中中,随细胞增殖而传给子代，引起细胞恶性转化）随细胞增殖而传给子代，引起细胞恶性转化）病毒病毒RNARNA RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子 双链双链DNADNA（前病毒前病毒cDNAcDNA）v 逆转录酶是多功能酶，兼有逆转录酶是多功能酶，兼有3 3种酶的活性：种酶的活性：RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 核糖核酸酶核糖核酸酶H H的活性，专一水解的活性，专一水解RNA-DNARNA-DNA杂交杂交 分子中的分子中的RNARNA，可沿可沿5533和和3 3 55两个方向起核两个方向起核 酸外切酶的作用。酸外切酶的作用。v逆转录酶也和逆转录酶也和DNADNA聚合酶一样，沿聚合酶一样，沿5 53 3方向方向合成合成DNADNA，并要求并要求有有引物引物存在，还要求存在，还要求MnMn2+2+、MgMg2+2+。+RNA+RNA+DNA-DNA-RNA+RNA+DNA-DNA-DNA+DNA+35 逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶6/30/202462RNA进入细胞进入细胞逆转录逆转录RNA整合入宿主细胞染色体整合入宿主细胞染色体DNA衣壳衣壳被膜被膜逆转逆转录酶录酶丢失被膜丢失被膜丢失衣壳丢失衣壳RNAcDNA(三三)逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期当致癌当致癌RNARNA病毒侵染宿主病毒侵染宿主细胞时，病毒细胞时，病毒RNARNA及逆转及逆转录酶一起进入宿主细胞，录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入的逆转录病毒自身带入的逆转录酶使酶使RNARNA逆转录成双链逆转录成双链DNADNA。转录转录转译转译衣壳蛋白衣壳蛋白被膜蛋白被膜蛋白逆转录酶逆转录酶病毒粒子病毒粒子6/30/202463逆转录酶发现的理论和实践意义：逆转录酶发现的理论和实践意义：不能把不能把“中心法则中心法则”绝对化，遗传信息也可以从绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。19831983年，发现人类免疫缺陷病毒（年，发现人类免疫缺陷病毒（human immune human immune deficiencedeficience virus,HIVvirus,HIV）,是一类逆转录病毒，感染是一类逆转录病毒，感染T T淋巴细胞后即淋巴细胞后即杀死杀死细胞细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（acquired acquired immunodeficiency syndrome,AIDSimmunodeficiency syndrome,AIDS获得性免疫缺陷综合症获得性免疫缺陷综合症）6/30/202464 三、三、DNADNA的突变的突变 概念概念：DNADNA分子中的核苷酸序列发生突然而分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致稳定的改变，从而导致DNADNA的复制以及后来的转录的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为性，称为DNADNA的突变的突变。产生：产生：DNADNA在复制中可能产生错配，但在复制中可能产生错配，但自然条件下发生自然条件下发生的突变率非常低的突变率非常低某些物理化学因素，如紫外线、电离辐射和化学某些物理化学因素，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂（烷化剂、碱基类似物、嵌入染料）等造诱变剂（烷化剂、碱基类似物、嵌入染料）等造成。成。6/30/202465 突变的类型 碱基对的置换(substitution)转换：两种嘌呤或两种嘧啶之间互换（常见）颠换：嘌呤与嘧啶或嘧啶与嘌呤之间互换 移码突变(framesshift mutation)6/30/202466转换转换野生型基因野生型基因-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换(substitution)-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-点突变点突变（HNOHNO2 2、NHNH2 2OHOH、烷化剂等）、烷化剂等）插入或缺失插入或缺失1-21-2个碱基个碱基-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入插入A-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失缺失T移码突变移码突变(framesshift mutation)6/30/202467移码突变移码突变n由插入或缺失单个或由插入或缺失单个或2 2个碱基而改变整个基因序个碱基而改变整个基因序列、阅读框架的突变，称为列、阅读框架的突变，称为移码突变。移码突变。6/30/202468四、四、DNADNA的损伤与修复的损伤与修复在一定条件下，生物体能使DNA的损伤得到修复:暗修复暗修复（1）光裂合酶修复光裂合酶修复（2 2）切除修复切除修复（3 3）重组修复重组修复 （4 4）诱导修复诱导修复（SOSSOS修复）修复）（5 5）错配修复）错配修复6/30/202469光复合酶光复合酶特异地和特异地和嘧啶二聚体嘧啶二聚体结合结合DNADNA紫外线损伤的光裂合酶修复紫外线损伤的光裂合酶修复（光复活作用（光复活作用直接修复）直接修复）酶被可见光激活酶被可见光激活解聚解聚二聚体二聚体后酶被释放后酶被释放嘧啶对紫外比较敏感嘧啶对紫外比较敏感,而嘌呤易脱掉而嘌呤易脱掉6/30/202470切除修复一一般般DNADNA的的两两条条链链只只有有一一条条受受损损伤伤，在在一一系系列列酶酶的的作作用用下下可可将将损损伤伤部部分分切切除除，根根据互补链的序列对其进行修复。据互补链的序列对其进行修复。6/30/202471 DNA的重组修复是复制后的修复是复制后的修复DNADNA链的损伤并未除去链的损伤并未除去一直只存在母链上！若干一直只存在母链上！若干代后相当于被稀释。代后相当于被稀释。胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体二聚体6/30/202472SOS修复为为DNADNA的损伤所诱导，而的损伤所诱导，而产生产生缺乏校对功能缺乏校对功能的的DNADNA聚合酶聚合酶，它能在，它能在DNADNA损伤部位进行复损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率（率（所以会有所以会有2 2种结果：修复或种结果：修复或变异（进化）变异（进化），这属这属于于倾向错误性修复。倾向错误性修复。6/30/202473 错错 配配 修修 复复DNA在复制中发生错配，如果新合成的链被校对，基因编码信息可得到恢复；但如果模板链被校对，突变就被固定。生物体内存在错配修复系统：能够识生物体内存在错配修复系统：能够识别别“新新”“”“旧旧”链！链！(依据甲基化依据甲基化)6/30/202474DNADNA的合成方式：的合成方式：nDNADNA的复制的复制：以：以DNADNA为模板合成为模板合成DNADNA。n逆转录逆转录：以：以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA。n修复合成修复合成（DNADNA聚合酶聚合酶I I、连接酶、修复、连接酶、修复酶系统等）酶系统等）6/30/202475第二节第二节 RNARNA的生物合成的生物合成一、转录一、转录（一）概念（一）概念n转录转录（transcriptiontranscription）：以以DNADNA的一条链为模板在的一条链为模板在RNARNA聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与DNADNA链的一定区段互补的链的一定区段互补的RNARNA链的过程称为转录。链的过程称为转录。转录的不对称性转录的不对称性(asymmetricasymmetric transcriptiontranscription)：在：在RNARNA的合成中，的合成中，DNADNA的二条链中仅有一条链可作为转录的的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。模板，称为转录的不对称性。n反义链反义链（无意义链，负链）：在（无意义链，负链）：在RNARNA的转录中，用作的转录中，用作模板的模板的DNADNA链称为反义链。链称为反义链。n有义链有义链（编码链，正链）在（编码链，正链）在RNARNA的转录中，不作为模的转录中，不作为模板的板的DNADNA链称为有义链。链称为有义链。6/30/202476n转录产物转录产物：mRNA mRNA、rRNArRNA、tRNAtRNA、各种小、各种小RNARNAn基因表达的产物基因表达的产物:RNARNA和蛋白质和蛋白质n转录起始于转录起始于DNADNA模板的一个特定位点，并在另一模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个位点终止，此转录区域称为一个转录单位转录单位。n一个转录单位可以是一个基因（真核）一个转录单位可以是一个基因（真核）单顺单顺反子反子mRNA mRNA，也可以是多个基因（原核）也可以是多个基因（原核）多多顺反子顺反子mRNA mRNA。6/30/202477（二）（二）E.coli RNARNA聚合酶聚合酶：大肠杆菌的大肠杆菌的RNARNA聚合酶聚合酶只只有一种有一种,全酶由全酶由5 5种亚基种亚基2 2 组成组成，因子与其它部分的结合不是十因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易与分紧密，它易与2 2 分离，分离，没有没有、亚基的酶称为核心酶亚基的酶称为核心酶只催化只催化链的延长，对起始无作用。链的延长，对起始无作用。五种亚基的功能分别为：五种亚基的功能分别为：亚基：亚基：与启动子结合功能。与启动子结合功能。亚基亚基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键。二酯键。亚基：亚基：在全酶中存在，功能不清楚。在全酶中存在，功能不清楚。亚基亚基：与：与DNADNA模板结合功能。模板结合功能。亚基：亚基：识别起始位点。识别起始位点。6/30/202478E.coli RNARNA聚合酶的特点：聚合酶的特点：反应底物：反应底物：NTP(ATP/GTP/UTP/CTP)NTP(ATP/GTP/UTP/CTP)，DNADNA为模板、为模板、MgMg2+2+促进聚合反应。促进聚合反应。RNARNA聚合酶聚合酶不需要引物不需要引物，合成方向，合成方向5 53 3 。6/30/202479 RNA聚合酶催化的反应ACGACGUU模板模板DNA5353新新合成合成RNA6/30/202480（三）（三）E.coli RNA RNA的转录过程的转录过程：n 起始位点的识别起始位点的识别n 转录起始转录起始n 链的延伸链的延伸n 转录终止转录终止6/30/202481（1 1）起始位点的识别）起始位点的识别 RNARNA的合成不需要引物的合成不需要引物。体外实验证明，不含。体外实验证明，不含亚基的核亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有亚基时就会亚基时就会选择正确的起点。选择正确的起点。亚基起着识别亚基起着识别DNADNA分子上的起始信号（分子上的起始信号（启启动子动子指指RNARNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNADNA序列序列）的作用的作用。启动子的结构至少由三部分组成：启动子的结构至少由三部分组成：-35-35序列提供了序列提供了RNARNA聚合酶全酶识别的信号；聚合酶全酶识别的信号；-10-10序列是酶的紧密结合位点序列是酶的紧密结合位点（富含（富含ATAT碱基，利于双链打开）碱基，利于双链打开）；第三部分是；第三部分是RNARNA合成的起始点。合成的起始点。AACTGTATATTATTGACATATAAT+1转录起始点转录起始点5335 35序列序列 Sextama 框框 10序列序列Pribnow框框6/30/202482（2 2）转录起始）转录起始 RNARNA聚合酶聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是GTPGTP或或ATPATP，很少是很少是CTPCTP，不用不用UTPUTP。完成最初的几个（。完成最初的几个（2-92-9）核苷酸连接后，）核苷酸连接后，亚基就会被释亚基就会被释放脱离核心酶。放脱离核心酶。所形成的所形成的启动子、全酶和启动子、全酶和RNARNA链复合物称为三元起始复合物。链复合物称为三元起始复合物。因子仅与起始因子仅与起始有关，有关，RNARNA的合的合成一旦开始成一旦开始，便被释放便被释放 E-35-10pppG或pppA55553333模板链模板链6/30/202483（3 3）RNARNA链的延伸链的延伸DNADNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNADNA结合比较结合比较松弛，可沿松弛，可沿DNADNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的酸，将核苷三磷酸加到生长的RNARNA链的链的3-OH3-OH端，催化形端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从成磷酸二酯键。转录延伸方向从5 5 33转录泡转录泡RNARNA聚合酶聚合酶DNADNA模板模板RNA RNA 6/30/202484（4 4）转录终止）转录终止（终止子终止子和和终止因子终止因子）在在DNADNA分子上（基因末端）提供转录停止信号分子上（基因末端）提供转录停止信号的的DNADNA序列称为序列称为终止子终止子（terminators),terminators),它能使它能使RNARNA聚合酶停止合成聚合酶停止合成RNARNA并释放出并释放出RNARNA。（。（RNARNA聚合聚合酶只能感受已经转录的信号序列酶只能感受已经转录的信号序列）终止因子终止因子，协助协助RNARNA聚合酶识别终止信号的辅助聚合酶识别终止信号的辅助因子因子（蛋白质）。（蛋白质）。终止因子终止因子因子能与因子能与RNARNA聚合聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止RNARNA聚聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的录完成的RNARNA链。链。大肠杆菌有两类终止子：大肠杆菌有两类终止子：（1 1）不依赖于）不依赖于因子的终止子（强）因子的终止子（强）（2 2）依赖）依赖因子的终止子（弱终止子）因子的终止子（弱终止子）6/30/202485不依赖于不依赖于因子的终止子有因子的终止子有2 2个特征个特征（强终止子强终止子）在在DNADNA中，中，在转录单位的终点之前都有在转录单位的终点之前都有一个一个回文结构回文结构，其转录本形成发卡结构，且柄部，其转录本形成发卡结构，且柄部富含富含G G C C碱基对。碱基对。终点前大约有终点前大约有6 6 个连续的个连续的AsAs，它转录它转录成成UsUs。模板链模板链5335富含富含ATAT区区CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAA回文结构回文结构富含富含GCGC区区转录方向转录方向6/30/202486v寡聚寡聚U U序列可能序列可能提供信号使提供信号使RNARNA聚聚合酶脱离模板。合酶脱离模板。v依赖依赖的终止子，必需在的终止子，必需在因子存在时，才发生终止因子存在时，才发生终止作用。终止点前无寡聚作用。终止点前无寡聚U U序序列，回文对称区不富含列，回文对称区不富含GCGC。6/30/202487有些终止子的作用可被特异的因子所阻有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，称止，使酶得以越过终止子继续转录，称为通读（为通读（readthroughreadthrough）n能够引起抗能够引起抗终止作用的蛋白质称为终止作用的蛋白质称为抗抗终终止因子止因子（antiterminationantitermination factors factors）6/30/202488RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA局部解开局部解开磷酸二酯磷酸二酯键形成键形成终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终点延长阶段延长阶段5 3 RNA 启动子启动子（promoter)终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开转录泡6/30/202489v基本原则与原核相似，但真核基因的转录更复杂，基本原则与原核相似，但真核基因的转录更复杂，vRNARNA聚合酶不相同聚合酶不相同v启启动动子子有有三三类类，分分别别由由RNARNA聚聚合合酶酶I I、IIII、IIIIII进进行行转录。转录。v真真核核生生物物的的启启