电子显微镜的应用与诊断课件

电子显微镜的应用与诊断 小组成员 李丽洁 宋慧芳 孟 晶 宋 晶 张艳辉 指导教师 吴 岩 教授 2007级电子显微镜技术硕士研究生课程级电子显微镜技术硕士研究生课程电子显微镜的应用与诊断 小组成员 李丽洁 宋慧芳 孟 1电镜的起始电镜的起始电子显微镜诞生于30年代初,但直到60年代以前,电子显微镜在生物医学中的应用主要限于细胞生物学、微生物、实验病理学等研究领域。60年代初期人们开始将电子显微镜应用于人体病理标本,通过对这些人体病理标本的超微结构分析,人们进一步了解了疾病的病理变化及其发生机制,也同时认识到电镜做为一个新的诊断工具可直接为临床服务,为某些疾病的诊断提供重要的形态依据。电镜的起始电子显微镜诞生于30年代初,但直到60年代以前,电260年代、70年代是国际上诊断电镜发展的黄金时代,越来越多的疾病通过电镜检查而得到确诊,越来越多的病理学家认识到了电镜诊断的价值,电镜逐渐成为病理诊断的一个基本工具,欧美国家中几乎所有大的医疗中心及医院都将电子显微镜用于疾病的研究和诊断。60年代、70年代是国际上诊断电镜发展的黄金时代,越来越多的3电子显微镜在肾活检诊断、疑难肿瘤的病理诊断、感染性疾病(病毒性,细菌性等)、代谢性疾病(贮积性疾病)、细胞外物质沉积性疾病(如淀粉样变性)、组织细胞增生症(郎格罕细胞增生性疾病)、纤毛运动不能综合征等特殊疾病的诊断中公认起着重要的作用。电子显微镜在肾活检诊断、疑难肿瘤的病理诊断、感染性疾病(病毒4几种常用电镜技术几种常用电镜技术1.1常规电镜技术标本经固定后用m icro slicer 切片以增加样品量,取其中一部分(其余切片继续保存)做快速常规包埋、定位及超薄切片,用透射电镜观察,整个过程2 3 d。有些特殊结构在器官组织中分布很少,而对于疾病诊断又很有意义。本方法是先切大量半薄切片,在光镜下先找到这些特殊结构(必要时可用美蓝染色),然后再做原位包埋、超薄切片,透射电镜观察。虽然将光镜和电镜的结果结合起来分析增加了技术难度,但可使疾病的电镜病理诊断结果更全面、可靠。几种常用电镜技术1.1常规电镜技术标本经固定后用m i51.2电镜酶细胞化学技术有些疾病在光镜和常规电镜的基础上还不能完全确诊,需结合电镜酶细胞化学技术才能明确诊断。经过筛选,常用于疾病诊断和鉴别诊断的酶主要有以下几种1:1.2电镜酶细胞化学技术有些疾病在光镜和常规电镜的基础6(1)酸性磷酸酶,主要定位于溶酶体及高尔基体,是两者的标志酶;(2)葡萄糖262磷酸酶,定位于内质网及核膜,是两者的标志酶;(3)琥珀酸脱氢酶,定位于线粒体内膜,是其标志酶;(4)髓过氧化物酶,定位于粒细胞和单核细胞的线粒体、核膜、高尔基体及胞质颗粒,在原始细胞阶段的白血病可依靠该酶来进行细胞分型和鉴别诊断;(5)血小板过氧化物酶,定位于巨核细胞的核膜、线粒体及致密管道系统,对巨核细胞性白血病的诊断有重要作用。(1)酸性磷酸酶,主要定位于溶酶体及高尔基体,是两者的71.3免疫电镜技术主要有两种:一种是免疫凝集电镜技术,一般是抗原、抗体凝集经负染后在电镜下观察,多用于诊断病毒性感染疾病。另一种是免疫电镜定位技术,是用标记物标记后定位,常用标记物有3 种2:1.3免疫电镜技术主要有两种:一种是免疫凝集电镜技术,8(1)辣根过氧化物酶,相对分子质量较小,标记后可用光镜及电镜观察,多用于细胞内标记;(2)胶体金颗粒,可根据需要制备成不同大小(常用直径为5、10、15 nm),能用于细胞内及细胞表面标记;(3)铁蛋白颗粒,相对分子质量较大,一般用于细胞表面标记,但不如胶金标记优越,现使用较少。根据标本来源、种类和疾病诊断的需要可做包埋前和包埋后标记,也可进行单标、双标或多标。(1)辣根过氧化物酶,相对分子质量较小,标记后可用光镜91.4扫描电镜技术可观察到组织及细胞表面结构,适用于较大范围内观察病变细胞表面结构,在白血病细胞分类中起重要作用。如毛细胞性白血病,除了在细胞内找到典型的板层体外,另一个特征是细胞表面有大量多而长的微绒毛突化可以分析和判断对疾病的治疗情况。另外遗传性口形细胞增多症可利用扫描电镜分型,为临床治疗提供依据。1.4扫描电镜技术可观察到组织及细胞表面结构,适用于较大10免疫组织化学技术与电镜的比免疫组织化学技术与电镜的比较较进入80年代后,免疫组织化学技术开始引入病理诊断。由于此项技术的不断改进,特异性及敏感性逐渐得到改善,操作技术不断地简化并规范化,又由于单克隆技术的发展使得大量有诊断价值的抗体得以临床应用,因此这项技术很快便在人体各种疾病,尤其在肿瘤的诊断中广泛开展起来,直至今日方兴未艾。免疫组织化学技术与电镜的比较进入80年代后,免疫组织化学技术11当时许多人认为人类疾病的诊断进入了免疫组化的时代,免疫组化将取代电子显微镜成为人类疾病诊断的一个重要的手段。不少医疗单位越来越忽视电镜在疾病研究、诊断中的作用,甚至错误地认为今后的疾病诊断将不再需要电子显微镜的助,有了操作简单、快捷、费用低廉的免疫组化技术以及近年来发展起来的分子杂交、PCR、细胞基因分析等更加先进的诊断技术,足以解决人体疾病诊断中的难题。当时许多人认为人类疾病的诊断进入了免疫组化的时代,免疫组化将12要想让电镜仍然发挥出应有的或更大的作要想让电镜仍然发挥出应有的或更大的作用用,首先要进一步提高和发展现有的电镜技首先要进一步提高和发展现有的电镜技术术:进一步缩短电镜标本的制备时间,发现并应用新型固定剂、包埋材料等,简化规范电镜标本制备过程,并适用于多种类型的标本(新鲜标本及甲醛固定甚至石蜡包埋后的标本,实体组织及液体标本等);要想让电镜仍然发挥出应有的或更大的作用,首先要进一步提高和发13进一步简化,改进电镜酶细胞化学技术、胶体金免疫电镜技术等,不但保持其原来的特异性、敏感性,更要降低对标本的要求,更适应于临床的需要,使得这些技术能更广泛地应用于常规电镜诊断。其次,除了进一步拓宽常规透射电镜、扫描电镜、电子能量色散谱、微区电子衍散等。进一步简化,改进电镜酶细胞化学技术、胶体金免疫电镜技术等,不14在人体疾病诊断中的应用范围,还要积极地将扫描隧道显微镜、原子力显微镜等新型的超显微镜引入到人体疾病的研究及诊断中,开拓病理诊断的新领域。除了开展活检、外检组织的电镜检查,还要积极开展细胞学的电镜检查。电子显微镜的应用与诊断课件15此外,要提高电镜诊断水平,还要注意电镜工作者、病理医生和临床医生之间的协作,注意培养提高动用临床医疗知识、病理知识、超微结构观察及电镜技术综合知识的能力,积累各种疾病电镜诊断的要点,总结出各种疾病诊断的标准。要积极参与电镜诊断各种形式的学术交流,不断充实、更新知识。此外,要提高电镜诊断水平,还要注意电镜工作者、病理医生和临床16在我国,电子显微镜以往主要建立于大专院校及科研究院(所),部分电镜工作者缺乏电镜诊断的经验,而临床医生、病理医生往往又缺乏电镜知识,忽视电镜在疾病诊断中的作用。因此,要推动我国电镜诊断的进一步发展,积极进电镜工作者、病理医生和临床医生之间的协作及沟通显得尤为重要。电子显微镜的应用与诊断课件17电镜在疾病诊断中的应用电镜在疾病诊断中的应用在生命科学领域中,运用电镜技术观察研究生物细胞超微结构已有近半个世纪历史,而将电镜技术用于临床研究和疾病诊断也有近四十年时间。几十年来电镜作为一种先进手段,在医学科学的研究和临床疾病诊断方面作出了重大贡献。电镜在疾病诊断中的应用在生命科学领域中,运用电镜技术观察研181.电镜对病毒性疾病的诊断病毒性疾病的诊断离不开电镜,电子显微术是确定各种病毒形态结构最有用的工具。传统的超薄切片可供观察感染细胞内病毒的大小、形态、排列及其复制组装、成熟的过程以及某些有包膜病毒的芽生成熟的部位和病毒包涵体的形态特征3。1.电镜对病毒性疾病的诊断19依据电镜下病毒形态结构特征,包括衣壳的对称性、壳微粒数和排列方式、核衣壳在细胞内复制组装的部位、病毒体的形态和大小以及螺旋对称核衣壳的直径等,再结合病毒的核酸和蛋白分子生物学特性,可以对致病病毒进行鉴定和分类。电镜负染技术是一种快速简便的操作程序,也是病毒性致病因子电镜诊断常用的方法,在新病毒的发现中作出了重要贡献。免疫电镜技术的应用更提高了病毒快速诊断的敏感性和特异性4。依据电镜下病毒形态结构特征,包括衣壳的对称性、壳微粒数和排列20另外,电镜技术对研究某些病毒感染的发病机理也很有帮助。例如新近Geisbert等5报道了马尔堡出血热病人的电镜观察结果是先前无人报道过的。他们发现在胰岛中有病毒感染,在其他中,巨噬细胞是最早受病毒攻击的靶细胞。肝细胞、肾上腺皮质和髓质细胞以及纤维母细胞也是病毒复制的重要部位。另外,电镜技术对研究某些病毒感染的发病机理也很有帮助。例如新212.电镜对肿瘤的诊断病理科医生对肿瘤的诊断,主要依赖于光镜,辅以免疫组织化学等技术。一般讲,使用这些技术,绝大部分肿瘤都得以明确诊断。但有些肿瘤的诊断及鉴别诊断,电镜所起的作用很大,如无色素性黑色素瘤、肥大细胞肿瘤、嗜酸细胞瘤、肌源性肿瘤、软组织腺泡状肉瘤及神经内分泌肿瘤等6。2.电镜对肿瘤的诊断22对于这些肿瘤,光镜有时难以明确诊断。免疫组织化学方法虽然对肿瘤的诊断发挥了很大作用,但由于肿瘤的多向分化及部分市售免疫组化试剂存在明显的交叉反应性,所以应用免疫组化染色诊断肿瘤有一定的局限性。而电镜技术的应用为肿瘤的诊断提供了一条新的途径。如对神经内分泌肿瘤的诊断即为佐证。神经内分泌肿瘤都含有神经内分泌颗粒,不论其分化程度如何,是原发的还是转移的,在电镜下都很易识别。另外,通过对此类瘤细胞分泌颗粒及其他超微结构特点的识别,还可以对一些内分泌肿瘤作进一步的功能分类。以上这些都是光镜难以做到的。对于这些肿瘤,光镜有时难以明确诊断。免疫组织化学方法虽然对肿23电镜对下列肿瘤的鉴别诊断可起到重要作用:区别癌、黑色素瘤和肉瘤;区别腺癌和间皮瘤;在前纵膈肿瘤中可区别胸腺瘤、胸腺类癌、恶性淋巴瘤和生殖细胞瘤;在小圆细胞瘤中可区别神经母细胞瘤、胚胎性横纹肌瘤、Ewing氏肉瘤、恶性淋巴瘤和小细胞癌;在软组织梭形细胞瘤中可区别纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤和恶性神经鞘瘤;区别梭形细胞癌和癌肉瘤7。电镜对下列肿瘤的鉴别诊断可起到重要作用:243.电镜对非肿瘤性疾病的诊断电镜对各器官系统疾病的病理诊断,在许多单位受到重视,但用得最多的是肾脏活检和某些皮肤疾病的诊断。对肾脏病的诊断,通常将光镜、免疫荧光光镜和电镜观察三者结合。3.电镜对非肿瘤性疾病的诊断25在某些肾病的诊断中在某些肾病的诊断中,电镜起着决定作电镜起着决定作用用:遗传性肾炎。此病肾小球的组织学改变无特殊,唯电镜检查方能作出准确诊断;肾小球薄基底膜病。光镜检查无助于对此病的诊断,电镜检查是唯一能够明确此病的手段;Farbry氏病。此病的嗜锇颗粒和板层小体只有在电镜下才能观察到;肾淀粉样变及纤维性肾小球病。此类疾病在电镜下见到类淀粉纤维由无分枝的周期性细纤维组成(直径810nm,肾淀粉样变)或微管状纤维结构(直径约20nm,纤维性肾小球病),因而可作出肯定的诊断8。在某些肾病的诊断中,电镜起着决定作用:遗传性肾炎。此病肾小264.电镜获得的信息对光镜诊断结果进行补充或修正临床上,有时仅靠光镜难以对疾病明确诊断,而电镜具有高分辨性能,可以获得许多不为光镜捕捉到的信息,往往就是这些信息,为疾病的正确诊断提供了宝贵的资料,甚至修正光镜的诊断结论。Wills等9对200例病例进行了光镜诊断和电镜诊断的结果比较,发现有15%的病例靠电镜提供新的信息得以诊断。4.电镜获得的信息对光镜诊断结果进行补充或修正27图1a,1b Merkel 细胞癌胞浆内有神经内分泌颗粒。Bar=015m,012mFig.1a,1b Neurosecretory granules in the cytoplasm of Merkel cell carcinoma.Bar=015m,012m图1a,1b Merkel 细胞癌胞浆内有神经内分泌颗粒28电镜的展望新世纪来临之际,回眸过去的一百年中人类对疾病的认识有了非常深刻的变化,疾病诊断的技术手段也有了巨大的进步,这其中无疑包含了电子显微镜所作的伟大贡献。有人指出的那样:“没有电子显微镜增添新的认识和知识,就不可能有对疾病或病理过程的了解。时至今日,电子显微镜并未像某些人预测的那样随着免疫组化技术的发展而进入了末日。相反,近年来越来越多的事实证明电镜在人体各种疾病的诊断中仍然发挥着重要的作用。电镜的展望新世纪来临之际,回眸过去的一百年中人类对疾病的认29无疑,对于许多非肿瘤性疾病,由于常常无特异的抗原表达,因此其诊断仍依赖于特异的光镜及电镜形态表现。如肾活检,除了组织学特点外,电镜观察还能揭示免疫复合物沉积的确切部位及形态,基底膜及各种细胞的变化等特点,这些仍然是重要的诊断依据,因此肾活检标本目前都常规地进行电镜检查。通过检测各种细胞器、肌丝的变化及特殊的超微结构,电镜对许多代谢性疾病、细胞内外异常物质沉积性疾病(如淀粉性变性)、肌病的诊断也还起着关键的作用无疑,对于许多非肿瘤性疾病,由于常常无特异的抗原表达,30而这些疾病目前尚无法采用免疫组化的方法来诊断。对于许多感染性疾病,目前国内外虽然已建立了免疫学或PCR 等诊断技术,但在不知道具体病原体的情况下,电镜检查仍然是最快捷、可靠的诊断手段。此外,由于不少病原体(如病毒,弓形虫等)在电镜下具有明确可靠的形态特点,易于辨认,而免疫学及PCR 检测可出现程度不等的假阴性或假阳性,因此电镜检查目前仍公认为最可靠的诊断技术10。而这些疾病目前尚无法采用免疫组化的方法来诊断。对于许多感染性31