猪丹毒杆菌的检验培训ppt课件

猪丹毒杆菌的检验猪丹毒杆菌的检验1一、实验目的一、实验目的n n1 1、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；n n2 2、了解检验猪丹毒杆菌的意义。、了解检验猪丹毒杆菌的意义。、了解检验猪丹毒杆菌的意义。、了解检验猪丹毒杆菌的意义。猪丹毒杆菌的检验2一、实验目的1、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；猪丹二、实验说明二、实验说明 猪丹毒猪丹毒猪丹毒猪丹毒(Swine erysipelas)(Swine erysipelas)是由猪丹毒杆菌是由猪丹毒杆菌是由猪丹毒杆菌是由猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一种人畜共患传引起的一种人畜共患传引起的一种人畜共患传引起的一种人畜共患传染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。猪丹毒杆菌分为两个种，即红斑丹毒丝菌和扁桃体丹猪丹毒杆菌分为两个种，即红斑丹毒丝菌和扁桃体丹猪丹毒杆菌分为两个种，即红斑丹毒丝菌和扁桃体丹猪丹毒杆菌分为两个种，即红斑丹毒丝菌和扁桃体丹毒丝菌，其中仅红斑丹毒丝菌是具有致病力的毒力种，毒丝菌，其中仅红斑丹毒丝菌是具有致病力的毒力种，毒丝菌，其中仅红斑丹毒丝菌是具有致病力的毒力种，毒丝菌，其中仅红斑丹毒丝菌是具有致病力的毒力种，对猪最易感并有很强的致病性，至今已发现对猪最易感并有很强的致病性，至今已发现对猪最易感并有很强的致病性，至今已发现对猪最易感并有很强的致病性，至今已发现la,1b,2-24la,1b,2-24和和和和N N型共型共型共型共2626个血清型，大约个血清型，大约个血清型，大约个血清型，大约80%80%以上的猪源性分离株属以上的猪源性分离株属以上的猪源性分离株属以上的猪源性分离株属1 1型型型型(la(la和和和和1b)1b)和和和和2 2型，型，型，型，我国优势血清型也为我国优势血清型也为我国优势血清型也为我国优势血清型也为1a,1b1a,1b和和和和2 2型。型。型。型。猪丹毒杆菌的检验3二、实验说明 猪丹毒(Swine erysipela“大红袍大红袍大红袍大红袍”类丹毒类丹毒类丹毒类丹毒不规则鲜红色斑块不规则鲜红色斑块不规则鲜红色斑块不规则鲜红色斑块 猪丹毒杆菌的检验4“大红袍”类丹毒不规则鲜红色斑块 猪丹毒杆菌的检验4大紫肾大紫肾大紫肾大紫肾 ：典型的败血脾：典型的败血脾：典型的败血脾：典型的败血脾;肾淤肾淤肾淤肾淤血、肿大血、肿大血、肿大血、肿大 心瓣膜增生心瓣膜增生心瓣膜增生心瓣膜增生 ：疵状心内膜炎的病变，：疵状心内膜炎的病变，：疵状心内膜炎的病变，：疵状心内膜炎的病变，二尖瓣和主动脉瓣出现菜花样增生物二尖瓣和主动脉瓣出现菜花样增生物二尖瓣和主动脉瓣出现菜花样增生物二尖瓣和主动脉瓣出现菜花样增生物 脾充血肿大脾充血肿大脾充血肿大脾充血肿大 猪丹毒杆菌的检验5大紫肾：典型的败血脾;肾淤血、肿大 心瓣膜增生：疵状心内三、检验程序三、检验程序猪丹毒杆菌的检验6三、检验程序猪丹毒杆菌的检验6四、操作步骤四、操作步骤（一）增菌（一）增菌（一）增菌（一）增菌 以无菌操作取检样，用乳钵加灭菌砂磨碎，无菌操作将样以无菌操作取检样，用乳钵加灭菌砂磨碎，无菌操作将样以无菌操作取检样，用乳钵加灭菌砂磨碎，无菌操作将样以无菌操作取检样，用乳钵加灭菌砂磨碎，无菌操作将样品转至营养肉汤中，于品转至营养肉汤中，于品转至营养肉汤中，于品转至营养肉汤中，于3636士士士士11培养培养培养培养8 h10h8 h10h。（二）分离和培养（二）分离和培养（二）分离和培养（二）分离和培养 对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼脂培养基上，脂培养基上，脂培养基上，脂培养基上，3737培养培养培养培养242448h48h。或经。或经。或经。或经TSBTSB肉汤肉汤肉汤肉汤3737培养培养培养培养24h24h后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，3737培培培培养养养养24h24h。猪丹毒杆菌的检验7四、操作步骤（一）增菌 猪丹毒杆菌的检验7 血清琼脂血清琼脂血清琼脂血清琼脂：菌落特：菌落特：菌落特：菌落特征：细小、圆形、征：细小、圆形、征：细小、圆形、征：细小、圆形、透明、凸起、灰白透明、凸起、灰白透明、凸起、灰白透明、凸起、灰白色、有光泽、质软、色、有光泽、质软、色、有光泽、质软、色、有光泽、质软、露珠样、易混悬于露珠样、易混悬于露珠样、易混悬于露珠样、易混悬于盐水中。盐水中。盐水中。盐水中。猪丹毒杆菌的检验8 血清琼脂：菌落特征：细小、圆形、透明、凸起、灰白色、血液琼脂血液琼脂血液琼脂血液琼脂：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄溶血：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄溶血：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄溶血：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄溶血环（环（环（环（溶血）溶血）溶血）溶血）猪丹毒杆菌的检验9血液琼脂：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄溶血环（溶TSBTSB肉汤肉汤肉汤肉汤：轻度：轻度：轻度：轻度混浊，振动试管混浊，振动试管混浊，振动试管混浊，振动试管呈现出云雾状，呈现出云雾状，呈现出云雾状，呈现出云雾状，类似试管刷，有类似试管刷，有类似试管刷，有类似试管刷，有少量灰白色粘稠少量灰白色粘稠少量灰白色粘稠少量灰白色粘稠沉淀，不形成菌沉淀，不形成菌沉淀，不形成菌沉淀，不形成菌膜和菌环。膜和菌环。膜和菌环。膜和菌环。猪丹毒杆菌的检验10TSB肉汤：轻度混浊，振动试管呈现出云雾状，类似试管刷，有少猪丹毒杆菌的检验培训ppt课件11四、操作步骤四、操作步骤（三）生化实验（三）生化实验（三）生化实验（三）生化实验n n自自自自TSATSA琼脂平板上分别挑取琼脂平板上分别挑取琼脂平板上分别挑取琼脂平板上分别挑取2 2个以上典型或可疑菌落，接个以上典型或可疑菌落，接个以上典型或可疑菌落，接个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。n n以无菌操作将各菌分别穿刺接种至以无菌操作将各菌分别穿刺接种至以无菌操作将各菌分别穿刺接种至以无菌操作将各菌分别穿刺接种至SIMSIM培养基中，将所有培养基中，将所有培养基中，将所有培养基中，将所有试管置于试管置于试管置于试管置于3737下培养下培养下培养下培养24-4824-48小时。小时。小时。小时。猪丹毒杆菌的检验12四、操作步骤（三）生化实验猪丹毒杆菌的检验12如试管如试管如试管如试管5 5：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。（变黑）。（变黑）。（变黑）。猪丹毒杆菌的检验13如试管5：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产四、操作步骤四、操作步骤（三）生化实验（三）生化实验（三）生化实验（三）生化实验n n将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于2020培养培养培养培养7 7天，逐日天，逐日天，逐日天，逐日观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置冰箱内放置冰箱内放置冰箱内放置3030分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳性。性。性。性。n nV-PV-P试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。猪丹毒杆菌的检验14四、操作步骤（三）生化实验猪丹毒杆菌的检验14四、操作步骤四、操作步骤（三）生化实验（三）生化实验（三）生化实验（三）生化实验项目项目项目项目结果结果结果结果项目项目项目项目结果结果结果结果葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖枸盐酸盐枸盐酸盐枸盐酸盐枸盐酸盐-乳糖乳糖乳糖乳糖靛基质靛基质靛基质靛基质-果糖果糖果糖果糖硫化氢硫化氢硫化氢硫化氢蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖-甘露醇甘露醇甘露醇甘露醇-山梨醇山梨醇山梨醇山梨醇-七叶苷七叶苷七叶苷七叶苷-鼠李糖鼠李糖鼠李糖鼠李糖-木糖木糖木糖木糖-M.R.(M.R.(M.R.(M.R.(甲基红甲基红甲基红甲基红)-V-PV-PV-PV-P-氧化酶氧化酶氧化酶氧化酶-过氧化氢酶过氧化氢酶过氧化氢酶过氧化氢酶 -硝酸盐还原硝酸盐还原硝酸盐还原硝酸盐还原-明胶明胶明胶明胶不液化不液化不液化不液化注：表示阳性注：表示阳性注：表示阳性注：表示阳性;表示阴性。表示阴性。表示阴性。表示阴性。猪丹毒杆菌的检验15四、操作步骤（三）生化实验项目结果项目结果葡萄糖枸盐酸盐-（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction Reaction，PCRPCR）猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤1 1、引物：、引物：、引物：、引物：P1P1：5-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-35-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3P2P2：5-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-35-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3 猪丹毒杆菌的检验16（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Re猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤2 2、反应体系、反应体系、反应体系、反应体系 反应总体积为反应总体积为反应总体积为反应总体积为25 L 25 L，其中含有，其中含有，其中含有，其中含有12.5 L12.5 L的的的的PCR Master PCR Master MixMix，10 mol/L 10 mol/L上、下游引物各上、下游引物各上、下游引物各上、下游引物各1 L,1 g/L DNA1 L,1 g/L DNA模板模板模板模板5 5 L L，灭菌双蒸水，灭菌双蒸水，灭菌双蒸水，灭菌双蒸水6.5 L 6.5 L。（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction Reaction，PCRPCR）猪丹毒杆菌的检验17猪丹毒杆菌的检测步骤（四）聚合酶链式反应（Polymeras猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤3 3、反应条件：、反应条件：、反应条件：、反应条件：95 95，5min5min 95 95，1min1min 63 63，1min 401min 40次循环次循环次循环次循环 72 72，1min1min 72 72，10min10min（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction Reaction，PCRPCR）猪丹毒杆菌的检验18猪丹毒杆菌的检测步骤（四）聚合酶链式反应（Polymeras（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction Reaction，PCRPCR）猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤4 4、DNADNA的提取：的提取：的提取：的提取：将被检菌株接种于将被检菌株接种于将被检菌株接种于将被检菌株接种于3 mL TSB3 mL TSB肉汤中，肉汤中，肉汤中，肉汤中，3737振荡培养振荡培养振荡培养振荡培养(150 r/min)1012h(150 r/min)1012h后，取后，取后，取后，取1 mL1 mL培养液于培养液于培养液于培养液于1.5 mL1.5 mL离心管中，经离心管中，经离心管中，经离心管中，经12000 r/min 412000 r/min 4离心离心离心离心5 min5 min，弃去上，弃去上，弃去上，弃去上清液，用清液，用清液，用清液，用200L ddH200L ddH2 2OO或者或者或者或者TETE缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液(pH8.0)(pH8.0)重悬沉淀，重悬沉淀，重悬沉淀，重悬沉淀，再于沸水浴中再于沸水浴中再于沸水浴中再于沸水浴中10 min10 min，随后立即在冰中冷却，然后在，随后立即在冰中冷却，然后在，随后立即在冰中冷却，然后在，随后立即在冰中冷却，然后在12000 r/min12000 r/min及及及及4 4条件下离心条件下离心条件下离心条件下离心5 min5 min，取上清液为猪丹毒，取上清液为猪丹毒，取上清液为猪丹毒，取上清液为猪丹毒杆菌基因组杆菌基因组杆菌基因组杆菌基因组DNADNA模板。模板。模板。模板。猪丹毒杆菌的检验19（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Re猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤猪丹毒杆菌的检测步骤5 5、电泳检测：取、电泳检测：取、电泳检测：取、电泳检测：取5L PCR5L PCR产物直接经产物直接经产物直接经产物直接经1%1%琼脂凝胶（琼脂凝胶（琼脂凝胶（琼脂凝胶（含含含含0.5g/mL0.5g/mL溴化乙锭溴化乙锭溴化乙锭溴化乙锭 ）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction Reaction，PCRPCR）猪丹毒杆菌的检验20猪丹毒杆菌的检测步骤（四）聚合酶链式反应（Polymeras937bp M 1 2 3 420001000750500250100猪丹毒杆菌猪丹毒杆菌猪丹毒杆菌猪丹毒杆菌PCRPCR检测结果电泳图检测结果电泳图检测结果电泳图检测结果电泳图说明：说明：说明：说明：MDL2000MDL2000；11阳性对照；阳性对照；阳性对照；阳性对照；2 2、33被检样品；被检样品；被检样品；被检样品；44阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照。（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction Reaction，PCRPCR）猪丹毒杆菌的检验21937bp M 1 2 3 420四、操作步骤四、操作步骤四、动物实验四、动物实验四、动物实验四、动物实验1.1.实验材料实验材料实验材料实验材料实验动物：雌性昆明小鼠，体重实验动物：雌性昆明小鼠，体重实验动物：雌性昆明小鼠，体重实验动物：雌性昆明小鼠，体重1822g 1822g 器材：器材：器材：器材：1ml1ml注射器，鼠笼，垫料（所有器皿均经高压消毒）。注射器，鼠笼，垫料（所有器皿均经高压消毒）。注射器，鼠笼，垫料（所有器皿均经高压消毒）。注射器，鼠笼，垫料（所有器皿均经高压消毒）。猪丹毒杆菌的检验22四、操作步骤四、动物实验猪丹毒杆菌的检验22四、操作步骤四、操作步骤四、动物实验四、动物实验四、动物实验四、动物实验2.2.实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤每组取每组取每组取每组取2 2只小鼠，以每只只小鼠，以每只只小鼠，以每只只小鼠，以每只0.2mL0.2mL剂量进行一次性腹腔注射剂量进行一次性腹腔注射剂量进行一次性腹腔注射剂量进行一次性腹腔注射1 1只，另一只注射只，另一只注射只，另一只注射只，另一只注射0.2mL0.2mL无菌生理盐水，观察，分别记录无菌生理盐水，观察，分别记录无菌生理盐水，观察，分别记录无菌生理盐水，观察，分别记录小鼠死亡状况。小鼠死亡状况。小鼠死亡状况。小鼠死亡状况。猪丹毒杆菌的检验23四、操作步骤四、动物实验猪丹毒杆菌的检验23四、操作步骤四、操作步骤四、动物实验四、动物实验四、动物实验四、动物实验3.3.病理解剖和细菌分离病理解剖和细菌分离病理解剖和细菌分离病理解剖和细菌分离病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏，病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏，病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏，病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏，触于血清平板，触于血清平板，触于血清平板，触于血清平板，37 37培养培养培养培养1218h1218h。记录结果。记录结果。记录结果。记录结果。猪丹毒杆菌的检验24四、操作步骤四、动物实验猪丹毒杆菌的检验24（六）（六）（六）（六）结结果与果与果与果与报报告告告告 综综合以上生化合以上生化合以上生化合以上生化试验试验、PCRPCR鉴鉴定和定和定和定和动动物物物物实验实验的的的的结结果，果，果，果，报报告告告告样样品中品中品中品中检检出或未出或未出或未出或未检检出猪丹毒杆菌。出猪丹毒杆菌。出猪丹毒杆菌。出猪丹毒杆菌。猪丹毒杆菌的检验25（六）结果与报告 猪丹毒杆菌的检验25