抗体制药主题医学知识培训ppt课件

抗体制药主题医学知识抗体制药主题医学知识1抗体？抗体是指能与相应特异性结合的具有免疫功能的球蛋白（Ig）。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、增值和分化为浆细胞合成和分泌的球蛋白。第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识2抗体？第一节 概 述抗体制药主题医学知识2抗原决定簇？是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表团，通常由5-7个氨基酸残基或5-7个多糖残基/核苷酸组成。抗原决定蔟是T细胞受体、B细胞受体和抗体识别结合的基本单位，他们之间的相互作用具有高度特异性。如：菌体抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）等。第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识3抗原决定簇？第一节 概 述抗体制药主题医学知识3多克隆抗体？病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体，会给治疗和诊断带来误差。第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识4多克隆抗体？第一节 概 述抗体制药主题医学知识4单克隆抗体？1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。他们将抗体产生细胞于具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系，此细胞系能产生结构和特异性完全相同的高纯度抗体。第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识5单克隆抗体？第一节 概 述抗体制药主题医学知识5单克隆抗体？由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点。第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识6单克隆抗体？第一节 概 述抗体制药主题医学知识6以单克隆抗体作为载体的药物可对肿瘤进行定向治疗。但是，临床应用的实践证明，免疫导向法并没有成功，其障碍有：单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产 生人鼠抗体，加速了排斥反应，在人体内半衰期 只有56h，难以维持有效药物作用靶组织时间。完整的抗体分子，即Ig的相对分子质量过大，难 以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识7以单克隆抗体作为载体的药物可对肿瘤进行定向治第一节 概 述抗基于上述原因，需从两个方面对单克隆抗体加以改造：降低单克隆抗体的免疫原性。降低单克隆抗体的相对分子质量。利用基因工程技术制备出基因工程抗体，即可达到上述目的。第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识8基于上述原因，需从两个方面对单克隆抗体第一节 概 述抗体制药单克隆抗体药的现状抗体药的销售额 97年99年由4.68亿美元增长到13亿美元 03年抗体类药物总销售额将会达到50亿美元250多种抗体类药物在临床试验中 1/3 已进入三期临床 1/4 已通过临床三期试验美国市场上有种治疗用的抗体药物第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识9单克隆抗体药的现状第一节 概 述抗体制药主题医学知识9单克隆抗体药的现状l1994年，Centocor 的Reopro一种血小板表面受体的单克隆抗体片段被批准用于临床来预防治疗血栓形成l1997年批准上市的12种生物新药中有2种是抗体药l1998年上市的12种新药中有6种是抗体药l2000年又批准了Mylotarg用于治疗急性髓细胞白血病的抗CD33单克隆抗体l2001年已批准及预期会被批准的10多种生物新药中，也有5种是属于抗体类药第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识10单克隆抗体药的现状第一节 概 述抗体制药主题医学知识10抗体药物市场稳步增长第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识11抗体药物市场稳步增长第一节 概 述抗体制药主题医学知识11第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识12第一节 概 述抗体制药主题医学知识12全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体正在进行临床试验的抗体公司（38家）第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识13全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用第一节 概 述抗当前美国治疗性抗体市场第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识14当前美国治疗性抗体市场第一节 概 述抗体制药主题医学知识14当前美国治疗性抗体市场第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识15当前美国治疗性抗体市场第一节 概 述抗体制药主题医学知识15中国抗体研究现状第一节第一节 概概 述述抗体制药主题医学知识16中国抗体研究现状第一节 概 述抗体制药主题医学知识16第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备一、抗原与动物免疫二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择三、筛选阳性克隆与克隆化四、杂交瘤细胞抗体形状的鉴定五、单克隆抗体的大量制备六、单克隆抗体的纯化抗体制药主题医学知识17第二节 单克隆抗体及其制备一、抗原与动物免疫抗体制药主题医学第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备设计方案：一个B淋巴细胞-只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞-能无限增殖杂种细胞抗体制药主题医学知识18第二节 单克隆抗体及其制备设计方案：杂种细胞抗体制药主题医学第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识19第二节 单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识19第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备 杂交瘤技术产生的3个技术关键1.B1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞（B lymphocytes）：接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一点时间后便会死亡-短命细胞抗体制药主题医学知识20第二节 单克隆抗体及其制备 杂交瘤技术产生的3个技术关键抗第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备骨髓瘤细胞（myeloma cells）：恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活-长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞-没有抗体分泌物。抗体制药主题医学知识21第二节 单克隆抗体及其制备骨髓瘤细胞（myeloma cel第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备2.2.细胞融合技术：细胞融合技术：抗体制药主题医学知识22第二节 单克隆抗体及其制备2.细胞融合技术：抗体制药主题医第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备3.3.杂交瘤细胞的筛选：杂交瘤细胞的筛选：抗体制药主题医学知识23第二节 单克隆抗体及其制备3.杂交瘤细胞的筛选：抗体制药主第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识24第二节 单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识24第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识25第二节 单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识25第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识26第二节 单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识26第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识27第二节 单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识27第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备一、抗原与动物免疫抗体制药主题医学知识28第二节 单克隆抗体及其制备一、抗原与动物免疫抗体制药主题医学第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识29第二节 单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识29第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备1.抗原 动物体内 抗体 特异性差、纯度低产量低，反应不够灵敏 2.抗原 动物体内 抗体 抗原不纯 抗体不纯 筛选单一效应B细胞 不能增殖，产生大量抗体 刺激效应B刺激效应B抗体制药主题医学知识30第二节 单克隆抗体及其制备1.抗原 动物体内 第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备动物免疫动物免疫:特定目标抗原动物脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量繁殖免疫刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体目的：目的：目的：目的：在细胞融合后获在细胞融合后获在细胞融合后获在细胞融合后获得尽可能多的分得尽可能多的分得尽可能多的分得尽可能多的分泌针对于该目标泌针对于该目标泌针对于该目标泌针对于该目标抗原的特异性抗抗原的特异性抗抗原的特异性抗抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞抗体制药主题医学知识31第二节 单克隆抗体及其制备动物免疫:特定目标抗原动物脾脏中B第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备常用免疫方法：常规免疫法 “稳妥；优势克隆”脾内一次性免疫法“省时；省抗原”短程免疫法 “省时”体外免疫法 “操作繁琐”免疫途径：皮下注射腹腔注射静脉注射抗体制药主题医学知识32第二节 单克隆抗体及其制备常用免疫方法：常规免疫法 第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备常规免疫法：抗体制药主题医学知识33第二节 单克隆抗体及其制备常规免疫法：抗体制药主题医学知识3第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备脾内免疫法：脾内免疫法即在麻醉条件下直接把0.10.2ml的抗原注入脾脏进行免疫。脾内免疫法可提高小鼠对抗原的免疫反应，节省抗原用量，细胞抗原只需105个左右，可溶性抗原只需10g左右。抗体制药主题医学知识34第二节 单克隆抗体及其制备脾内免疫法：脾内免抗体制药主题医学知识培训ppt课件35第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择1.细胞融合方法：u 病毒介导的细胞融合病毒介导的细胞融合u PEG PEG 介导细胞融合介导细胞融合u 电极融合电极融合抗体制药主题医学知识36第二节 单克隆抗体及其制备二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择细胞第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备细胞悬液的制备与融合 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备 骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备 细胞融合：5%PEG（10004000），pH8.0，38，1min 抗体制药主题医学知识37第二节 单克隆抗体及其制备细胞悬液的制备与融合 脾细胞悬液第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备2.HAT培养基的筛选融合后细胞混合液HAT培养基HT培养基正常培养基2 weeks later1 week later抗体制药主题医学知识38第二节 单克隆抗体及其制备2.HAT培养基的筛选融合后细胞第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备三、筛选阳性克隆与克隆化常用方法：要求：要求：要求：要求：简便、快速、敏感；在短时间能检测大量样品n 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assayenzyme-linked immunosorbent assay，ELISA ELISA）n n间接免疫荧光法间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescenceIndirect immunofluorescence，IFA IFA）n n 放射免疫法放射免疫法（radioimmunoassayradioimmunoassay，RIA RIA）n n双向扩散法双向扩散法抗体制药主题医学知识39第二节 单克隆抗体及其制备三、筛选阳性克隆与克隆化常用方法：第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备酶联免疫吸附法（ELISA）技术原理：抗体制药主题医学知识40第二节 单克隆抗体及其制备酶联免疫吸附法（ELISA）技术原第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备四、克隆化四、克隆化四、克隆化四、克隆化常用克隆化方法：有限稀释法软琼脂平板法显微操作法u 80 个细/96孔u饲养细胞（feeder cells）ELISA 法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。抗体制药主题医学知识41第二节 单克隆抗体及其制备四、克隆化常用克隆化方法：有限稀释第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇-单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）单克隆抗体优点：l高度纯一高度纯一l高度专一高度专一应用：疾病的论断和治疗疾病的论断和治疗疾病的论断和治疗疾病的论断和治疗（生物导弹）（生物导弹）（生物导弹）（生物导弹）生物大分子的鉴定、定位和分离纯化生物大分子的鉴定、定位和分离纯化生物大分子的鉴定、定位和分离纯化生物大分子的鉴定、定位和分离纯化 细胞器的鉴定、定位和分离细胞器的鉴定、定位和分离细胞器的鉴定、定位和分离细胞器的鉴定、定位和分离 特定细胞或病毒的鉴定、定位很分离特定细胞或病毒的鉴定、定位很分离特定细胞或病毒的鉴定、定位很分离特定细胞或病毒的鉴定、定位很分离抗体制药主题医学知识42第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体（monoclonal 第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备五、单克隆抗体的大量制备常用的大规模培养方法：动物接种法动物接种法转瓶培养法转瓶培养法细胞培养罐法细胞培养罐法抗体制药主题医学知识43第二节 单克隆抗体及其制备五、单克隆抗体的大量制备常用的大规第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备五、单克隆抗体的大量制备大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：体外培养法：10g/ml 动物体内诱生法：520mg/mlBALB/c小鼠优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体较多且效价较高。缺点：混有杂蛋白有血清培养法；无血清培养法抗体制药主题医学知识44第二节 单克隆抗体及其制备五、单克隆抗体的大量制备大量制备单第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识45第二节 单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识45第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备动物接种法动物接种法动物接种法动物接种法转瓶培养法转瓶培养法转瓶培养法转瓶培养法细胞培养罐法细胞培养罐法细胞培养罐法细胞培养罐法抗体制药主题医学知识46第二节 单克隆抗体及其制备动物接种法抗体制药主题医学知识46第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识47第二节 单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识47第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识48第二节 单克隆抗体及其制备抗体制药主题医学知识48第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备六、单克隆抗体的纯化体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：1.澄清和沉淀处理2.离心 取上清，超滤，盐析3.2.分离4.a 凝胶过滤；IgG IgM 单抗纯化5.b 阴离子交换层析；IgG单抗纯化6.C 亲和层析；IgG单抗纯化抗体制药主题医学知识49第二节 单克隆抗体及其制备六、单克隆抗体的纯化体内诱生法单克