抗体制药专题知识培训课件

抗体制抗体制药专题知知识McAb 在免疫导向疗法中存在的困难（障碍）：在免疫导向疗法中存在的困难（障碍）：A、McAb均是均是鼠源性抗体鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有56h，难以，难以维持有效药物作用靶组织时间；维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的、完整的抗体分子的相对分子质量过大相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。织，达不到有效的治疗浓度。解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 A、降低、降低McAb的免疫源性；的免疫源性；B、降低、降低McAb的相对分子质量。的相对分子质量。2抗体制药专题知识5、1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体，鼠嵌合抗体，之后制备出了之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性）多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的，相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3。6、1994年年Winter创建了噬菌体抗体库技术,以基因工程方法制备抗体并发展成抗体工程抗体工程。它是抗体它是抗体研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体。体。3抗体制药专题知识第二节第二节 单克隆抗体及其改造单克隆抗体及其改造（Monoclonal AntibodyMonoclonal Antibody）一、制备单克隆抗体的一般流程一、制备单克隆抗体的一般流程 McAbMcAb是将是将抗体产生细胞抗体产生细胞与具有与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单单克隆细胞系克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的的抗体，又是单一的B B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。抗体。4抗体制药专题知识5抗体制药专题知识6抗体制药专题知识 1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫 免疫方法：体内免疫和体外免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物：免疫动物：BALB/c小鼠和小鼠和Lou大鼠大鼠 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本方法：取适量脾细胞（基本方法：取适量脾细胞（1108）与骨髓瘤细胞）与骨髓瘤细胞（21073107）进行混合，在）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间作用下诱导它们融合，时间控制在控制在2min以内，然后用培养液将以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释。7抗体制药专题知识8抗体制药专题知识用于细胞融合的骨髓瘤细胞的条件：用于细胞融合的骨髓瘤细胞的条件：1、融和率高、融和率高2、自身不分泌抗体、自身不分泌抗体3、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。9抗体制药专题知识 PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%50%，相对，相对分子质量分子质量4000为佳。相对分子质量在为佳。相对分子质量在4006000，浓，浓度在度在10%60%范围内的范围内的PEG都能使细胞发生融合。都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在为了提高融合率，在PEG 溶液中加入溶液中加入DMSO（二甲基亚二甲基亚砜砜），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。格限制接触时间。（1）细胞融合液中的细胞类型：）细胞融合液中的细胞类型：4或或5种。种。（2）如何去除脾如何去除脾-瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性培养基培养基10抗体制药专题知识11抗体制药专题知识细胞融合后，可产生多种融合细胞，如脾脾脾脾、脾脾瘤瘤、瘤瘤瘤瘤的融合细胞，而且还有许多未融合的骨髓瘤细胞未融合的骨髓瘤细胞。这些细胞比脾脾瘤融合的杂交瘤瘤融合的杂交瘤细胞增殖更快，并能将其淘汰。为此，可再将融合后的细胞立即移入选择性培养基中进行培养。常用的选择培养基为HATHAT培养基培养基，它是用次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶配制的。其中氨基喋吟(A)能阻断DNA合成的主要途径，瘤瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾脾融合细胞和瘤细胞在这样的组织培养条件下，几天内亦迅速死亡。由于骨髓瘤细胞都是次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌吟(H)和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。12抗体制药专题知识在最适的培养条件下大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活。在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞。所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。常用的饲养细胞饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。一般认为饲养细胞能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故应用的较多。13抗体制药专题知识3 3、筛选阳性克隆与、筛选阳性克隆与克隆化克隆化 常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术放射免疫技术 常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到9696孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用克隆化时也要应用HTHT培养液，以后的克隆化可用不含培养液，以后的克隆化可用不含HTHT的的RPMI 1640RPMI 1640培养液。培养液。软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入态，可用吸管吸出，移入9696孔板培养。孔板培养。14抗体制药专题知识筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆与克隆化 因为抗体产生细胞只占所有脾细胞的5左右，所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。并检测大批标本。免疫酶技术免疫酶技术因不需进行放射性核素操作，方法简便，又适于检测大批标本等优点而被广泛采用。通过引入生物素亲和素等放大系统可进一步提高灵敏性。一般说来免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组织检测患者活检组织标本为目的的抗体时，免疫荧光法则更有意义，在筛选抗体的同时，还能对所识别的抗原进行定位判定。下面以酶联免疫吸附试验筛选抗破伤风毒素抗体为例进行说明。15抗体制药专题知识16抗体制药专题知识4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定染色体分析染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为细胞为6268，NS-1为为5464，有中部和亚中部着丝点。，有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反。反之，则反。17抗体制药专题知识5 5、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大量制备 （1 1）体外培养法：用于抗原免疫性极弱）体外培养法：用于抗原免疫性极弱 获得的抗体较少。多采用获得的抗体较少。多采用RPMI 1640RPMI 1640培养液，添加培养液，添加10%-20%10%-20%胎胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100 100 g/mlg/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。养法。无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达2 210107 7/ml,/ml,收集收集的单克隆抗体可达的单克隆抗体可达400 400 g/mlg/ml。如在培养液中加入微载体，细胞密。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达度可达10108 8/ml/ml。18抗体制药专题知识（2）动物体内诱生法：）动物体内诱生法：用于抗原免疫性较强。用于抗原免疫性较强。常用常用 基本程序：接种前基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降（降植烷）或用液体石蜡，然后注射植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，杂交瘤细胞，712d便有腹便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。难度。19抗体制药专题知识6 6、单克隆抗体的纯化、单克隆抗体的纯化 根据根据IgIg的类和亚类以及用途选择不的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。同的纯化方法。体外诊断试剂体外诊断试剂IgGIgG类类-沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析 IgMIgM类类-沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和亲和层析层析+阴离子交换层析，并注意除去毒素、阴离子交换层析，并注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。病毒、核酸等微量的污染物。20抗体制药专题知识动物体内诱生法制备的动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序：纯化的一般程序：（1）澄清和沉淀处理：）澄清和沉淀处理：a.1000g 离心离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质）蛋白凝块和脂质）b.20 000g 高速离心高速离心30min,去除残留的小颗粒物质去除残留的小颗粒物质c.用用0.2 m微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体d.饱和硫酸铵沉淀抗体（饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱和硫酸铵能回收饱和硫酸铵能回收90%以上的以上的抗体）。抗体）。21抗体制药专题知识（2 2）分离）分离 A A、凝胶过滤：用于、凝胶过滤：用于IgGIgG和和IgMIgM类。常用类。常用SephadexG 200 SephadexG 200 作为分离介作为分离介质，可收集到质，可收集到3 3个峰，最高峰为个峰，最高峰为IgMIgM，另外两个峰为，另外两个峰为 IgGIgG。抗体回收率。抗体回收率达达5080%5080%，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达95%95%以上。以上。B B、阴离子交换层析：用于、阴离子交换层析：用于IgGIgG类的分离纯化。在类的分离纯化。在pH7.4pH7.4条件下，条件下，IgG1IgG1和和IgG2IgG2能结合在能结合在DEAEDEAE填料上，其中填料上，其中IgG2aIgG2a可在较低离子强度下洗脱可在较低离子强度下洗脱下来，其纯度很高。下来，其纯度很高。IgG2bIgG2b和和IgG3IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。C C、亲和层析：多用蛋白、亲和层析：多用蛋白A A亲和层析。适用于亲和层析。适用于IgGIgG类。类。IgGIgG类与蛋白类与蛋白A A的结合与的结合与pH pH 有密切的关系。鼠源性单抗在有密切的关系。鼠源性单抗在 pH8.0pH8.0时，时，IgG2bIgG2b、IgG3IgG3几几乎全部结合在蛋白乎全部结合在蛋白 A A柱上，柱上，IgG1IgG1稍差，用稍差，用 pH3.5pH3.5缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下 IgG2bIgG2b，pH4.0pH4.0缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下 IgG3IgG3，pH4.5pH4.5缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下IgG2aIgG2a，pH6.0pH6.0可洗脱下可洗脱下IgG1IgG1。用蛋白。用蛋白A A亲和层析收获的抗体纯度和很高，但也亲和层析收获的抗体纯度和很高，但也有极微量的杂蛋白。有极微量的杂蛋白。22抗体制药专题知识二、鼠源性单克隆抗体的改造二、鼠源性单克隆抗体的改造 目的：一是降低免疫源性；目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。二是降低相对分子量，增加组织通透性。原理：抗体同抗原结合的功能决定于原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（抗体分子的可变区（V V），生物功能则决），生物功能则决定于抗体分子的稳定区（定于抗体分子的稳定区（C C）。）。23抗体制药专题知识24抗体制药专题知识25抗体制药专题知识26抗体制药专题知识27抗体制药专题知识鼠源性单克隆抗体的改造鼠源性单克隆抗体的改造 1 1、人、人鼠嵌合抗体（鼠嵌合抗体（chimeric antibodychimeric antibody）：把：把鼠源性单克隆抗体的鼠源性单克隆抗体的V V区基因分离出来，分别与区基因分离出来，分别与人人IgIg的的C C区区基因连接，即成为人基因连接，即成为人鼠嵌合抗体的基因，鼠嵌合抗体的基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的Chimeric Antibody.Chimeric Antibody.2 2、改型抗体、改型抗体(Reshaping antibody)(Reshaping antibody)：用：用鼠源性单克隆抗体的鼠源性单克隆抗体的CDRCDR序列替序列替换人换人 IgIg分子中的分子中的CDRCDR序列序列，则可使人的，则可使人的 IgIg分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。这结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称种改型抗体也称CDRCDR移植抗体移植抗体 (CDR grafting antibody)(CDR grafting antibody)。3 3、小分子抗体：小分子抗体仅表达、小分子抗体：小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的鼠源性单克隆抗体的V V区区片段，其相片段，其相对分子质量仅为原抗体的对分子质量仅为原抗体的1/801/31/801/3。(1)Fab(1)Fab片段抗体：片段抗体：V VH H+C+CH1H1 (3)(3)单链抗体：单链抗体：V VH H-Linker-V-Linker-VL L (2)FV (2)FV抗体：抗体：V VH H+V+VL L (4)(4)单域抗体：单域抗体：V VH H或或V VL L （5 5）最小识别单位（）最小识别单位（MRUMRU）：单个）：单个CDRCDR区构成区构成 28抗体制药专题知识4、双功能抗体：双特异性抗体、双功能抗体：双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)。是一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异是一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。性。5、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。是、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。是20世纪世纪90年代发展的研究领域。类型如下：年代发展的研究领域。类型如下：（1）配基）配基配基型融合蛋白，如配基型融合蛋白，如 CD4-Fc.（2）配基）配基Ig型嵌合抗体，如型嵌合抗体，如 IL-2-Ig （3）配基）配基FV型嵌合蛋白，如型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4)受体受体FV型融合蛋白型融合蛋白 （5）酶）酶抗体型融合蛋白（抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）抗体酶）29抗体制药专题知识第三节第三节 抗体工程抗体工程抗体研究的三个阶段：抗体研究的三个阶段：以以18901890年年BehringBehring发现白喉抗毒素为代表，其发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体多克隆抗体；以以19751975年年K Khlerhler创建杂交瘤技术制备创建杂交瘤技术制备单克隆抗单克隆抗体体为代表；为代表；以以19941994年年WinterWinter完全用基因工程技术制备人源完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能通过细菌发酵或转基因动物性抗体，而且还能通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。在此基础上发或转基因植物大规模生产抗体。在此基础上发展成展成抗体工程抗体工程。他创建了噬菌体抗体库技术。他创建了噬菌体抗体库技术,克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。30抗体制药专题知识一、噬菌体抗体库技术的基本方法一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1、获取目的基因、获取目的基因 2、抗体库技术的载体：、抗体库技术的载体：3、淘筛（、淘筛（panning）：）：4、表达与鉴定：。、表达与鉴定：。31抗体制药专题知识1获取目的基因 提取RNA经反转录PCR(RTPCR)获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区(VH、VL)基因。抗体基因的组合形式多为单链抗体SCFV，也用连接链(G4S)3组合成功能分子。32抗体制药专题知识2抗体库技术的载体 现在普遍使用噬菌粒载体噬菌粒载体，它具有噬菌体和质粒的共同特点。因为它的转化效率高有利于提高文库容量。抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在载体表面，再感染后，能使目的克隆得以扩增。琥珀终止码在适当位置上引人载体是抗体库的关键性技术。而克隆位点后的基因序列则有利于对可溶性表达产物的鉴定和纯化。33抗体制药专题知识3淘筛 基本过程是，抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量地扩增目的克隆，且使目的克隆大量地扩增。4表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达。产物用Western-blot分析确定后，就完成了全过程。34抗体制药专题知识WesternBlotting免疫印迹Western BlotWestern Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，是蛋白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的二抗。用标记的二抗。经过经过PAGEPAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸分离的蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。用于检测蛋白水平的表达。35抗体制药专题知识36抗体制药专题知识典型的印迹实验包括三个步骤：蛋白质的电泳分离电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上。免疫学检测。37抗体制药专题知识二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库：抗体文库可以达到或超过、模拟天然全套抗体库：抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含库容，所以能包含B细胞全部细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形反转录形成的成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的有人的种属普遍性。抗体的VH和和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。基因的随机重组也增加了抗体的多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术：由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可、避开了人工免疫和杂交瘤技术：由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。融合技术。3、可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，、可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，VH和和VL基因的随机重组基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。必然都是高亲和力的人源化抗体。38抗体制药专题知识三、基因工程抗体的表达三、基因工程抗体的表达 在筛选出阳性克隆后，按其目的不同，可选用原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物等不同表达方式进行表达。1 1原核细胞表达原核细胞表达 抗体表达，又分融合表达融合表达和分泌型表达分泌型表达两种。融合表达有利于对抗体文库进行淘筛，且有利于对克隆和抗体活性进行鉴定。分泌型表达则利用琥珀终止密码的终止作用，在无琥珀抑制基因的菌株中进行表达，形成的可溶性抗体就是应用抗体。39抗体制药专题知识无义突变的三种昵称，三个终止密码子UAA叫赭石密码子；UAG叫琥珀密码子；UGA叫蛋白石密码子。琥珀突变琥珀突变（AAGUAGUAG）就是当ORF中的一个密码子突变为琥珀型终止子后，生物体采取了一种措施，原来此密码子对应的反密码子也突变为与琥珀密码子配对，从而是ORF阅读后的产物和突变后的产物一样这样就对突变进行了抑制 40抗体制药专题知识2 2真核细胞表达真核细胞表达 用于表达基因工程抗体的真核细胞有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌等，而且这些细胞的表达都是分泌型表达分泌型表达。3 3转基因植物表达转基因植物表达 抗体基因能转入植物中表达，这方面研究较多且潜力较大的是烟草叶中的表达表达的抗体称为植物抗体。目前完整的抗体分子、单链抗体和Fab片段均已在烟草叶烟草叶和拟南芥菜拟南芥菜植物中得到表达，其产量可达植物叶片总蛋白量13，其高表达产量使抗体成本大幅度下降，而且转基因植物表达可使抗体大规模农业化生产。4 4转基因动物表达转基因动物表达 即将人的Ig基因组转移到动物体内，让动物产生人源化抗体。目前只在单单基因水平基因水平上做转基因鼠的实验，大的基因片段的转移难度很大。41抗体制药专题知识 第四节第四节 抗体药物抗体药物一、抗体诊断试剂一、抗体诊断试剂二、抗体治疗药物二、抗体治疗药物42抗体制药专题知识 一、抗体诊断试剂一、抗体诊断试剂 抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表现为可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集凝集或沉淀或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊断药物基本分为三类：血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊断药物基本分为三类：1、血清学鉴定抗体制剂。、血清学鉴定抗体制剂。2、免疫标记技术用的抗体制剂。、免疫标记技术用的抗体制剂。3、体内导向诊断抗体制剂。、体内导向诊断抗体制剂。习惯上体外试验用的称试剂，体内导向诊断用的称药物。习惯上体外试验用的称试剂，体内导向诊断用的称药物。43抗体制药专题知识1 1、血清学鉴定用的抗体类试剂、血清学鉴定用的抗体类试剂 （1 1）鉴定病原菌用的抗体试剂）鉴定病原菌用的抗体试剂 A A、常用诊断血清的品种和用途、常用诊断血清的品种和用途 B B、诊断血清的制备步骤、诊断血清的制备步骤 a a、制备细菌抗原：细菌接种、制备细菌抗原：细菌接种-培养培养-收集菌苔收集菌苔-沸水沸水2.5h-2.5h-制成菌液。制成菌液。b b、免疫动物和制备抗体血清：抗原稀释后免疫动物：家、免疫动物和制备抗体血清：抗原稀释后免疫动物：家兔、马、羊、豚鼠。兔、马、羊、豚鼠。免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数3-73-7次，次，每次间隔每次间隔3-4d3-4d，末次注射后，末次注射后6-8d6-8d取血样测效价，达到要求，即可取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。采血，离心分离血清。C C、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应，镜检、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应，镜检44抗体制药专题知识45抗体制药专题知识（2）乙型肝炎病毒表面抗原（）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂的反向被动血凝诊断试剂 A A、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质吸附蛋白质，当纯化的抗，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。B、制备步骤：先用、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠免疫豚鼠-获得抗获得抗HBs血清血清-硫酸铵盐析硫酸铵盐析/柱层析柱层析-取其取其 IgG-在在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞-洗去多余蛋洗去多余蛋白成分，用含白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。C、诊断方法：、诊断方法：RPHA（reverse passive hemagglutination)反向被动血凝反向被动血凝试验，即用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原试验，即用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原 在在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，血细胞沉积于型血凝板上进行，阴性样品不凝集，血细胞沉积于V型孔底部，呈型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。46抗体制药专题知识（3 3）妊娠诊断试剂）妊娠诊断试剂 妇女妊娠后，血液和尿液中的妇女妊娠后，血液和尿液中的HCGHCG含量增含量增高，在高，在3 3个月内可达到高峰。此时检测尿个月内可达到高峰。此时检测尿液中的液中的HCGHCG，就可确定是否怀孕，就可确定是否怀孕（4 4）抗）抗ABOABO血型系统血清血型系统血清47抗体制药专题知识为保证输血的安全，供血者和受血者均需检验血型并做血交叉反应。血型有多个系统，其中重要的是ABO血型系统。按人红细胞表面带有的A或B种凝集原可将血型分为A、B、AB和O型4种。单克隆抗体是应用B淋巴细胞杂交瘤技术生产抗A或抗B血清，以鉴别ABO血型。但单克隆抗体持异性极高，而血型物质又太复杂，易得出错误的结果，其阴性结果往往不能说明没有该血型物质，需用多株单克隆抗体混合才能克服这一缺点。但用单克隆抗体进行血型物质组成的研究，则是有用的工具。血型鉴定的方法，最常用的是玻片直接凝集方法48抗体制药专题知识49抗体制药专题知识2 2、免疫标记技术用的抗体类试剂、免疫标记技术用的抗体类试剂 给抗体标记核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观给抗体标记核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。探讨发病机制提供手段。（1）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素（如异硫氰酸荧光素（FITC）、）、罗丹明（罗丹明（RB200）、藻红素（）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。（2）免疫酶抗体诊断试剂：用酶标记抗体检验抗原的方法）免疫酶抗体诊断试剂：用酶标记抗体检验抗原的方法 a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 b、HBeAg(乙型肝炎乙型肝炎e抗原抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 d、测定、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂 e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂（甲胎蛋白）酶标诊断试剂 用于原发性肝癌的辅助诊断用于原发性肝癌的辅助诊断 f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂（癌胚抗原）酶标诊断试剂 用于消化道恶性肿瘤的鉴别诊断用于消化道恶性肿瘤的鉴别诊断50抗体制药专题知识免疫酶抗体诊断技术免疫酶抗体诊断技术免疫酶技术是用酶标记抗体来检测抗原的方法。(1)免疫酶染色法（酶标抗体）免疫酶染色法（酶标抗体）酶标抗体与抗原发生特异性结合，当加人酶的底物时，底物在酶的催化作用下发生反应，产生有色物质。该物质不需特殊仪器，在光学显微镜下即能观察。目前常用的酶是辣根过氧化物酶，底物为二氨基联苯胺两者作用可生成棕褐色沉淀物，使玻片上的抗原所在部分呈色。51抗体制药专题知识(2)酶免疫测定法酶免疫测定法酶免疫测定是在液相内微量待检抗原物质的定量测定是在液相内微量待检抗原物质的定量测定方法。方法。用酶标记已知抗体或抗免疫球蛋白(抗抗体)，与待查抗原混合形成抗原抗体结合物后，加入酶的底物进行显色，根据呈色程度使用分光光度计测知待测物质的含量。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELSA)是酶免疫测定在方法上的一个重大改进，其特点是利用抗原或抗体等蛋内质容易吸附于聚苯乙烯塑料等表面的性质，使抗原抗体反应在塑料管使抗原抗体反应在塑料管(孔孔)壁表面上进行壁表面上进行，简化了抗原抗体结合物的分离手续。本法用途广泛，敏感性高，既可定性检测微量抗原，也可定量测定微生物成分、激素等微量抗原物质。52抗体制药专题知识53抗体制药专题知识（3 3）放射免疫用抗体诊断试剂）放射免疫用抗体诊断试剂 把核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合把核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出起来建立的检测技术。能测出ng/mlng/ml，甚至，甚至pg/mlpg/ml水平的微量抗原水平的微量抗原物质物质。常用的标记抗体试剂：常用的标记抗体试剂：a、HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度0.1 ng/ml b、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂：抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度0.1 ng/ml。e抗原为阳性表明病毒正在大量的繁殖，而且病毒数量比较的多，传染性强，需要马上治疗。c、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记标记 d、AFP放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度15 ng/ml e、CEA放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度1 ng/54抗体制药专题知识（1）放射免疫显像的优点）放射免疫显像的优点：在体内有确切定位肿瘤的作用准确性可达90以上，灵敏度几乎达100。在体内可检出05cm大小的病灶，并可检出肺、脑等部位的转移灶。小分子抗体容易到达肿瘤部位，可明显提高T(肿瘤组织)NT(非肿瘤组织)值。抗体在肿瘤部位，可保留69日。能观察抗体在血中的半衰期和出现的不良反应。56抗体制药专题知识（2）放射免疫显像定位技术）放射免疫显像定位技术是将抗肿瘤单克隆抗体(Ab)与二乙基三胺五乙酸(DTPA)在体外偶联，再注人体内，就能与肿瘤组织结合。由于抗体分子量较大，这一过程需3天才能完成。3天后注入半衰期短的放射性核素In113(半衰期100min)。由于原先注入的DTPA是重金属离子络合剂，所以In113就可以结合到DTPA分子上，从而使肿瘤组织显像。这一过程在2h之内即可完成。该技术具有简单、方便的优点，可在导向诊断中发挥更大的作用。57抗体制药专题知识 二、抗体治疗药物（体内用药物）二、抗体治疗药物（体内用药物）抗体治疗药物的研究已有抗体治疗药物的研究已有20多年的历史，已制备出多年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原。百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原。但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。在治疗但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅佳，但有效率仅30%。目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规治目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规治疗的应用阶段。疗的应用阶段。障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能达到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应。能达到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应。58抗体制药专题知识 (一一)、放射性核素标记的抗体治疗药物、放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体，在人体内应用是比较成功的。放射性核素标记抗体的操作简便，放射性核素和抗体的用量小，且能观察到药物在体内的分布和药物动力学，故应用前景好。研究结果证明，1、放射性核素标记的抗体有较大放射性核素标记的抗体有较大的杀伤范围的杀伤范围，这有利于克服肿瘤表面抗原的异质性，对肿瘤细胞的杀伤也不依赖抗原抗体结合后的吸收作用。2 2、放射、放射性核素标记的抗体的分子量小性核素标记的抗体的分子量小，更容易穿透到达肿瘤部位。因此，放射免疫治疗是导向治疗中活跃的领域。其缺点是有些放射性核素来源困难，且需放射性保护和污物处理。59抗体制药专题知识(二二)、抗癌药物偶联的抗体药物、抗癌药物偶联的抗体药物 1常用的抗癌药物常用的抗癌药物主要有氨甲喋吟、阿霉素、丝裂霉素、环磷酰胺、新抑癌蛋白和正定霉素等。以人血清白蛋白作为中间载体，可明显以人血清白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的药物量提高每分子抗体所携带的药物量，使体外细胞毒性提高2倍，抗体药物偶联物对化学疗法耐药的细胞株仍然有效。60抗体制药专题知识 2抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性肿瘤细胞对药物可产生多药耐药性多药耐药性(MDR)(MDR)。MDR是由基因调控的，其编码蛋白称为P P糖蛋白糖蛋白，其中P170是与肿瘤耐药相关的主要蛋白，有l280个氨基酸残基相对分子质量为170一180 kd的跨膜蛋白。在细胞膜内折叠成6对，形成通道结构，胞浆侧有2个ATP结合区。目前认为P P糖蛋白是糖蛋白是ATPATP酶依赖性的酶依赖性的药泵药泵，药物进入细胞后与P糖蛋白结合，利用ATP水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性。肿瘤细胞多药耐药性(multidrugresistance)的产生是导致肿瘤化疗失败的主要原因之一。61抗体制药专题知识针对肿瘤MDR的产生过程，应用多药耐药逆转是解决肿瘤MDR的主要手段。研究发现大量具有MDR逆转活性的化合物,主要包括：钙通道阻滞剂(维拉帕米及其衍生物)、钙调蛋白抑制剂(噻吩嗪类化合物)、免疫抑制剂(环孢菌素A及其衍生物)、类固醇和激素类似物(黄体酮、甲地孕酮）还有天然药物（中药）多药耐药逆转剂、反义寡核苷酸、核酶、RNA干扰等。但多药耐药逆转剂的毒副作用也使其临床应用受到限制62抗体制药专题知识(三）毒素偶联的抗体药物三）毒素偶联的抗体药物(1)(1)毒素的来源毒素的来源 目前主要来源是细菌毒素和植物毒素。常用的有以下几种：白喉毒素（DT)、绿脓杆菌外毒素(PE)、产气荚膜杆菌磷脂酶(PLC)、蓖麻毒素(RT)等。63抗体制药专题知识 (2)载体载体载体主要作用是将毒素携带至靶细胞表面，并与其结合，使毒素进入细胞内起作用。载体的相对分子质量要小，识别与结合靶细胞能力强，特异性好。64抗体制药专题知识 CD4 CD4细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞，在胞，在T T细胞的表面。这些细胞的表面。这些CD4CD4细胞又称为免疫系统细胞又称为免疫系统的辅助手（的辅助手（helperhelper），能指挥身体对抗微生物和病），能指挥身体对抗微生物和病毒。毒。由于艾滋病病毒攻击对象是由于艾滋病病毒攻击对象是CD4CD4细胞，所以其检细胞，所以其检测结果对艾滋病治疗效果的判断和对患者免疫功能测结果对艾滋病治疗效果的判断和对患者免疫功能的判断有重要作用。正常成人的的判断有重要作用。正常成人的CD4CD4细胞在每立方毫细胞在每立方毫米米500500个到个到16001600个，艾滋病病毒感染者的个，艾滋病病毒感染者的CD4CD4细胞下细胞下降，标志着免疫系统受到严重损害，当降，标志着免疫系统受到严重损害，当CD4CD4细胞小于细胞小于每立方毫米每立方毫米200200个时，可能发生感染或肿瘤。个时，可能发生感染或肿瘤。65抗体制药专题知识 (3)制备方法制备方法先克隆出毒素基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性细胞结合部位基因。经过改造的毒素基因与载体重组，转入受体菌表达，形成融合蛋白，经过纯化得到重组免疫毒素。66抗体制药专题知识（4 4）免疫毒素的临床应用）免疫毒素的临床应用免疫毒素可用于治疗肿瘤、自身免疫病，并能克服组织移植排斥反应，可单独给药也可以包裹在脂质体及其他微粒中给药。由于重组免疫毒素是在胞浆物质代谢中发挥作用，相对分子质量又小，渗透力强，故效果好。67抗体制药专题知识免疫毒素可用于肿瘤的免疫治疗，在临床前期应用中获得一定的抗肿瘤效果，开始进人临床I、期研究。目前用免疫毒素治疗的肿瘤有急性淋巴细胞白血病、B淋巴细胞白血病和乳腺癌等。免疫毒素可用于骨髓移植包括自体和异体骨髓移植。68抗体制药专题知识综上所述，抗体导向治疗是一项新技术，它的产生和发展并不是取代常规疗法，而是作为常规疗法的补充。但是，随着小分子抗体及其融合蛋白研究的深入，导向治疗的应用前景是良好的，最终必将占有重要的地位。69抗体制药专题知识第五节预防类制品-疫苗预防类制品主要用于感染性疾病。包括疫苗和类毒素等。疫苗是有细菌和病毒加工制的。我国习惯将细菌制备的称菌苗。病毒制备的称疫苗。国际上统称为疫苗。70抗体制药专题知识 疫苗疫苗泛指用减毒或杀死的病原生物泛指用减毒或杀死的病原生物(细菌、病毒、立克次体等细菌、病毒、立克次体等)或其抗原性或其抗原性物质、肿瘤细胞等所制成，用于预防接物质、肿瘤细胞等所制成，用于预防接种的生物制品或特异性免疫的生物制剂。种的生物制品或特异性免疫的生物制剂。71抗体制药专题知识（一）人工主动免疫制剂（一）人工主动免疫制剂 1.1.灭活疫苗灭活疫苗 选用免疫原性好的细菌、病毒、立克次体、螺旋体等，经人工培养，再用物理或化学方法将其杀灭制成。此种疫苗失去繁殖能力，但保留免疫原性。死疫苗进入人体后不能生长繁殖，对机体刺激时间短，要获得持久免疫力需多次重复接种。比如：甲肝灭活疫苗，就是死疫苗。2.2.减毒活疫苗减毒活疫苗 用人工定向变异方法，或从自然界筛选出毒力减弱或基本无毒的活微生物制成活疫苗或减毒活疫苗。常用活疫苗有卡介苗（BCG，结核病）、麻疹疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗等。接种后在体内有生长繁殖能力，接近于自然感染，可激发机体对病原的持久免疫力。活疫苗用量较小，免疫持续时间较长。活疫苗的免疫效果优于死疫苗。3.3.类毒素类毒素 细胞外毒素经甲醛处理后失去毒性，仍保留免疫原性，为类毒素。其中加适量磷酸铝和氢氧化铝即成吸附精制类毒素。体内吸收慢，能长时间刺激机体，产生更高滴度抗体，增强免疫效果。常用的类毒素有白喉类毒素、破伤风类毒素等。72抗体制药专题知识