抗体制备技术培训课件

抗体制备技术一一.抗体相关知识抗体相关知识二二.抗体产生抗体产生三三.抗体纯化抗体纯化四四.抗体检测抗体检测2抗体制备技术 抗原：抗原：能诱导免疫系统发生免疫应答能诱导免疫系统发生免疫应答,并并能与免疫应答的产物能与免疫应答的产物(抗体抗体)发生特异性反应的物质。发生特异性反应的物质。特性：特性：免疫原性和反应原性。免疫原性和反应原性。完全抗原：完全抗原：多为分子量大于多为分子量大于5KD的蛋白质的蛋白质。其它如脂多糖，其它如脂多糖，脂蛋白，糖蛋白，多糖体，核酸与蛋白的结合物。脂蛋白，糖蛋白，多糖体，核酸与蛋白的结合物。半抗原：半抗原：与大分子蛋白质结合后能引起机体产生有效的免疫与大分子蛋白质结合后能引起机体产生有效的免疫应答应答。如某些激素、药物、多肽等。如某些激素、药物、多肽等。抗原决定簇抗原决定簇 ：又称表位（又称表位（Epitope），指抗原性物质表面），指抗原性物质表面决定该抗原特异性的特殊化学基因。它可由决定该抗原特异性的特殊化学基因。它可由57个个AA，单糖或核苷，单糖或核苷酸残基决定。酸残基决定。一.抗体相关常识3抗体制备技术 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。4抗体制备技术FcFabAgIgGIgG可被木瓜蛋白酶分解为三个可被木瓜蛋白酶分解为三个区段区段Fc(Fragment crystalline)Fc(Fragment crystalline)是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片段，因其纯化时呈结晶状态而名之，该片段无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性Fab(Fragment antigen Fab(Fragment antigen bingding)bingding)该端是抗体与抗原特异性结合的部位，每分子Ig能结合2个抗原分子由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。5抗体制备技术 19751975年，年，KohlerKohler和和MilsteinMilstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成的骨髓瘤细胞融合，形成B B细胞杂细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，一抗原决定簇的高度同质的抗体，即单克隆抗体，即单克隆抗体，简称单抗。简称单抗。6抗体制备技术杂交瘤技术过程杂交瘤技术过程7抗体制备技术杂交瘤技术原理杂交瘤技术原理-细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转化酶）2.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK（胸腺嘧啶核苷激酶）3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）8抗体制备技术杂交瘤技术原理杂交瘤技术原理-HAT选择培养基的原理HAT选择培养基组分次黄嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)抗原免疫的脾细胞小鼠骨髓瘤细胞（B细胞）（B细胞恶性肿瘤）1.抗体分泌（Ig+)1.具永生性2.HGPRT+在HAT生长2.8-AG筛选出HGPRT-株PEG融合HAT筛选脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（HGPRT+、Ig+）9抗体制备技术抗原抗体反应抗原抗体反应1电荷引力(库伦引力或静电引力)。这是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力。这种引力和两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷越接近，静电引力越强。反之，这种引力便很微弱。2范德华引力。这是原子与原子、分子与分子互相接近时发生的一种吸引力，实际上也是电荷引起的引力。由于抗原与抗体两个不同大分子外层轨道上电子之间相互作用，使得两者电子云中的偶极摆而产生吸引力，促使抗原抗体相互结合。这种引力的能量小于静电引力。3氢键结合力。氢键是由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。当具有亲水基团（例如OH，NH2及COOH）的抗体与相对应的抗原彼此接近时，可形成氢键桥梁，使抗原与抗体相互结合。氢键结合力较范登华引力强，并更具有特异性，因为它需要有供氢体和受氢体才能实现氢键结合。4疏水作用。抗原抗体分子侧链上的非极性氨基酸（如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸）在水溶液中与水分子间不形成氢键。当抗原表位与抗体结合点靠近时，相互间正、负极性消失，由于静电引力形成的亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，从而促进抗原与抗体间的相互吸引而结合。这种疏水结合对于抗原抗体的结合是很重要的，提供的作用力最大。抗原与抗体能够特异性结合是基于两中分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。10抗体制备技术Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）普通抗血清（多克隆抗体）脾脾B细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培养，培养，稀释稀释单单抗抗和和多多抗抗产产生生区区别别示示意意图图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+PEG,融合融合Ab2二二.抗体产生抗体产生11抗体制备技术多肽偶联动物免疫采集血样血清制备多抗多抗/单抗单抗共有程序共有程序细胞融合细胞筛选亚克隆细胞冻存腹水生产单抗独有程序单抗独有程序12抗体制备技术多肽多肽-载体偶联载体偶联化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，因而与载体蛋白偶联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T细胞，进而诱导B细胞反应。好的载体蛋白应具有好的抗原性、可溶性和较多的偶联基团。用于与多肽偶联的载体蛋白有多种，其中最常用的是keyholelimpethemacyanin(KLH),牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）。KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽偶联载体。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。13抗体制备技术 将样品溶液加将样品溶液加在凝胶柱上进行洗在凝胶柱上进行洗脱时，大分子不能脱时，大分子不能穿过凝胶网孔进入穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，洗脱液最先流出，小分子可穿过凝胶小分子可穿过凝胶网孔进入胶粒内，网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将出来较慢，据此将不同大小的组分分不同大小的组分分离出来。离出来。14抗体制备技术半抗原半抗原载体效应载体效应实验组别初次免疫再次免疫抗DNP抗体1BSA-DNPBSA-DNP+2BSA-DNPOVA-DNP+3BSA-DNP-OVAOVA-DNP+为什么单独应用半抗原不能产生抗体，载体在抗体产生中发挥什么作用？只有当初次与再次免疫时,半抗原需要在相同载体上才能产生半抗原抗体，称此为载体效应。证明载体不是单纯起运载半抗原的作用，而是具有载体特异性。因此提出一个完全抗原分子，必须具有载体决定簇和半抗原决定簇。70年代应用载体效应过继转移实验，证明了在抗体形成过程中，有对载体特异的细胞和对半抗原特异的细胞，分别称为载体反应细胞和半抗原反应细胞。并进一步证明T细胞是载体反应细胞，对抗体产生起辅助作用。B细胞是半抗原反应细胞，是产生抗体的细胞，自此阐明了载体效应的细胞学基础。15抗体制备技术（一）动物选择（一）动物选择 要生成好的抗体，必须选择与抗原源差异较大的动物。要想获得最大的要生成好的抗体，必须选择与抗原源差异较大的动物。要想获得最大的免疫反应，绝对不能让免疫动物对抗原产生免疫反应，绝对不能让免疫动物对抗原产生自体识别自体识别。作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、兔、鼠、鸡等，实验室作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、兔、鼠、鸡等，实验室常用日本大耳白兔、山羊和小鼠等。用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染常用日本大耳白兔、山羊和小鼠等。用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫性疾患，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。过程中死亡的影响。生产多克隆抗体大多选用新西兰兔和日本大耳白兔，一组二只，初次生产多克隆抗体大多选用新西兰兔和日本大耳白兔，一组二只，初次免疫时兔的体重以不小于免疫时兔的体重以不小于2kg为宜，要求两耳光滑，明显可见耳静、动脉。为宜，要求两耳光滑，明显可见耳静、动脉。生产单克隆抗体时根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动生产单克隆抗体时根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。就小鼠而言，一组三只，初次免疫时以物。就小鼠而言，一组三只，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操周龄为宜，雌性鼠较便于操作。作。动物免疫动物免疫16抗体制备技术（二）动物免疫（二）动物免疫 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用巴结内注射等，一般常用皮下或肌肉多位点注射皮下或肌肉多位点注射。由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入免疫佐剂刺激机体的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入免疫佐剂刺激机体产生较强的免疫反应。产生较强的免疫反应。佐剂除了可以使抗原缓慢释放，从而产生持续性刺激作用外，更主要佐剂除了可以使抗原缓慢释放，从而产生持续性刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进进T细胞与细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。产生。多克隆抗体兔免疫：双肩皮下两点和双后腿肌肉两点多克隆抗体兔免疫：双肩皮下两点和双后腿肌肉两点单克隆抗体鼠常规免疫：颈后部皮下一点、双后腿肌肉两点和腹腔单克隆抗体鼠常规免疫：颈后部皮下一点、双后腿肌肉两点和腹腔单克隆抗体鼠加强免疫：尾静脉和腹腔单克隆抗体鼠加强免疫：尾静脉和腹腔17抗体制备技术（三）免疫程序（三）免疫程序多克隆抗体免疫程序时间单克隆抗体免疫程序采集免疫前血液10ml/兔第0天采集免疫前血清30ul/鼠第一次免疫200ug/兔，加CFA第2天第一次免疫100ug/鼠，加CFA第二次免疫200ug/兔，加CFA第16天第二次免疫50ug/鼠，加IFA第三次免疫100ug/兔，加IFA第30天第三次免疫50ug/鼠，加IFA第一次采集免疫后血液20-30ml/兔第36天第一次采集免疫后血液30ul/鼠第四次免疫100ug/兔，第37天第四次免疫50ug/鼠，ELISA检测ELISA、WB检测第二次采集免疫后血液20-30ml/兔第43天第二次采集免疫后血液30ul/鼠第五次免疫100ug/兔，第44天第五次免疫50ug/鼠，若阴性，继续ELISA检测若阴性，继续ELISA、WB检测第三次采集免疫后血液20-30ml/兔第50天第三次采集免疫后血液30ul/鼠第六次免疫100ug/兔，第51天第六次免疫50ug/鼠，加强免疫：40ug/鼠，18抗体制备技术血样的采集、制备与保存血样的采集、制备与保存 抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要7-10天左右时间，然后才可进行耳动脉取血工作。抓放实验兔动作应轻缓，一手抓住兔子双耳，另一只手托住兔子臀部，操作过程中避免压迫兔子内脏。用95%的酒精棉球反复檫拭至血管充分充盈后开始采血，在采血过程中继续檫拭。采血完毕用干棉球止血。收集的血液置于室温下析出血清，1800rpm离心20min,吸出血清（两次）。19抗体制备技术抗血清的保存抗血清的保存1.4保存，将抗血清清除菌后，液体状态保存于普保存，将抗血清清除菌后，液体状态保存于普通冰箱，可以存放通冰箱，可以存放3个月到半年，效价高时，一年之个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。保存时要加入内不会影响使用。保存时要加入0.10.2NaN3以防腐。如若加入半量的甘油则保存期可延长。以防腐。如若加入半量的甘油则保存期可延长。2.低温保存，放在低温保存，放在2040，一般保存，一般保存5年效价不年效价不会有明显下降，但应防止反复冻融，反复冻融几次会有明显下降，但应防止反复冻融，反复冻融几次则效价明显降低。因此低温保存应用小包装，以备则效价明显降低。因此低温保存应用小包装，以备取出后在短期内用完。取出后在短期内用完。3.冰冻干燥，最后制品内水分不应高于冰冻干燥，最后制品内水分不应高于0.2，封装，封装后可以长期保存，一般在冰箱中后可以长期保存，一般在冰箱中510年内效价不会年内效价不会明显降低。明显降低。20抗体制备技术细胞融合细胞融合 细胞融合（cell fusion）是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。利用细胞融合技术使不同的细胞融合成一个新的杂合细胞，这个新的细胞就获得了两个亲本细胞的遗传信息和细胞质，从而具备有两个亲本细胞的优点。细胞融合是一个相对简单的过程，可分为骨髓瘤细胞准备、脾细胞分离、融合操作等三个步骤。21抗体制备技术1.将骨髓瘤细胞和脾细胞1500rpm离心5min，弃上清；2.用20mlCA液重悬脾细胞后转入有骨髓瘤细胞的50ml离心管中并重悬细胞；3.1500rpm离心5min，弃上清。4.轻敲离心管，使细胞完全分散,置于37水浴中；5.在60秒内匀速缓慢滴加lmlPEG1500，同时轻轻转动离心管使混合均匀；6.37水浴中轻摇30秒，静置60秒；7.在2min内加入2mlCA液，再在2min内加入8mlCA液，同时轻轻转动离心管；8.离心管置于37培养箱培养10min；9.1500rpm离心10min，弃上清，取10mlCB液重悬细胞。10.转移5ml融合细胞的重悬液至加样槽中，加入95mlCB液、1ml细胞生长因子后混合均匀制成细胞悬液；11.按200ul/well加入96孔细胞培养板中；细胞融合细胞融合-融合操作22抗体制备技术细胞筛选细胞筛选杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。23抗体制备技术亚克隆亚克隆从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面，杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系（又称亚克隆），也需要克隆化。另外，长期液氮冻存的杂交瘤细胞，复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，因此也应作克隆化，以检测抗体分泌情况。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。克隆化的方法很多，最简单也是使用最广泛的两种方法是梯度稀释法和有限稀释法。24抗体制备技术亚克隆亚克隆-梯度稀释法ABCDEFGH12345678910111225抗体制备技术亚克隆亚克隆-有限稀释法ABCD12345626抗体制备技术杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏（1）杂交瘤细胞的冻存在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度,可在-196液氮或液氮蒸气中长期保存。（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-50，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。27抗体制备技术腹水生产腹水生产单抗的大规模生产单抗的大规模生产目前大量制备单抗的方法主要有两大系统，一是动物体内生产法，这是国内外实验室所广泛采用；另一是体外培养法。动物体内生产单抗的方法动物体内生产单抗的方法迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首选BALB/c小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险，故而最好用SPF级小鼠。a.腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.5ml。b.7-10天后腹腔接种用PBS稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠3106/0.5ml。c.间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-20ml腹水；d.将腹水离心（3000r/min10分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70冻存备用。28抗体制备技术三三.抗体纯化抗体纯化饱和硫酸铵沉淀法Protein A/Protein G亲和纯化法抗原亲和纯化法29抗体制备技术抗体纯化抗体纯化-SAS纯化纯化硫酸氨沉淀是从溶液中分离蛋白质的常用方法。这是一种比较原始，非特异性分离技术，可以用来分离大部分膜蛋白，免疫球蛋白会残留于溶液中。在溶液中，蛋白质会通过暴露于外的极性和离子基团同水分子形成氢键。加入像氨或硫酸根这样的小分子可以使蛋白质失去结合的水分子，从而使蛋白质从溶液中沉淀出来。硫酸氨沉淀法难以得到高纯度的抗体。其它大分子蛋白和混入絮状沉淀中的蛋白会造成对抗体的污染。我们可以将硫酸氨沉淀做为蛋白质纯化的一步，并采用其它方法对得到的蛋白质进行进一步纯化。血清50%SAS上清(白蛋白)沉淀(球蛋白)33%SAS上清沉淀(拟球蛋白)(球蛋白)30抗体制备技术抗体纯化抗体纯化-Protein A或或Protein G纯化纯化球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75。A蛋白或G蛋白对IgG抗体Fc臂具有特异吸附，此特性可用于纯化IgG抗体。对不同物种产生的IgG，A蛋白和G蛋白的吸附能力有一定的差别。比如，G蛋白适合羊IgG，但A蛋白不具有此特性。从A蛋白和G蛋白柱上洗脱抗体时，须非常小心，以免抗体变性。使用前 样品结合洗脱31抗体制备技术抗体纯化抗体纯化-抗原亲和纯化抗原亲和纯化抗原亲和纯化法同A蛋白和G蛋白不同，这种方法不能取得非特异性的Ig部分。在此方法中，抗原首先共价结合于分离柱上的固定相。这样，多抗样品中对此抗原有特异吸附的抗体将由于同抗原的吸附而留在分离柱上。未能结合的抗体将从分离柱上首先被洗脱，进一步洗脱将得到特异性抗体。用抗原亲和纯化法得到的抗体具有很高的特异性。32抗体制备技术四四.抗体检测抗体检测检测方法：检测方法：Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)Western Blot(WB)Immunohistochemistry(IHC)Dot Blot(DB)检测步骤：检测步骤：抗原固相化抗原固相化 抗原与抗体的反应抗原与抗体的反应 抗体与酶标二抗的反应抗体与酶标二抗的反应 酶催化底物发光或显色酶催化底物发光或显色33抗体制备技术血清稀释度阳性对照阴性对照10204080160320640128025605120可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅与标本中相应抗体的量成正比，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。35抗体制备技术抗体检测抗体检测-WBSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进引进SDS（十二烷基磺酸钠），（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是与质量成比例的，因此与蛋白质的结合是与质量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在分子量在15KD到到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。对数呈线性关系。36抗体制备技术SDSProteinboil37抗体制备技术1 2 323138抗体制备技术抗体检测抗体检测-WB电转移经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。固相载体具有牢固结合蛋白又不影响蛋白抗原活性、而且载体本身还有免疫反应惰性等特点。正极海绵垫负极海绵垫滤样纸滤样纸凝胶PVDF膜39抗体制备技术40抗体制备技术抗体检测抗体检测-WB免疫检测以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标二抗起反应，经过放射自显影以检测电泳分离的特异性目的蛋白的表达。l活化活化l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l洗涤洗涤l二抗杂交二抗杂交l洗涤洗涤l底物发光底物发光41抗体制备技术42抗体制备技术抗体检测抗体检测-IHC通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。43抗体制备技术44抗体制备技术BlockingPeptideBrainTissueRB07385+BP-BP45抗体制备技术抗体检测抗体检测-DB 实验室用来检测磷酸化项目，分别将磷酸化和非磷酸化多肽固实验室用来检测磷酸化项目，分别将磷酸化和非磷酸化多肽固定在定在NC膜上，然后分别加入磷酸化和非磷酸化抗体，膜上，然后分别加入磷酸化和非磷酸化抗体，P-Pab.只能只能识别识别P-pep.，NP-Pab.可以识别可以识别P-pep.和和NP-pep.两种多肽。两种多肽。46抗体制备技术多克隆抗体：多株B细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体多克隆抗体制备示意图多克隆抗体制备示意图蛋白多肽多肽偶联动物免疫采集血样血清制备ELISA检测纯化WB检测IHC检测DB检测产品推出制图确认ELISA检测采集血样血清制备47抗体制备技术单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单株淋巴细胞（克隆）所产生的抗体单克隆抗体制备示意图细胞培养免疫小鼠,制备脾细胞悬液蛋白质/多肽小鼠骨髓瘤细胞聚乙二醇融合融合的能产生抗体的杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞HAT选择性培养基死亡杂交瘤细胞杂交瘤细胞死亡单克隆抗体筛选和鉴定：ELISA，WesternBlot，IHC，亚型鉴定和交叉反应分析克隆选择：有限稀释法单克隆抗体的大量生产：细胞培养，小鼠腹腔接种杂交瘤细胞的保存：液氮中保存单克隆抗体的纯化，定型和包装产品推出产品推出未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞48抗体制备技术