微生物遗传与育种课件

微生物遗传与育种天津科技大学天津科技大学生物工程学院生物工程学院第二讲第二讲DNA的复制特点和几种主要复制方式的复制特点和几种主要复制方式真核和原核细胞，其DNA分子都是半保留复制复制起点（DNA复制开始的特定部位）：原核生物的染色体DNA一般只有一个复制起点(ori)真核生物染色体上有多个复制起点（酿酒酵母染色体具有400个复制起点，常被称为自主复制序列）复制子：每一个复制起点及其复制区为一个复制单位，称为复制子。复制方向：双向复制（两个复制叉）：大多数染色体DNA是双向对称复制。单向复制（一个复制叉）线状线状DNA环状双链环状双链DNA复制方式复制方式 型型滚环型滚环型D 型型双向单点双向单点双向多点双向多点E.coliE.coliE.coliE.coliX174,F因子因子线粒体线粒体DNA真核生物染色体真核生物染色体DNA复制的几种主要方式复制的几种主要方式第三节 原核生物的染色体及其复制主要组成成分：DNA 80%，其余为蛋白质和RNA。存在形式：DNA一般以裸露的核酸分子存在，虽与少量蛋白质结合，不形成染色体结构。蛋白质的功能：部分与DNA折叠有关，部分参与DNA复制、重组及转录过程。一、原核生物的染色体数目与大小大多数为一条以双链、共价闭合、环状存在的一个核酸分子。有些细菌有多条环状染色体,如脱氮副球菌。有些细菌具有线状染色体，如疏螺旋体。二、细菌染色体的结构二、细菌染色体的结构 链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体即称为拟核拟核(nucleoidnucleoid)。其中心为多种DNA结合蛋白（还有少量RNA分子），与DNA双螺旋分子的许多位点结合，形成大约100个小区（domain），每个小区的DNA都为负超螺旋，这样就使大肠杆菌的染色体压缩形成一手脚架形（手脚架形（scaffoldscaffold）的的致密致密结构结构。这些参与DNA折叠的蛋白质，称为类组蛋白（类组蛋白（histonehistone-like-like proteinprotein）或支架蛋白。除类组蛋白外，DNA还与其它蛋白质结合，如与复制、转录和加工有关的蛋白。DNA紧密缠绕，高度折叠，结合在一起；35m细胞装下1mm长的DNA。突环由双链DNA结合碱性蛋白质组成RNA-蛋白质核心细菌拟核的突环结构参与DNA折叠的蛋白质称为类组蛋白（histone-like protein）,其中含量较多的是HU(heat-unstable nucleoid protein)。平均一个突环含有40Kb DNA超螺旋超螺旋DNA的细菌染色体的细菌染色体染色体DNA大小：4.7106 bp，长约1333mm，长度约为菌体长度的1 000倍。约编码2000个基因。拟核拟核（nucleoid）结构：具有许多环状超螺旋结构，中央有一电子稠密的骨架(scaffold)，骨架周围附着有3050个负超螺旋的环，环长20nm。E.coli：细菌染色体结构是一团具有许多环状超螺旋结构的DNA大分子，中央有一电子稠密的骨架，其周围附着有30100个具有负超螺旋结构的环。思考题：如何证明拟核骨架是由RNA和蛋白质组成的？三、细菌染色体的复制1.与DNA复制有关的酶和蛋白质酶：DNA聚合酶、引物酶蛋白质：DnaA、DnaB、DnaC、DnaG、SSB等2.大肠杆菌染色体复制起点oriC的结构在oriC位点的右侧，含有4个9bp核苷酸重复序列(5-ATCCACA-3)（即4个DnaA盒）；左侧含有3个13bp富含AT的核苷酸重复序列。3.DNA复制过程型双向等速复制，包括：起始、延伸、终止。(1)复制起始：是指参与复制的蛋白质识别复制起点，合成引物，在复制起点形成活性的引物-模板复合物，并按碱基配对加上第一个核苷酸。第一、oriC区双链解开(DnaA)第二、DNA链解旋(DnaB)和解开单链的保护(SSB)第三、RNA引物的合成（了解引发体的定义:引物酶与DnaB结合，形成引发体primosome）(2)延伸过程：在DNA聚合酶的催化下，以4种三磷酸脱氧核苷(dNTP)为原料，进行聚合的过程。聚合酶：切引物RNA,填充冈崎片段(Okazaki fragment)的缺口。聚合酶：催化53 DNA合成反应。主要修复损伤的 DNA分子。聚合酶：主要复制酶，由10个不同亚基组成。复制体(replisome)：在DNA合成的生长点上，DNA聚合酶全酶二聚体、引发体和解旋酶等共同构成了一个不对称的二聚体。回环模型回环模型(p15-16)(p15-16)。(3)随着后随链模板在聚合酶中穿行，DNA聚合酶便以RNA为引物合成冈崎片段。当合成的冈崎片段到达前一个冈崎片段的5末端时，后随链模板就脱离DNA聚合酶，回环解开。(4)与此同时，前移的复制体内引物酶又合成了一段新的引物，重复以上回环方式以合成后随链。如此，DNA就可以合成出两条子链，只是后随链比前导链晚一个冈崎片段。(1)复制体能同时完成前导链前导链和后后随链随链的合成，但前导链总比后随链先行合成一个OF片段，所以同时进入合成反应的两条亲代模板链片段不互补。(2)在复制体结构中，后随链模板绕聚合酶形成一个180度的折返环，穿过复制体中DNA聚合酶的裂缝，从而使两条模板链在此均呈35的走向。(3)复制终止：两个复制叉延环状染色体以相反方向移动，并在一个特定的区域相遇而终止复制。在终止区域内含有多个ter序列，能与终止蛋白结合，使复制叉停止移动。此外，还有Tus蛋白，能识别ter序列，组织复制叉移动。在大肠杆菌终止区内，多为生长非必需的DNA，包含一些“假基因”(junk DNA)，如原噬菌体等。原核生物原核生物DNADNA复制一般复制一般按型方式进行双向等型方式进行双向等速复制速复制。如：E.coliE.coli 例外：枯草杆菌枯草杆菌 有固定的起始点，双向不对称复制双向不对称复制（两个复制叉移动是不对称）E.coliE.coli 染色体染色体DNA的复制方式的确定的复制方式的确定 E.coliE.coliE.coliE.coli 染色体染色体染色体染色体DNA的的的的复制起点（复制起点（复制起点（复制起点（oriCoriCoriCoriC）位于遗传图的位于遗传图的位于遗传图的位于遗传图的84.3min84.3min84.3min84.3min,长度为长度为长度为长度为245bp245bp245bp245bp将E.coliE.coli培养在含有培养在含有3H胸腺嘧啶的培养液中。大约经两次细胞分裂后，用溶菌酶处理细胞，提取DNA，放在半透性膜上，进行放射自显影。中央较粗的部分是两条单链都带有3H标记的DNA链，四周较细的部分是两条链中只有一条带有3H标记的DNA链。实验一实验一实验一实验一、E.coli E.coli E.coli E.coli DNA复制的复制的放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影实验结果和解释实验结果和解释 1963 1963 1963 1963年，年，年，年，CairnsCairnsCairnsCairns根据根据根据根据E.coliE.coliE.coliE.coli环状染色体环状染色体环状染色体环状染色体复制的中间复制的中间产物自显影的实验，提出了产物自显影的实验，提出了型复制型复制模型。模型。在在型复制中，同样有双向复制和单向复制。型复制中，同样有双向复制和单向复制。但以上实验不能看出：但以上实验不能看出：复制是单向还是双向进行的？复制是单向还是双向进行的？实验：实验：E.coli E.coli E.coli E.coli （T Ts s）放置）放置4242培养（培养（DNADNA复制停止），再转入复制停止），再转入加有低比活的加有低比活的3 3H H胸腺嘧啶的培养基中，胸腺嘧啶的培养基中，3030培养（可获得同培养（可获得同步生长的细胞，且步生长的细胞，且DNADNA复制开始新的周期），在第一次复制即复制开始新的周期），在第一次复制即将结束前，转入含高比活的将结束前，转入含高比活的3 3H H胸腺嘧啶中进行短时间培养，胸腺嘧啶中进行短时间培养，即刚刚开始第二次复制时进行放射自显影观察。即刚刚开始第二次复制时进行放射自显影观察。实验二、实验二、实验二、实验二、E.coliE.coli温度敏感型（温度敏感型（温度敏感型（温度敏感型（TsTs）DNADNA复制的复制的复制的复制的 放射自放射自放射自放射自 显影显影显影显影实验实验：证明证明E.coliE.coliE.coliE.coli染色体染色体染色体染色体DNA是双向复制。是双向复制。E.coliE.coliE.coliE.coli（Ts）：在在3030细胞生长，细胞生长，DNADNA复制正常；复制正常；4040以上细以上细胞停止生长，胞停止生长，DNADNA复制仍可持续，但不能开始新的复制周期。复制仍可持续，但不能开始新的复制周期。单向复制预期结果：高比活的3H标记的黑点较多的部分集中在一个地方双向复制预期结果：高比活的3H标记的黑点较多的部分在大致位置相对的两处实际结果符合双向等速复制模型利用放射自显影的方法测定出：细菌复制叉移动速度大约每分钟50,000 bp。细胞细胞分裂时间与分裂时间与DNA复制一周的时间差别很大：复制一周的时间差别很大：世代时间为20min，而DNA复制一周为40min。而且实验还证明：复制叉前进的速度是比较恒定的，复制速度取决于复制起始频率。细胞如何调节复制和分裂之间的差别呢？在营养丰富的培养基中，DNA复制总是在第一个周期还未完成时，就开始第二个周期复制，以保证分裂时每个子细胞都有一个完整的染色体。因此，一个染色体可以不只2个生长点。对数生长期的细胞内可能有24个拟核，停止生长的每个细胞内有1个拟核。E.coli染染色色体体DNA上的复制生长点上的复制生长点E.coli染染色色体体DNA上的复制起点上的复制起点 E.coli染染色色体体DNA上的复制生长点上的复制生长点实验三、根据噬菌体实验三、根据噬菌体P1普遍性转导频率：普遍性转导频率：证明证明E.coliE.coliE.coliE.coli染色体染色体DNADNA是双向复制的是双向复制的 实验原理：在一个快速繁殖的细菌群体中，每一个细菌的染色体复制处于不同的阶段。可以设想在这样一个群体中，染色体上的各个基因的数目是不等的，越是接近复制起点的基因为数越多。噬菌体P1能转导E.coliE.coli的的任何一个基因。可以设任何一个基因。可以设想供体细菌群体中的某一基因数目越多，则被转导想供体细菌群体中的某一基因数目越多，则被转导的几率越大，这一转导子的频率也越高。的几率越大，这一转导子的频率也越高。如果复制是单向的，那么图中染色体上的基因A 将是最多的，和它邻近的G将是最少的；如果复制是二向的，那么图中染色体上的基因A 和G都将是最多的，而D将是最少的。环状细菌染色体的分裂环状细菌染色体的分裂起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉新新 DNA母本染色体母本染色体复制进行中复制进行中子染色体形成子染色体形成两个子染色体两个子染色体 细菌细胞分裂时看不到纺锤体。是什么因素使分裂后的染色体有规律地分处到二个子细胞中呢？电镜的观察结果说明：大肠杆菌和枯草杆菌等细菌的核质体和间体（细胞膜内褶形成的囊状结构）相连；并可分离到和细胞膜连在一起的DNA。现在认为现在认为间体间体与与DNADNA的复制、分配和细胞分裂有关的复制、分配和细胞分裂有关，起着相当于高等动植物中纺锤丝的作用。起着相当于高等动植物中纺锤丝的作用。在DNA链上与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合，如大肠杆菌染色体DNA的复制起点（OriC）、复制终点（TerC）等。细胞膜在这里的作用可能是对染色体起固定作用，另外，在细胞分裂时将复制后的染色体均匀地分配到两个子代细菌中去。第四节 真核生物染色体及其复制典型的真核染色体结构:DNA：30%40%组蛋白组蛋白 非组蛋白非组蛋白 染色体中结构蛋白质，与DNA组成核小体 含量为组蛋白的6070，种类在20100之间，常见的有1520种，包括：RNA聚合酶、包装蛋白、加工蛋白、与细胞分裂有关的蛋白及与基因表达有关的蛋白。60%以上1.1.真核生物染色体的真核生物染色体的组成组成一、染色体在真核微生物中的组成和结构染色体在真核微生物中的组成和结构 组蛋白组蛋白类别类别碱性氨基酸碱性氨基酸LysLysArgArg酸酸性性氨氨基酸基酸碱碱/酸酸氨氨基基酸酸残基数残基数分分 子子 量量(dalton)(dalton)H1H1极极 富富LysLys29291 15 55.45.421521523,00023,000H2AH2A11119 915151.41.412912913,96013,960H2BH2B稍稍 富富LysLys16166 613131.71.712512513,77413,774H3H31010131313131.81.813513515,34215,342H4H4富富ArgArg1111141410102.52.510210211,28211,282 根据其电泳性质(赖、精在蛋白质分子中的相对比例)，将组蛋白分为五种小类型：H1、H2A、H2B、H3和H4。染色体中的五种组蛋白2.2.真核生物染色体的结构真核生物染色体的结构 要把相当长的DNA分子放在很小的细胞核里，必须将染色体DNA大大压缩。染色体的包装(即压缩)分为四级：核小体、螺线管纤维、环状螺线管、染色体。核小体：核小体：可视为染色体DNA的一级包装，即由直径2nm的DNA双螺旋链绕组蛋白形成直径直径11nm的核小体的核小体“串珠串珠”结构结构。若以每碱基对沿螺旋中轴上升距离为0.34nm计，200bp DNA（一个核小体的DNA片段）的伸展长度为68nm，形成核小体后仅为11nm（核小体直径），其长度压缩了6-7倍。（1）染色体DNA的一级包装：即染色质的结构模型 直径直径11nm的核小体链的核小体链染色体的包装(即压缩)分为四级：染色质是由DNA和蛋白质组成的纤维细丝状，是以核小体为基核小体为基本结构单位本结构单位所连成的念珠状结构连成的念珠状结构。染色质：细胞分裂间期分裂间期DNA和蛋白质所组成的一种相对松散松散的结构。染色体：细胞分裂期分裂期DNA和蛋白质所组成的一种相对紧凑紧凑的结构。核小体（核小体（nucleosome）：）：核心颗粒(core particle)：由组蛋白八聚体组成，DNA以左螺旋 在其上盘绕1.8圈，共146bp。连接区DNA(linker DNA)：H1组蛋白结合在连接DNA上。由核心颗粒到H1组蛋白之间的DNA为 20bp(真菌)。酵母的核小体中无酵母的核小体中无H1。它是由核小体纤维盘绕形成的一种中空螺线管，其外径为30nm，每圈含，每圈含6个核小体个核小体。2）二级包装结构模型：30nm螺线管纤维螺线管纤维(solenoidal fiber)螺线管的形成，使DNA一级包装又压缩小6倍。H1组蛋白在维持毗邻核小体的紧密度及核小体纤维折转形成螺线管中起了重要作用。（3）三级包装：三级包装：环状螺线管：环状螺线管：这种结构是30nm纤维缠绕在一个由某些非组蛋白非组蛋白构成的中心轴中心轴(central axis)骨架骨架上形成的，即螺线管纤维相隔一定间距的某些区段被“拉拢”固定在蛋白轴上，从而产生了许多从骨架上伸出的纤维环纤维环(loops)。据认为，纤维环的形成是基因表达较理想的结构，这些环状区是基因表达的活性单位所在。（4）四级包装：染色体形成四级包装：染色体形成 具环形区的螺线管纤维进一步盘绕、折叠具环形区的螺线管纤维进一步盘绕、折叠，最终完成细胞生长和繁殖的不同时期的染色体染色体包装。经各级包装后，染色体经各级包装后，染色体DNA总共被压缩了数千倍总共被压缩了数千倍，这样，才能使每个染色体中几厘米长（如人染色体的DNA分子平均长度为4cm）的DNA分子，容纳在直径数微米（如人细胞核的直径为6-7m）的细胞核中。这种在更高层次上的复杂的包装是以何种方式进行的，目前尚无明确定论。从螺线管纤维环到包装形成染色体，应该是DNA压缩程度最高的阶段，估计在200-240倍。染色体包装模型（3）染色染色质纤丝和非质纤丝和非组蛋白骨架组蛋白骨架结合形成很结合形成很多突环多突环形成玫瑰形成玫瑰花结形状花结形状的结构的结构非组蛋白可能在稳定染色体高级结构方面起重要作用谢谢