乙肝病毒cccDNA检测ppt课件

乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒cccDNAcccDNA检测方法与应用价值检测方法与应用价值乙肝病毒cccDNA检测1 乙型肝炎病毒cccDNA 一、几个相关问题简介一、几个相关问题简介乙肝病毒cccDNA检测2一、几个相关问题简介乙肝病毒cccDNA检测2什么是什么是HBV cccDNA?HBV cccDNA?即即 共共 价价 闭闭 合合 环环 状状 DNADNA（covalently covalently closed closed circular circular DNA)DNA)。乙乙肝肝病病毒毒感感染染宿宿主主细细胞胞后后在在细细胞胞内内复复制制并并建建立立感感染染状状态态，病病毒毒松松弛弛环环状状DNADNA（rcDNArcDNA）进进入入细细胞胞核核，利利用用宿宿主主DNADNA聚聚合合酶酶和和拓拓扑扑酶酶等等“修修复复”形形成的、结构完整的、超螺旋双链成的、结构完整的、超螺旋双链DNADNA分子。分子。乙肝病毒cccDNA检测3什么是HBV cccDNA?即共价闭合环状DNA乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙肝病毒cccDNA检测4乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙肝病毒cccDNA检测4乙型肝炎病毒的复制过程乙型肝炎病毒的复制过程乙肝病毒cccDNA检测5乙型肝炎病毒的复制过程乙肝病毒cccDNA检测5我们为什么要关注我们为什么要关注HBV cccDNA?HBV cccDNA?cccDNAcccDNA存存在在于于细细胞胞核核内内，成成为为乙乙肝肝病病毒毒的的复复制制“池池”目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNAcccDNA 的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之一疗后容易复发的原因之一 肝脏以外器官组织细胞可能存在肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNAcccDNA，成为肝脏，成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源移植术后乙肝复发的来源 还没有稳定、可靠、敏感的还没有稳定、可靠、敏感的cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世乙肝病毒cccDNA检测6我们为什么要关注HBV cccDNA?cccDNA存在于为什么没有为什么没有cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世?研究和开发该检测技术的时间不长研究和开发该检测技术的时间不长检测技术上的难度较大检测技术上的难度较大前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，不能满足临床检验的需求模，不能满足临床检验的需求现有技术灵敏度不高，检测低限现有技术灵敏度不高，检测低限10104 4 copycopy /ml /ml左右左右分研究机构和学者对检测技术的特异性认分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足，存在缺陷识不足，存在缺陷乙肝病毒cccDNA检测7为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?研究和开发该检测技术多种同源的乙肝病毒多种同源的乙肝病毒DNADNA分子并存分子并存(cccDNA(cccDNA、rcDNA rcDNA、ssDNAssDNA、整合的、整合的HBV DNAHBV DNA），必须有），必须有 效地分离效地分离cccDNAcccDNA和其他类型的病毒和其他类型的病毒DNADNA如何进一步解决特异性的问题？如何进一步解决特异性的问题？如何解决灵敏度不高的问题（细胞内如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNAcccDNA 含量的较低），血清中含量？含量的较低），血清中含量？如何简化检测步骤？如何简化检测步骤？建立建立cccDNAcccDNA检测技术必须克服的难点检测技术必须克服的难点乙肝病毒cccDNA检测8多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、建立ccccccDNAcccDNArcDNArcDNA核酸一级结构核酸一级结构完整的双链完整的双链两条链均不完整两条链均不完整核酸空间结构核酸空间结构闭合环状，超螺旋闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合是否与蛋白质结合不结合不结合共价结合共价结合对某些核酸酶抗性对某些核酸酶抗性强，不容易被降解强，不容易被降解弱，容易被降解弱，容易被降解分离分离cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的分子基础的分子基础分离分离cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的任何手段均基于上述差异的任何手段均基于上述差异乙肝病毒cccDNA检测9cccDNArcDNA核酸一级结构完整的双链两条链均不完整核二、二、HBV cccDNA检测技术检测技术乙肝病毒cccDNA检测10二、HBV cccDNA检测技术乙肝病毒cccDNA检测101.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者探针法（侵入者探针法（Invader assaayInvader assaay）3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介乙肝病毒cccDNA检测111.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)现有的现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介 选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者探针法（侵入者探针法（Invader assaayInvader assaay）3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法乙肝病毒cccDNA检测12现有的几种cccDNA检测技术简介选择性PCR(普通PCR设计一对特殊引物：跨设计一对特殊引物：跨双双缺口引物缺口引物 正义引物正义引物P1 P1：与负链互补结合，位于正：与负链互补结合，位于正 链缺口上游链缺口上游 反义引物反义引物P2 P2：与正链互补结合，位于负：与正链互补结合，位于负 链缺口下游链缺口下游目的：目的：rcDNArcDNA不被扩增不被扩增1.1.选择性选择性PCRPCR乙肝病毒cccDNA检测13设计一对特殊引物：跨双缺口引物1.选择性PCR乙肝病毒cc选择性选择性PCR：rcDNA不被扩增不被扩增乙肝病毒cccDNA检测14选择性PCR：rcDNA不被扩增乙肝病毒cccDNA检测14选择性选择性PCRPCR：cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增乙肝病毒cccDNA检测15选择性PCR：cccDNA能被扩增乙肝病毒cccDNA检测1PCR产物自身退火（产物自身退火（self annealing）“选择性选择性”PCR”PCR：并非万无一：并非万无一失失乙肝病毒cccDNA检测16PCR产物自身退火（self annealing）“选择性 rcDNArcDNA被被大大量量扩扩增增，阳阳性性结结果果不不可可靠靠，定定量量结结果果也不可靠也不可靠 Hepatology Research 2003;15:234-243 Hepatology Research 2003;15:234-243（PBMCPBMC）World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清血清)l Kock Kock等：反应管中等：反应管中rcDNArcDNA含量不能超过含量不能超过10105 5copycopy Hepatology Hepatology 1996;23:405-4131996;23:405-413 血血清清HBV HBV rcDNArcDNA超超过过10108 8copy/mlcopy/ml，进进行行荧荧光光PCRPCR可能会出现检测结果假阳性可能会出现检测结果假阳性“选择性选择性”PCR”PCR：并非万无一：并非万无一失失乙肝病毒cccDNA检测17 rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可 与与定定性性法法比比较较增增加加了了一一个个荧荧光光探探针针，探探针针位位于于扩扩增增片片段段区区（负负链链缺缺口口下游），与下游），与cccDNAcccDNA的负链互补。的负链互补。选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙肝病毒cccDNA检测18 与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（rcDNArcDNA不能被扩增不能被扩增无荧光信号无荧光信号EcoR I5+P1 P2 3200(1)53159031820P118201590+3200（1）EcoR I P2cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增检测到荧光信号检测到荧光信号选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙肝病毒cccDNA检测19rcDNA不能被扩增EcoR I5+P1 P2 32实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理乙肝病毒cccDNA检测20实时荧光定量PCR的原理乙肝病毒cccDNA检测20实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理乙肝病毒cccDNA检测21实时荧光定量PCR的原理乙肝病毒cccDNA检测21实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理乙肝病毒cccDNA检测22实时荧光定量PCR的原理乙肝病毒cccDNA检测22l 标准曲线方程标准曲线方程Y YCtCt=42.0827-3.5554logX=42.0827-3.5554logXcopycopyl 相关指数：相关指数：R R2 2=0.995=0.995l 灵敏度至少可以达到灵敏度至少可以达到10103 3copy/ml copy/ml 结果结果：选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙肝病毒cccDNA检测23 标准曲线方程YCt=42.0827-3.5554logX同样存在同样存在PCRPCR产物自身退火引起的产物自身退火引起的rcDNArcDNA 非特异性扩增的问题非特异性扩增的问题由于灵敏度较普通由于灵敏度较普通PCRPCR高，假阳性率比普高，假阳性率比普 通通PCRPCR更高更高缺陷：缺陷：选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙肝病毒cccDNA检测24同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA缺陷：选择性实时质粒标准品质粒标准品107copy/ml3.5108copy/ml携带者血清携带者血清质粒标准品质粒标准品105copy/ml105107copy/ml携带者血清携带者血清选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙肝病毒cccDNA检测25质粒标准品107copy/ml3.5108copy/ml携解决方案解决方案l 特异性抽提分离特异性抽提分离cccDNAcccDNA与其它形式的病毒与其它形式的病毒DNADNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法l 酶切纯化酶切纯化cccDNAcccDNA 采用绿豆核酸酶或采用绿豆核酸酶或ATPATP依赖的依赖的plasmid-safe DNAplasmid-safe DNA酶酶选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙肝病毒cccDNA检测26解决方案 特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA选1.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)侵入者探针法（侵入者探针法（Invader assaayInvader assaay）3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介乙肝病毒cccDNA检测271.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)现有的2.2.侵入者探针法侵入者探针法(Invader assay)(Invader assay)两个体系：两个体系：两两 种种 特特 殊殊 的的 探探 针针：invader invader probeprobe和和 primary primary probeprobe，后者含与待测模板无关的，后者含与待测模板无关的55侧翼的碱基片段。侧翼的碱基片段。荧荧 光光 共共 振振 能能 量量 转转 移移 系系 统统：被被 核核 酸酸 内内 切切 酶酶 (cleavase,(cleavase,裂裂解解酶酶)特特异异地地切切割割55侧侧翼翼碱碱基基片片段段作作为为第第二二个个invaderinvader，与与荧荧光光共共振振能能量量转转移移盒盒（FRETCFRETC）结结合合，裂裂解解酶酶切切割割FRETCFRETC上上含含有有荧荧光光基基团团的的短短臂臂，发发出出荧荧光光信信号。号。特特点点：一一个个模模板板可可以以重重复复使使用用，每每“结结合合裂裂解解结结合合裂裂解解”一一次次为为一一个个循循环环，每每循循环环一一次次产产生生一一个个荧荧光光信信号，呈线性信号放大号，呈线性信号放大乙肝病毒cccDNA检测282.侵入者探针法(Invader assay)两个体系：乙肝乙肝病毒cccDNA检测29乙肝病毒cccDNA检测29乙肝病毒cccDNA检测30乙肝病毒cccDNA检测30侵入者探针法侵入者探针法定量检测定量检测cccDNAcccDNA的优缺点的优缺点优点优点：线性信号放大，特异性比荧光：线性信号放大，特异性比荧光 PCR PCR法强法强缺点缺点：灵敏度低：灵敏度低：10104 4copy/mlcopy/ml乙肝病毒cccDNA检测31侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点优点：线性信号放大，1.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者分析法（侵入者分析法（Invader assaayInvader assaay）嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介乙肝病毒cccDNA检测321.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)现有的3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法Shao,et al.J Virol Methods 2003；112：45-52+PNN：与：与HBVDNA非同源片段非同源片段5N533p+rcDNAcccDNA乙肝病毒cccDNA检测333.嵌合引物荧光PCR法Shao,et al.J ViPNNP253533.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法乙肝病毒cccDNA检测34PNNP253533.嵌合引物荧光PCR法乙肝病毒 嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR的优缺点的优缺点 优点：优点：克服了荧光克服了荧光PCRPCR法的部分缺陷，灵敏法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高度比侵入法提高 缺点：缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNA rcDNA被非特异性扩增被非特异性扩增乙肝病毒cccDNA检测35 嵌合引物荧光PCR的优缺点 优点：克服了荧光PCR法的部 无无论论是是选选择择性性荧荧光光PCRPCR，还还是是侵侵入入者者探探针针法法或或嵌嵌合合引引物物荧荧光光PCRPCR，本本身身都都不不能能解解决决在在高高rcDNArcDNA背背景景条条件件下下的的假假阳阳性性问问题题，必必须须结结合合抽抽提提分分离离、酶酶切切纯纯化化等等步步骤骤，以以提提高高特特异性。异性。乙肝病毒cccDNA检测36 无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧三、影响三、影响cccDNA池的因素池的因素乙肝病毒cccDNA检测37三、影响cccDNA池的因素乙肝病毒cccDNA检测371.cccDNA1.cccDNA池的自身恒定池的自身恒定 cccDNAcccDNA池：感染肝细胞核内池：感染肝细胞核内HBV cccDNAHBV cccDNA的的 含量在无外来干扰的情况下保含量在无外来干扰的情况下保 持恒定持恒定(5(550copy/cell)50copy/cell)病毒自身调节：关于病毒的进化病毒自身调节：关于病毒的进化 关于病毒的关于病毒的“思维思维”病毒自身的调节病毒自身的调节 外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果乙肝病毒cccDNA检测381.cccDNA池的自身恒定 cccDNA池：感染肝细胞核2.2.抗病毒药物对抗病毒药物对cccDNAcccDNA的影响的影响l现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少似物，可以一过性地减少cccDNAcccDNA，但均不能，但均不能清除清除cccDNAcccDNAl细胞核内细胞核内cccDNAcccDNA含量的相对稳定性，决定了含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性长疗程抗病毒治疗的必要性乙肝病毒cccDNA检测392.抗病毒药物对cccDNA的影响现有抗病毒药物，包括干扰素3.3.肝外组织也是肝外组织也是cccDNAcccDNA的储存池？的储存池？肝外组织细胞中肝外组织细胞中HBVHBV标志的存在情况：标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺 等组织或细胞中均检测到等组织或细胞中均检测到HBVHBV的标志物的标志物HBVHBV吸附？暂居？建立感染状态？吸附？暂居？建立感染状态？依据：从上述组织细胞中检测到依据：从上述组织细胞中检测到cccDNAcccDNA，但必须解决检测技术问题但必须解决检测技术问题乙肝病毒cccDNA检测403.肝外组织也是cccDNA的储存池？肝外组织细胞中HBV(2)(2)关于血清中是否存在关于血清中是否存在cccDNAcccDNA的问题的问题 “血清中血清中rcDNArcDNA含量越高，含量越高，cccDNAcccDNA阳性率阳性率 越高和含量越高越高和含量越高”的现象，使我们对方法的现象，使我们对方法 学提出质疑学提出质疑肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放 cccDNA cccDNA入血入血细胞坏死后，细胞坏死后，cccDNAcccDNA释放入血是必然的，释放入血是必然的，但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少 时间？时间？乙肝病毒cccDNA检测41(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题“血清中rcDThank you乙肝病毒cccDNA检测42Thank you乙肝病毒cccDNA检测42