中药制剂检测技术第五章中药制剂的卫生学检查课件

中中药制制剂检测技技术第五章中第五章中药制制剂的的卫生学生学检查中药制剂检测技术第五章中药制剂的卫生学检查中药制剂检测技术第11.各种非规定灭菌制剂应进行微生物限度检查法；2.无菌制剂应依法进行无菌检查；3.静脉滴注用注射剂应进行无菌、热原及细菌内毒素检查中国药典中国药典规定：规定：1.各种非规定灭菌制剂应进行微生物限度检查法；第五章 中药制一、基本知识一、基本知识 （一）基本概念 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。非规定灭菌制剂主要指口服制剂、一般外用制剂。（二）检查项目 1染菌量（细菌数、霉菌数及酵母菌数）2控制菌检查（包括大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌以及白色念珠菌等）一、基本知识 （一）基本概念（二）检查项目第一节 微生二、微生物限度检验原则二、微生物限度检验原则（一）环境（一）环境 1洁净度1万级以下局部100级的单向流空气区域内进行；2检验过程严格无菌操作；3严防第二次污染。中国药品生产洁净级别有哪些？其标准要求是什么？课堂互动课堂互动二、微生物限度检验原则第一节 微生物限度检查法（一）环境课堂 （二）供试品抽样、保存及检验量（二）供试品抽样、保存及检验量 按批号随机抽样，抽样量为检验用量的3倍。每批抽样应至少含有2个以上最小包装单位。检验量系指每次检验所需的供试品量(g、ml或cm2)。固体和半固体制剂的检验量为10g；液体制剂10ml；膜剂为100cm2(不得少于4片)。贵重药品、微量包装药品的检验量可酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml （二）供试品抽样、保存及检验量第一节 微生物限度检查法（三）供试液制备供试液制备 采用规定的适宜方法制备 1液体供试品：供试品10ml+pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 定容至100ml 混匀 1:10供试液油剂可加入适量无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀；水溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。第一节 微生物限度检查法（三）供试液制备2固体供试品：供试品10g+pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 定容至100ml 混匀 匀浆仪或其他适宜方法 1:10供试液必要时加适量无菌聚山梨酯80，并置45以下水浴适当加温，使供试品分散均匀。第一节 微生物限度检查法2固体供试品：3需用特殊方法制备的供试品非水溶性供试品膜剂供试品肠溶或结肠溶制剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品贴膏剂供试品其制备方法按药典规定操作。第一节 微生物限度检查法3需用特殊方法制备的供试品4.具抑菌活性供试品：采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等消除其抑菌活性。注意：供试液制备若需加温时，应均匀加热，温度不超过45，时间不得超过30分钟。（四）检验条件（四）检验条件 培养温度：细菌及控制菌培养温度为3035，霉菌、酵母菌培养温度为2328。阴性对照：以确定无菌技术的可靠性 阳性对照：检查供试品对控制菌生长有无干扰，培养条件是否适宜第一节 微生物限度检查法4.具抑菌活性供试品：采用培养基稀释三、细菌、霉菌及酵母菌计数三、细菌、霉菌及酵母菌计数（一）计数培养基的适用性检查计数培养基的适用性检查（二）计数方法的验证计数方法的验证（三）检查方法（四）注意事项 三、细菌、霉菌及酵母菌计数第一节 微生物限度检查法（一）计数（一）计数培养基的适用性检查（一）计数培养基的适用性检查基本知识基本知识计数用培养基：营养琼脂、玫瑰红营养琼脂和酵母浸出粉葡萄糖琼脂对照培养基：系指培养基处方特别制备、质量优良的培养基，由中国药品生物制品鉴定所研制及分发。检检查查方方法法：通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价检验用培养基是否符合检验要求。第一节 微生物限度检查法（一）计数培养基的适用性检查基本知识（一）计数培养基的适用性检查（一）计数培养基的适用性检查1.菌种（5种）传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）大肠埃希菌（Escherchia coli）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus）枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)白色念珠菌(Candida albicans)黑曲霉(Aspergillus niger)第一节 微生物限度检查法（一）计数培养基的适用性检查1.菌种（一）计数培养基的适用性检查（一）计数培养基的适用性检查大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌营养琼脂培养基白色念珠菌黑曲霉玫瑰红营养琼脂酵母浸出粉葡萄糖琼脂白色念珠菌第一节 微生物限度检查法（一）计数培养基的适用性检查大肠埃希2.菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养2448小时。上述培养基用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu（“Colony forming units”的缩写，菌落形成单位，代表含有的菌落数）的菌悬液。第一节 微生物限度检查法2.菌液制备2.菌液制备接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养57天，加入35ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。菌液保存制备好的菌液以当天使用为宜。若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。第一节 微生物限度检查法2.菌液制备菌液保存3.适用性检查取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置3035培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2328培养72小时，计数；取白色念珠菌50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2328培养72小时，计数。用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。第一节 微生物限度检查法3.适用性检查4.结果判断同时满足以下两个条件可判定培养基的适用性检查符合规定：菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。第一节 微生物限度检查法4.结果判断菌落形态大小应与对照培（二）计数方法的验证（二）计数方法的验证 1.菌种与菌液的制备 同培养基的适用性检查。2.验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率；可与供试品的细菌，霉菌及酵母菌计数同时进行。第一节 微生物限度检查法（二）计数方法的验证 1.菌种与菌液2.2.验证方法验证方法(1)试验组：1ml最低稀释级供试液+50100cfu试验菌(2)菌液组：测定所加的试验菌数(3)供试品对照组：规定量的供试液(4)稀释剂对照组：稀释液+试验菌（加入了入乳化剂、分散剂及中和剂等除稀释液外的试剂或需薄膜过滤处理时）第一节 微生物限度检查法2.验证方法(1)试验组：1ml最低3.结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于70%。若试验组的菌数回收率均不低于70%，则计数方法可靠；若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，则应消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证第一节 微生物限度检查法3.结果判断（三）检查方法：（三）检查方法：平皿法和薄膜过滤法供试液的稀释倾注培养基培养及计数菌落报告体积：1520ml,倾注平板数：2个及以上细菌3天，霉菌、酵母菌57天取2 3个适宜稀释级，加入1ml至平皿中1.平皿法平皿法 适用于无明显抑菌作用的制剂。注意：平皿法计数时还需做阴性对照，要求均不得有菌生长。第一节 微生物限度检查法（三）检查方法：平皿法和薄膜过滤法供菌数报告规则：菌数报告规则：宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300cfu、霉菌平均菌落数在小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。第一节 微生物限度检查法菌数报告规则：宜选取细菌、酵母菌平均2.2.薄膜过滤法 一般适用于可溶性抑菌制剂供试液稀释过滤冲洗滤膜的菌面朝上贴于相应的培养基培养和计数取出滤膜滤膜：孔径应不大于0.45m，直径一般为50mm；每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总滤过量不宜过大，不得超过1000ml，以免滤膜上的微生物受损伤。操作流程：操作流程：第一节 微生物限度检查法2.薄膜过滤法供试液稀释过滤冲洗滤膜规定：每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告原则：以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数。若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数(每张滤膜滤过1g或1ml供试品)，或以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。阴性对照：取试验用的稀释剂1ml同法操作，作为。阴性对照不得有菌生长。第一节 微生物限度检查法规定：每片滤膜上的菌落数应不超过10（四）注意事项（四）注意事项1.所测菌只包括一群能在上述培养基上生长的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌的菌落总数。2.所有器具必须经严格灭菌。3.在无菌条件下完成操作。4.灭菌的试管及玻璃瓶每次打开和关闭都需用火焰灭菌。5.切忌用手接触标本及已灭菌的器材内部，也勿用口吸、吹。第一节 微生物限度检查法（四）注意事项1.所测菌只包括一群能四、控制菌检查四、控制菌检查 本法包括大肠埃希菌、大肠菌群、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、梭菌以及白色念珠菌的检查。其中，大肠埃希菌、大肠菌群是口服药品的控制菌之一；铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌是外用药品和滴眼剂的控制菌。四、控制菌检查第一节 微生物限度检查法 本法包括大肠埃希（一）控制菌检查用培养基的适用性检查（一）控制菌检查用培养基的适用性检查1.菌种（6种）大肠埃希菌CMCC(B)44102金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094铜绿假单胞菌CMCC(B)10104生孢梭菌CMCC(B)64941白色念珠菌CMCC(F)98001成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。第一节 微生物限度检查法（一）控制菌检查用培养基的适用性检查2.菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养2448小时。接种白色念珠菌的新鲜培养物至马丁肉汤培养基或改良马丁琼脂培养基上，培养2448小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含含菌数为5001000cfu的菌悬液。3.适用性检查项目：促生长能力 抑制能力 指示能力 具体方法参照中国药典2010年版附录。第一节 微生物限度检查法2.菌液制备3.适用性检查项目：（二）控制菌检查方法的验证（二）控制菌检查方法的验证成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。验证方法：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，滤过后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。结果判断：若上述试验中检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；第一节 微生物限度检查法（二）控制菌检查方法的验证成品培养基（三）检查方法（三）检查方法1.大肠埃希菌(Escherichia coli)1:10供试液10ml100ml的胆盐乳糖培养基1824h0.2ml5mlMUG5小时、24小时366nm紫外光灯下有无荧光靛基质试液是否玫瑰红色供试品检查1:10供试液10ml100ml的胆盐乳糖培养基阳性对照1ml 10100cfu大肠埃希菌此后同法操作10ml稀释液100ml的胆盐乳糖培养基阴性对照此后同法操作第一节 微生物限度检查法（三）检查方法1.大肠埃希菌(Es结果判断验证试验划线接种：取胆盐乳糖培养基的培养物接种至曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基，观察革兰氏染色镜检：革兰阴性无芽胞杆菌适宜的鉴定试验：发酵乳糖产酸；IMViC实验反应为+或+。MUG反应靛基质反应判断结果+检出大肠埃希菌未检出大肠埃希菌+需进一步验证+需进一步验证第一节 微生物限度检查法结果判断验证试验MUG反应靛基质反应管1：110供试液1ml管2：1100供试液1ml管3：11000供试液1ml管4：稀释剂1ml4个装有10ml乳糖胆盐发酵培养基管1、2、3、4+1824h无菌生长，或有菌生长但不产酸产气1824h产酸产气判定该管未检出大肠菌群曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂培养基确证实验：乳糖发酵管疑似不产酸产气1824h2.大肠菌群(Coliform)第一节 微生物限度检查法管1：110供试液1ml4个装有各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数N(个/g或ml)或0.1ml或0.01ml或0.001ml103102N10310N10210结果判断与报告：根据大肠菌群的检出管数，按下表报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。代表检出大肠菌群；代表未检出大肠菌群。第一节 微生物限度检查法各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数3.沙门菌(Salmonella)供试品10g或10ml不少于200ml的营养肉汤1824h1ml10ml四硫磺酸钠亮绿培养基1824h胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基1824h麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基1824h1824h三糖铁琼脂培养基第一节 微生物限度检查法3.沙门菌(Salmonella)供溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基判定未检出该菌1:10供试液10ml100ml的胆盐乳糖培养基1824h营养琼脂培养基斜面1824h1824h氧化酶试验+革兰染色镜检绿脓菌素(Pyocyanin)试验阳性或G阳性判定检出该菌阴性或非G适宜的鉴定试验阴性4.铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)第一节 微生物限度检查法溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基判定未检5.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)革兰氏染色+血浆凝固酶试验供试液10ml1824h2472h2472h非G+球菌和血浆凝固酶试验阴性判供试品未检出该菌判供试品未检出该菌100ml的亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养肉汤)卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基营养琼脂培养基无菌落生长有菌落生长第一节 微生物限度检查法5.金黄色葡萄球菌(Staphyl6.梭菌梭菌(Clostridium)含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板革兰氏染色+过氧化氢酶试验2份供试液10ml，其中一份置80保温10分钟后迅速冷却 48h各0.2ml厌氧条件分别接种于100ml梭菌增菌培养基厌氧条件4872h非G+梭菌和过氧化氢酶试验阴性判供试品未检出梭菌无菌落生长判供试品未检出梭菌若有菌落生长第一节 微生物限度检查法6.梭菌(Clostridium)7.白色念珠菌（Candida albicans）念珠菌显色培养基供试液10ml4872h2448h镜检，染色+芽管试验判供试品未检出该菌100ml的沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基无菌落生长有菌落生长判供试品未检出该菌聚山梨酯80-玉米琼脂培养基绿色或翠绿色无绿色或翠绿色第一节 微生物限度检查法7.白色念珠菌（Candida a控制菌控制菌检验试剂检验试剂阳性判断阳性判断验证用试剂或试验验证用试剂或试验大肠埃希菌MUG试液靛基质试液荧光玫瑰红色曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂、乳糖发酵管大肠菌群乳糖胆盐发酵管产酸产气沙门菌胆盐硫乳琼脂麦康凯琼脂菌落中心黑色三糖铁琼脂铜绿假单胞菌乳糖胆盐培养基溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基氧化酶试验灰白色，周围时有蓝绿色素扩散PDP琼脂培养基金黄色葡萄球菌亚碲酸钠(钾)卵黄氯化钠琼脂金黄色血浆凝固酶试验梭菌梭菌增菌培养基混浊、产气过氧化氢酶试验白色念珠菌沙氏葡萄糖沙氏葡萄糖琼脂念珠菌显色培养基乳白色，表面光滑有浓酵母气味绿色或翠绿色芽管试验总结总结控制菌检验试剂阳性判断验证用试剂或试验大肠埃希菌MUG试液荧（四）结果判断（四）结果判断供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，单独复试两次，以3次结果的平均值报告均数。供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数、控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定。若其中一项不符合该品种项下的归定，判供试品不符合规定。第一节 微生物限度检查法（四）结果判断供试品检出控制菌或其他五、微生物限度标准五、微生物限度标准口服给药制剂不得检出大肠埃希菌。局部给药制剂不得检出控制菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。鼻及呼吸道吸入给药制剂还不得检出大肠埃希菌，阴道、尿道给药制剂还不得检出梭菌和白色念珠菌。含动物组织(包括脏器提取物)及动物类原药材粉(蜂蜜、王浆、动物角、阿胶除外)的口服给药制剂 每10g或10ml不得检出沙门菌。霉变、长螨者 以不合格论。五、微生物限度标准第一节 微生物限度检查法口服给药制剂不得检一、基本知识一、基本知识 （一）基本概念 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。（二）检查对象 各类注射剂、吸入粉雾剂、眼用制剂、可吸收的止血剂、用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂等一、基本知识 （一）基本概念（二）检查对象第二节 无菌二、无菌检查的人员与环境二、无菌检查的人员与环境无菌检查的人员：无菌检查的人员：具备微生物专业知识，并经无菌技术培训。无菌检查环境：无菌检查环境：环境洁净度为10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统无菌检查要求：无菌检查要求：全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。日常检验还需对试验环境进行监控。二、无菌检查的人员与环境第二节 无菌检查法无菌检查的人员：具三、培养基的制备与检查三、培养基的制备与检查1培养基的种类及制备 无菌检查用培养基主要有硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌氧菌）、改良马丁培养基（用于培养真菌）、选择性培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、0.5%葡萄糖肉汤培养基和改良马丁琼脂培养基。其制备的处方、方法按药典规定执行。制备好的培养基应保存在225、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。2培养基的适用性检查 无论是市售的脱水培养基或配制的培养基，其无菌性检查及灵敏度检查应符合药典规定。三、培养基的制备与检查第二节 无菌检查法1培养基的种类及制四、稀释液、冲洗液及其制备四、稀释液、冲洗液及其制备 常用的稀释液、冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液，其制备方法按药典规定执行。稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中合剂等。五、方法验证（略）五、方法验证（略）四、稀释液、冲洗液及其制备第二节 无菌检查法 常用的六六、供试品的无菌检查供试品的无菌检查1检验数量 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表511规定；上市产品监督检验按表512、表513规定。表中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作为阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。六、供试品的无菌检查第二节 无菌检查法1检验数量2检验量是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表512、表513规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。第二节 无菌检查法2检验量3阳性对照阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌，选择方法可以见下表。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养4872小时应生长良好。不同特性的供试品阳性对照菌无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主金黄色葡萄球菌抗革兰氏阴性菌为主大肠埃希菌抗厌氧菌的供试品生孢梭菌抗真菌的供试品白色念珠菌第二节 无菌检查法3阳性对照不同特性的供试品阳性对照菌无抑4阴性对照阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释剂，冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。中国药典的“无菌检查法”有直接接种法和薄膜滤过法两种。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。第二节 无菌检查法4阴性对照5供试品处理及接种培养基：薄膜过滤法和直接接种法反复使用全封闭式薄膜过滤器薄膜过滤器（三联不带泵）第二节 无菌检查法5供试品处理及接种培养基：薄膜过滤法和直开放式薄膜过滤法操作第二节 无菌检查法开放式薄膜过滤法操作第二节 无菌检查法直接接种法图示第二节 无菌检查法直接接种法图示6 6培养及观察培养及观察培养基按规定的温度，培养14日逐日观察并记录新鲜培养物或划线接种培养培养液涂片，染色，镜检判断是否有菌浑浊第二节 无菌检查法6培养及观察培按规定的温度，培养14日逐七、无菌结果判断七、无菌结果判断供试品符合规定供试品不符合规定供试品均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长七、无菌结果判断第二节 无菌检查法供试品符合规定供试品供试品当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：u（1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；u（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。u（3）阴性对照管有菌生长；u（4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。u试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。第二节 无菌检查法当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无 （一）基本概念 热原(pyrogen)系指药品中含有的能引起体温升高的杂质，主要为细菌性热原。方法：家兔检查法，即将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限量是否符合规定。（二）检查对象 供静脉滴注用的注射剂以及容易感染热原的品种。一、基本知识一、基本知识 （一）基本概念（二）检查对象第三节 热原检查法一、基本知3只兔：0.5小时测1次，共6次，最高-最低升高的温度结果：均升高在0.6以下且升高的总数在1.3以下认为符合规定家兔检查法家兔检查法第三节 热原检查法3只兔：0.5小时测1次，共6次，最高-最 （一）基本概念 细菌内毒素检查法系指利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。（二）检查方法 即凝胶法和光度测定法。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。是中国药典的“仲裁”方法。一、基本知识一、基本知识 （一）基本概念（二）检查方法第四节 细菌内毒素检查法一二、仪器和试剂二、仪器和试剂（一）仪器和试剂（一）仪器和试剂 371恒温水浴或适宜的恒温器具、超净工作台、漩涡混合器、内毒素工作标准品、加样器、鲎试剂、鲎试验用水、pH调节剂等。鲎试剂漩涡混合器加样器第四节 细菌内毒素检查法二、仪器和试剂（一）仪器和试剂鲎试剂器具要求：凡与供试品或试剂直接接触的器具必须经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250、30分钟以上)去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。（二）仪器和试剂的相关要求（二）仪器和试剂的相关要求鲎试验用水：药典规定 凝胶法：内毒素含量小于0.015EUml 光度侧定法：内毒素含量小于0.005EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。第四节 细菌内毒素检查法器具要求：凡与供试品或试剂直接接触的 细菌内毒素国家标准品：系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试 验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。第四节 细菌内毒素检查法 细菌内毒素国家标准品：内毒素工作标三、测定方法三、测定方法供试品限值确定最大有效稀释倍数（MVD）确定供试品干扰实验正式实验结果判断实验流程实验流程第四节 细菌内毒素检查法三、测定方法供试品限值确定最大有效稀供试品内毒素检查：凝胶限度试验供试品内毒素检查：凝胶限度试验编号内毒素浓度被加入内毒素的溶液平行管数A无供试品溶液2B2供试品溶液2C2检查用水2D无检查用水2A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml)。第四节 细菌内毒素检查法供试品内毒素检查：凝胶限度试验编号内1溶液制备溶液制备（1）供试品溶液制备：用细菌内毒素检查用水将供试品配成对应的MVD的浓度A。（2）供试品阳性对照液的制备：用被测供试品溶液A将细菌内毒素工作标准品制成2浓度的内毒素溶液B。（3）阳性对照液的制备：用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品制成2浓度的内毒素溶液C。（4）阴性对照液：细菌内毒素检查用水D第四节 细菌内毒素检查法1溶液制备 MVD的确定和2浓度的细菌内毒素溶液的制备。最大有效稀释倍数（MVD）是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。MVD=cL/式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg 或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=/L；为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）难点释疑难点释疑第四节 细菌内毒素检查法难点释疑例：某葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml，则最大稀释倍数MVD=cL/=0.5/0.125=4，即可将样品稀释4倍，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。难点释疑难点释疑第四节 细菌内毒素检查法难点释疑0.5EU/ml1.0ml为10000EU/ml1000EU/ml0.2ml1.8ml100EU/ml0.2ml1.8ml10EU/ml0.2ml1.8ml1EU/ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.25EU/ml0.2ml1.8ml 则在本例中2浓度的细菌内毒素溶液为0.25EU/ml，若细菌内毒素工作标准品的规格为10000EU/ml，其制备过程可以为下图：难点释疑难点释疑第四节 细菌内毒素检查法0.5EU/ml1.0ml为10002.加样反应加样反应 取装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm75mm试管8支，2支加入0.1ml供试品溶液作为供试品管 2支加入0.1ml 供试品阳性对照液作为供试品阳性对照管。2支加入0.1ml 阳性对照液作为阳性对照管 2支加入0.1ml阴性对照液作为阴性对照管。第四节 细菌内毒素检查法2.加样反应 将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入371的恒温器中，保温602分钟后，将试管取出，缓缓倒转180，若管内凝胶不变形，不从管壁脱落为阳性(+)，凝胶不能保持完整并从管壁脱落为阴性(-)。第四节 细菌内毒素检查法 将试管轻轻混匀后，封闭管3.结果判断结果判断 观察结果时，若2支供试品阳性对照管和2支阳性对照管均为（+），2支阴性对照管均为()，试验有效，否则试验无效；若2支供试品管均为()，判定供试品符合规定；若均为（+），判定供试品不符合规定；若2支供试品管中1支为(+)，1支为()，则另取4支复试，4支中有1支为(+)即认为不合格。第四节 细菌内毒素检查法3.结果判断 四、注意事项四、注意事项1防止鲎试验用水被污染；2开启内毒素标准品和鲎试剂时，要将粘附在安瓿瓶上的粉末尽可能弹落下去。用砂轮划过安瓿后，要用酒精棉（最好能用沾异丙醇的无纺布，以避免产生假阳性结果）擦拭，防止开启时玻璃屑落入安瓿内。开启内毒素标准品时，要在安瓿曲颈上部，并尽可能保留较长的安瓿颈，准确加入1.0ml鲎试验用水复溶。第四节 细菌内毒素检查法四、注意事项1防止鲎试验用水被污染3细菌内毒素要充分混合均匀，内毒素工作标准品溶解后要在漩涡混合器混合15分钟，以后的每一步稀释前至少混合30秒钟。4保温和拿取试管过程中应避免受到振动造成假阴性结果。5对灵敏度标示值的误解：如=0.06EU/ml,实际上表示的灵敏度=0.0625EU/ml，这样写是为了简便，稀释过程中务必要按照=0.0625EU/ml来稀释，否则，会影响实验结果。第四节 细菌内毒素检查法3细菌内毒素要充分混合均匀，内毒素谢谢观赏！2020/11/574谢谢观赏！2020/11/574