FACSCanto流式细胞仪原理课件

BD公司介绍nBD公司是由是由Maxwell W.Becton和和Fairleigh S.Dickinson 于于1897年在纽约创立的年在纽约创立的,总部位于美国新泽西州BD公司介绍BD公司是由Maxwell W.Becton和1BD公司介绍n位居财富周刊500强的大型跨国公司n产品涵盖诸多医疗领域n生物科学部:流式细胞仪及应用于生物科学的试剂、耗材BD公司介绍位居财富周刊500强的大型跨国公司2BD公司流式细胞仪产品nFACS Vantage SE-大型分选机nFACS Aria-高速分选的台式机nFACS Diva-高速分选的数字化大型机BD公司流式细胞仪产品FACS Vantage SE-大型分3BD公司流式细胞仪产品FACSCount流式细胞仪FACSCalibur流式细胞仪FACSCanto II流式细胞仪BD公司流式细胞仪产品FACSCount流式细胞仪FACSC4BD 公司流式细胞仪产品nBD FACSCanto II流式细胞仪BD 公司流式细胞仪产品BD FACSCanto II流式细5FACSCanto II流式细胞仪原理FACSCanto II流式细胞仪原理6流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标?n细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC）n细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向散射光信号，SSC）n相关的荧光强度流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标?细胞的相对大小（前向7散射光信号的特征nFSC和SSCn当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。n488nm激光激发产生散射光散射光信号的特征FSC和SSC8前向角散射光信号前向角散射光信号FSC前向角散射光信号FSC9侧向角散射光信号侧向角散射光信号SSC侧向角散射光信号SSC10散射光信号的特征n红细胞裂解的全血散射光信号的特征红细胞裂解的全血11荧光信号的特征n什么是荧光信号n当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。荧光信号的特征什么是荧光信号12荧光信号的特征n发射光的荧光强度与结合的位点成正比荧光信号的特征发射光的荧光强度与结合的位点成正比13信号产生n荧光信号信号产生荧光信号14荧光信号的特征n常见荧光染料的发射波长荧光信号的特征常见荧光染料的发射波长15直方图显示荧光信号直方图显示荧光信号16点图显示荧光信号点图显示荧光信号17流式细胞仪特点及检测标本n特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；n可检测的样本种类多样n(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞n(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液流式细胞仪特点及检测标本19FACSCanto II流式细胞仪系统组成n流式细胞仪n液流车n工作站FACSCanto II流式细胞仪系统组成流式细胞仪20FACSCanto简介n配置空冷激光n两根激光:488nm、633nm、n光路固定，无需调校n液流系统n信号检测系统n八角形和三角形光学收集系统，将光信号转换成电信号n电子系统将电信号转换成数字化信号FACSCanto简介配置空冷激光21液流系统n流动室n鞘液n工作液，可选PBS、血球稀释液或蒸馏水。n样本流n单细胞悬液，浓度51051 106/mL液流系统流动室22液流系统n鞘液是压力驱动的。在压力作用下，鞘液经过滤器进入流动室下部的小室中。n检测的样本在压力的作用下，也进入流动室下部的小室中，样本压力略大于鞘液的压力。n在鞘液的包裹下，样本由下向上通过流动室，经激光激发后，样本中的颗粒被检测。液流系统鞘液是压力驱动的。在压力作用下，鞘液经过滤器进入流动23液流系统 -FLOW CELL(流动室)Injector Tip荧光信号聚焦的激光光束鞘液鞘液液流系统 -FLOW CELL(流动室)Injec24液流系统液流系统25液流系统-样本流速液流系统-样本流速26样本流速的选择n高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.n低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。样本流速的选择高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度27光学系统光学系统28光学系统n染色的细胞或其他颗粒通过聚焦的激光束时，会散射激光或荧光。因为激光束是一个小斑点，颗粒快速通过流动室，散射光或荧光持续的时间非常短-只有几微秒。这些短暂的光信号被收集、过滤然后被检测器转换成电信号。光学系统染色的细胞或其他颗粒通过聚焦的激光束时，会散射激光或29信号采集系统n激光n488nm，633nm，n激发样本中的颗粒或细胞产生散射光信号和荧光信号n信号检测组件-八角形和三角形n光学滤片n将激光激发后产生的散射光信号和荧光信号引导至相应的PMTnPMT-将光信号转换成电信号信号采集系统激光30常用荧光染料的特性常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1)488 575 免疫荧光 橙色 PerCP 488 670 免疫荧光 深红APC 633 670 免疫荧光 红色PI 488 620 DNA染色 橙红ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长(nm)发31 常用荧光染料(488nm,633nm激发)nFluorescein Isothiocyanate(FITC)n异硫氰酸荧光素nPhycoerythrin(PE)n藻红素nAllophycocyanin(APC)n异藻蓝蛋白nPeridinin-Chlorophyll Protein(PerCP)n多甲藻黄素-叶绿素蛋白nTandem DyesnPE-Texas Red(ECD)nPE-Cy5(PC5)nPE-Cy5.5(PC5.5)(futures)nPE-Cy7(PC7)(futures)常用荧光染料(488nm,633nm激发)Fluoresc32FACSCanto信号检测组件n种类n八角形n三角形n构成n检测器n滤片FACSCanto信号检测组件种类33FACSCanto信号检测组件n八角形检测组件FACSCanto信号检测组件八角形检测组件34FACSCanto信号检测组件n三角形检测组件FACSCanto信号检测组件三角形检测组件35FACSCanto信号检测组件n检测器n鞘液流中的颗粒通过激光束时会产生光信号，光信号到达检测器生成电脉冲信号，电子系统对电脉冲信号进一步处理。nFACSCanto 两类检测器n光电二极管：FSCn光电倍增管PMT：SSC和荧光信号FACSCanto信号检测组件检测器36FACSCanto信号检测组件n光学滤片用于调整光谱的分布。n当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。FACSCanto信号检测组件光学滤片用于调整光谱的分布。37FACSCanto的滤片n长通滤片（LP）：长于设定波长的光通过，并反射短于设定波长的光FACSCanto的滤片长通滤片（LP）：长于设定波长的光38FACSCanto的滤片n带通滤片：允许一定带宽波长的光通过。FACSCanto的滤片带通滤片：允许一定带宽波长的光通过39FACSCanto的滤片FACSCanto的滤片40FACSCanto的滤片FACSCanto的滤片41FACSCanto电子系统n将与电脉冲信号 强弱相关的电压 数字化n有三类电脉冲信号n高度信号Hn面积信号An宽度信号WFACSCanto电子系统将与电脉冲信号42几个概念n信号放大nPMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变。n阈值n信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。几个概念信号放大43几个概念n颜色补偿n采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。几个概念颜色补偿44颜色补偿nFITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会进入PE检测器颜色补偿FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会进入45几个概念n颜色补偿n带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。几个概念颜色补偿46几个概念n颜色补偿n通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%几个概念颜色补偿47补偿模型图补偿模型图补偿模型图48颜色补偿判断标准 n未作颜色补偿颜色补偿判断标准 未作颜色补偿49颜色补偿判断标准 n补偿后颜色补偿判断标准 补偿后50怎样进行颜色补偿nComp Beadsn用于流式细胞仪多色分析时调整荧光补偿。含两种微球，抗小鼠/大鼠免疫球蛋白链的微球，可与小鼠/大鼠免疫球蛋白的链结合；及阴性对照微球，不与免疫球蛋白结合。这两种微球与鼠源性的荧光抗体混合时，显示为清晰的阳性群与阴性群（背景荧光），可据此手动调整颜色补偿。nAnti-Mouse Ig补偿微球组合，产品号：552843nAnti-Rat Ig补偿微球组合，产品号：552844nAnti-Rat/hamsterIg补偿微球组合，产品号：552845怎样进行颜色补偿Comp Beads51仪器运作需要的质控品n仪器校准需要微球nBD FACS 7-Color Setup Beads（Cat No.335775）n补偿调整需要微球nBD CompBeads Anti-Mouse Ig,(Cat No.552843)nBD CompBeads Anti-Rat Ig,(Cat No.552844)n仪器清洁nBD FACSRinsen漂白水仪器运作需要的质控品仪器校准需要微球52流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用53流式细胞仪可以告诉我们什么？流式细胞仪可以告诉我们什么？54细胞内和细胞外发生了什么事件？细胞内和细胞外发生了什么事件？55流式细胞术的应用n细胞生理学研究n细胞膜表面标记n胞内标记n细胞周期分析n凋亡分析n分选nCBA流式细胞术的应用细胞生理学研究56细胞生理学研究n细胞相对大小和颗粒性n胞内pH值检测nCa+流动性检测n膜电势检测n细胞活性检测n细胞活力(增殖能力)的检测细胞生理学研究细胞相对大小和颗粒性57细胞生理学研究n细胞相对大小和颗粒性分析细胞生理学研究细胞相对大小和颗粒性分析58细胞生理学研究n胞内pH值的检测细胞生理学研究胞内pH值的检测59细胞生理学研究nCa2+流动性检测nCa2+是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。n最常用的染料nIndo-1 excited at UVnFluo-3 excited at 488nmnFura red excited at 488nm细胞生理学研究Ca2+流动性检测60细胞生理学研究nCa2+流动性检测细胞生理学研究Ca2+流动性检测61细胞生理学研究n细胞膜电位的改变n超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少。n染料和试剂nDiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)Valinomycin Gramicidin D CCCP细胞生理学研究细胞膜电位的改变62细胞生理学研究n细胞膜电位的改变细胞生理学研究细胞膜电位的改变63细胞生理学研究n细胞活性分析 Fluorescein Diacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光细胞生理学研究细胞活性分析64细胞生理学研究n细胞活力分析nCFSE(Carboxyfluorescein Succinimidyl ester)是一种亲脂性染料，可被细胞膜吸收。细胞标记CFSE后再诱导增殖，分裂后的细胞将含半量的CFSE，如此可监控细胞分裂的数目。细胞生理学研究细胞活力分析65细胞生理学研究n细胞活力分析n上图中人T细胞被标记并刺激后，可跟踪六代的分裂。如果配合使用Modfit软件分析，可确定每代的细胞数。细胞生理学研究细胞活力分析66细胞膜表面标记细胞膜表面标记CD2CD2CD4CD4CD#=clusterdesignationnumber细胞膜表面标记CD2CD4CD#=cluster d67细胞内标记 胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cyclooxygenase.n胞内细胞因子n磷酸化蛋白 细胞内标记 胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球68细胞内标记n胞内细胞因子细胞内标记胞内细胞因子69细胞内标记n磷酸化蛋白n接受刺激后细胞的动态反应n刺激因子对特异位点的作用n检测转录后调控n特殊蛋白在正常及异常细胞的表达细胞内标记磷酸化蛋白70细胞内标记n磷酸化蛋白RelativeCellNumberAlexaFluor488ControlIFN-g gstimulated(1000u/ml)细胞内标记磷酸化蛋白Relative Cell Number71细胞周期分析nDNA含量分析-PI染色细胞周期分析DNA含量分析-PI染色72细胞周期分析nDNA含量分析细胞周期分析DNA含量分析73细胞凋亡n细胞膜分析-PS外翻 PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合细胞凋亡细胞膜分析-PS外翻74CBA（Cytometric Bead Array）+Analyte of InterestFluorescent Detector AbCapture BeadCapture AbCBA（Cytometric Bead Array）+An75CBACBA76BD网站n更多的产品信息请登陆 bdbiosciencesBD网站更多的产品信息请登陆77谢谢大家谢谢大家78谢谢！谢谢！79谢谢！798080