微生物细胞破碎2 4全解课件

2024/6/17生物分离过程的一般流程本节内容2023/8/9生物分离过程的一般流程本节内容12024/6/17微生物微生物细胞破碎细胞破碎cell disruption第一节第一节 细胞壁的组成细胞壁的组成 与结构与结构第二节第二节 常用破碎方法常用破碎方法第三节第三节 破碎率测定破碎率测定 第四节第四节 包涵体的纯化包涵体的纯化 方法方法2023/8/9微生物第一节 细胞壁的组成 22024/6/17知识点：知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。胞的破碎技术，破碎率的测定。重点：重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。生产情况予以合理的选择。难点：难点：常用破碎方法的合理选用。常用破碎方法的合理选用。2023/8/9知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎32024/6/17概 述(目的和意义)细胞破碎（细胞破碎（cell rupturecell rupture）是是指利用外力破坏细胞膜指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。解各种微生物细胞壁的组成和结构。2023/8/9概 述(目的和意义)细胞破碎（cell r42024/6/17第一节 细胞壁的组成与结构 不同细胞壁的结构和组成不完全相同不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细，故细胞壁的机械强度不同，胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也细胞破碎的难易程度也就不同。就不同。2023/8/9第一节 细胞壁的组成与结构 不同细52024/6/171、细菌细胞壁结构细菌的细胞壁都是由肽细菌的细胞壁都是由肽聚糖、胞壁酸、蛋白质、聚糖、胞壁酸、蛋白质、脂多糖等组成；脂多糖等组成；相邻聚糖链上的短肽又相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包壁的三维网状结构，包围在细胞周围。围在细胞周围。2023/8/91、细菌细胞壁结构细菌的细胞壁都是由肽聚糖、62024/6/17u破碎细菌的主要阻力是来自于破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存其网状结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的在的肽键的数量肽键的数量和和交联的程度交联的程度。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。不同。u革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌典典型型的的生生物物是是大大肠肠杆杆菌菌，通通过过这这种种细细胞生产了很多细胞重组的产物。胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称药物名称宿主宿主用途用途胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素人生长激素大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病-干扰素干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等治疗毛状细胞白血病等2023/8/9破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，72024/6/17 2 2、酵母细胞壁结构、酵母细胞壁结构u最最里里层层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细细纤纤维维组组成成，它它构构成成了了细细胞胞壁壁的的刚刚性性骨骨架架，使使细胞具有一定的形状；细胞具有一定的形状；u中间一层是糖蛋白；中间一层是糖蛋白；u最最外外层层是是甘甘露露聚聚糖糖，由由1,6-1,6-磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接成成网网状状。在在该该层层的的内内部，有甘露聚糖部，有甘露聚糖-酶的复合物；酶的复合物；u破破碎碎酵酵母母细细胞胞壁壁的的阻阻力力主主要要决决定定于于壁壁结结构构交交联联的的紧紧密密程程度度和和它它的的厚度。厚度。2023/8/9 2、酵母细胞壁结构最里层是由葡聚糖的细纤维82024/6/173 3、真菌、真菌细胞壁细胞壁l真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。较少量的蛋白质和脂类。l不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由多数真菌的多糖壁是由几丁质几丁质和和葡聚糖葡聚糖构成，少数构成，少数含纤维素。含纤维素。l与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，而且它还含有几丁质或纤聚合物的网状结构有关，而且它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。维素的纤维状结构，所以强度有所提高。2023/8/93、真菌细胞壁真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组92024/6/17l红红面面包包霉霉菌菌细细胞胞壁壁具具有有同同心心圆圆层层状结构主要存在三种聚合物状结构主要存在三种聚合物l最最外外层层(a)(a)是是-和和-葡葡聚聚糖糖的的混合物，混合物，l第第2 2层层(b)(b)是糖蛋白的网状结构是糖蛋白的网状结构l第第3 3层层(c)(c)主要是蛋白质，主要是蛋白质，l最内层最内层(d)(d)主要是几丁质。主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图2023/8/9红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三104、植物细胞壁、植物细胞壁构架物质：纤维素构架物质：纤维素基质：果胶基质：果胶典型结构：典型结构：胞间层胞间层 初生壁初生壁 次生壁次生壁4、植物细胞壁构架物质：纤维素112024/6/17微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-100-250nm250nm主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-(5-10%)10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-(11-22%)22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-(30-40%)40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-(80-90%)90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构2023/8/9微生物革兰氏革兰氏酵母菌真菌壁厚20-80 122024/6/17第二节 细胞破碎技术2023/8/9第二节 细胞破碎技术132024/6/17机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法超声法超声法 物理破碎物理破碎温差破碎法温差破碎法压差破碎法压差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂有机溶剂表面活性表面活性剂剂酸碱酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制外加酶制剂法剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构使组织、细胞的外层结构破坏破坏通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏细胞外层结构受到破坏细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理2023/8/9机械破碎捣碎法物理破碎温差破碎法化学破碎有机142024/6/17一、机械法一、机械法高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogenizationhomogenization）珠磨破碎法（珠磨破碎法（bead grindingbead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultrasonication）2023/8/9一、机械法高压匀浆破碎法（homogeniz152024/6/17采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）1、高压匀浆法高压匀浆法（High-pressure homogenization）细胞悬浮液自高压室细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。高速向从出口管流出。高速剪切剪切、碰撞碰撞及及压力骤降压力骤降，造成细胞破碎。造成细胞破碎。2023/8/9采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）1、高162024/6/17高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多高压匀浆器的种类较多：pWAB公司的公司的AVP Gaulin 31MR型型pBran and luebbe 公司公司SHL40型型p意大利意大利Niro Soavi高压匀浆机高压匀浆机2023/8/9高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多：高压匀172024/6/17高压匀浆法使用时注意事项u高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的操作温度上升约-/10MPa/10MPa为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在温度，使出口温度调节在2020左右。左右。u可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。式。2023/8/9高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆器的操作温度182024/6/17高压匀浆法适用的范围（大规模细胞破碎的常用方法）（大规模细胞破碎的常用方法）适用范围适用范围 酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用不宜使用 易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）2023/8/9高压匀浆法适用的范围（大规模细胞破碎的常用方192024/6/17l压力压力压力增加可减少细胞的循环次数，最好一次通过就可完压力增加可减少细胞的循环次数，最好一次通过就可完全的破碎。全的破碎。但但p p大到一定值时对匀浆器的磨损增加。大到一定值时对匀浆器的磨损增加。工业生产中，通常采用的压力为工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l菌体种类和生长环境菌体种类和生长环境大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养 基上容易破碎。基上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素2023/8/9压力影响高压匀浆器细胞破碎因素202024/6/172 2）珠磨法）珠磨法 bead millbead mill 细胞悬浮液与极细的玻璃细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于磨剂（直径小于1mm1mm）一起快）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相子与细胞之间的互相剪切、剪切、碰撞碰撞，使细胞破碎，释放出，使细胞破碎，释放出内含物。内含物。WSK卧式高效全能珠磨机卧式高效全能珠磨机2023/8/92）珠磨法 bead mill 细胞212024/6/173 3）超声波破碎）超声波破碎（Ultrasonication)l利用超声波振荡器发射的利用超声波振荡器发射的15-25kHz15-25kHz超声波处理细胞悬浮液。超声波处理细胞悬浮液。l在超声波作用下液体发生在超声波作用下液体发生空化作用空化作用,液体中局部空穴的形成、液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力,引起的粘滞性旋涡引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。细胞破碎。2023/8/93）超声波破碎（Ultrasonicatio222024/6/17JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机(超声波振荡器以可分为超声波振荡器以可分为槽式槽式和和探头直接插入探头直接插入介质两种类介质两种类型，一般破碎效果后者比前者好。型，一般破碎效果后者比前者好。(破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。(操作过程产生大量的热，操作需在冰水或外部冷却的容操作过程产生大量的热，操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。器中进行。2023/8/9JY92-II D超声波超声波振荡器以可分为232024/6/17适用范围适用范围杆菌比球菌易破碎，杆菌比球菌易破碎，G-G-细菌比细菌比G+G+细菌易破碎，对细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。酵母菌的效果较差。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低。超声波破碎的有效能量利用率极低。由于对冷却的要求相当苛刻，且大规模操作中声由于对冷却的要求相当苛刻，且大规模操作中声能传递和散热有困难，不易放大，但能传递和散热有困难，不易放大，但在实验室小在实验室小在实验室小在实验室小规模细胞破碎中常用规模细胞破碎中常用规模细胞破碎中常用规模细胞破碎中常用。2023/8/9适用范围杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌242024/6/17技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过的小孔，须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而使细胞受到剪切力而破碎破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液大规模细胞悬浮液大规模处理处理珠磨破碎珠磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁珠细胞被玻璃珠或铁珠捣碎捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞的大规模处理超声波法超声波法用超声波的空穴作用用超声波的空穴作用使细胞破碎使细胞破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液小规模细胞悬浮液小规模处理处理研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中 便宜便宜不同机械破碎方法的比较2023/8/9技术原理效果成本举例匀浆法(孔型)须使细胞通252024/6/17二、非机械破碎方法二、非机械破碎方法酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme lysisenzyme lysis）化学破碎法（化学破碎法（chemical treatmentchemical treatment）渗透压冲击破碎法（渗透压冲击破碎法（osmotic shockosmotic shock）冻融破碎法（冻融破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）其中酶法和化学法溶胞应用最广其中酶法和化学法溶胞应用最广。酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme lysisenzyme lysis）化学破碎法（化学破碎法（chemical treatmentchemical treatment）渗透压冲击破碎法（渗透压冲击破碎法（osmotic shockosmotic shock）冻融破碎法（冻融破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）其中酶法和化学法溶胞应用最广其中酶法和化学法溶胞应用最广。酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme lysisenzyme lysis）化学破碎法（化学破碎法（chemical treatmentchemical treatment）渗透压冲击破碎法（渗透压冲击破碎法（osmotic shockosmotic shock）冻融破碎法（冻融破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）2023/8/9二、非机械破碎方法酶溶破碎法（enzyme 262024/6/171 1、酶解（酶溶法、酶解（酶溶法 Enymatic lysis)Enymatic lysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。法破坏细胞膜。1 1）外加酶法）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1-1，3-3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1-1，6-6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等2023/8/91、酶解（酶溶法 Enymatic lysi272024/6/17外加酶法外加酶法酶解法的特点是专一性强，必须根据细胞的结酶解法的特点是专一性强，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。构和化学组成来选择。l溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能专一性地分解细胞壁上能专一性地分解细胞壁上肽聚糖肽聚糖分子的分子的-1,4-1,4糖苷键，主要用于细菌类糖苷键，主要用于细菌类细胞壁的裂解。细胞壁的裂解。2023/8/9外加酶法酶解法的特点是专一性强，必须根据细胞282024/6/17放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，可采用溶菌酶。主要成分，可采用溶菌酶。酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。纤维素酶裂解。2023/8/9放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚292024/6/172)2)酶解酶解-自溶作用自溶作用 l自溶作用是利用自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶需外加其他的酶。l改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。l缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。液粘度增大，过滤速度下降。2023/8/92)酶解-自溶作用 自溶作用是利用生物体自身302024/6/17酶解法的特点酶解法的特点 优点优点u发生酶解的条件温和u能选择性地释放产物u胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点缺点u溶酶价格高u溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)u产物抑制的存在 2023/8/9酶解法的特点 优点312024/6/17 有选择性的加入某些化学试剂，可以有选择性的加入某些化学试剂，可以改变细胞改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有从而使胞内物质有选择性地渗透出来。选择性地渗透出来。2、化学渗透法化学渗透法（Chemical permeation）取决于化学试剂类型以及细胞壁膜的结构与组成。取决于化学试剂类型以及细胞壁膜的结构与组成。常用化学试剂有机溶常用化学试剂有机溶剂、变性剂、表面活性剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂、抗生素、金属螯合剂等剂等2023/8/9 有选择性的加入某些化学试剂，可以改变322024/6/17酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。成本低，反应激烈，不具选择性。（1）酸、碱处理法）酸、碱处理法2023/8/9酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6m332024/6/17细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型），阴离子型）非离子型如非离子型如Triton X-100和吐温（和吐温（Tween）等）等（2 2）表面活性剂）表面活性剂 无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，也能和脂作用，能与细胞壁上的能与细胞壁上的脂蛋白脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解2023/8/9细胞破碎常用的表面活性剂：（2）表面活性剂 342024/6/17 能分解细胞壁中的能分解细胞壁中的磷脂磷脂，使细胞结构破坏，胞，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等。苯等。（3 3）有机溶剂）有机溶剂（4 4）EDTAEDTA螯合剂螯合剂处理处理G-G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子CaCa2+2+或或MgMg2+2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTAEDTA将将CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合，大量的螯合，大量的脂多糖脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。出现洞穴。2023/8/9 能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，35非极性R基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸 小分子氨基酸静电引力可以渗透过细胞壁中，通过氢键、范德华力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构。（5 5）温和化学渗透剂处理）温和化学渗透剂处理非极性R基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸（5）温和化学渗透剂处理362024/6/17u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%50%；u有些化学试剂有毒；有些化学试剂有毒；u化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。并影响最终产物纯度。化学渗透法特点化学渗透法特点缺点缺点l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。离和进一步提取。优点优点2023/8/9通用性差；化学渗透法特点缺点对产物释放有一定372024/6/173、物理法u渗透压冲击法渗透压冲击法u冻结冻结-融化法融化法u干燥法干燥法2023/8/93、物理法渗透压冲击法382024/6/171 1）渗透压冲击法）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。细胞壁有缺陷，强度减弱。2023/8/91）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破392024/6/172 2）冻结）冻结-融化法融化法将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），），然后在室温中融化，反复多次达到破壁作用；然后在室温中融化，反复多次达到破壁作用；一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂；破裂；适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。2023/8/92）冻结-融化法将细胞放在低温下冷冻（约-1402024/6/17使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质冷冻干燥适用于不稳定的生化物质3 3）干燥法）干燥法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥2023/8/9使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。3412024/6/172023/8/9422024/6/17三、选择破碎方法的依据细胞壁强度和结构细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和高聚物交联程度、种类和壁厚度壁厚度)；细胞处理量；细胞处理量；目标产物对破碎条件的敏感性；目标产物对破碎条件的敏感性；破碎程度；破碎程度；目标产物的选择性释放。目标产物的选择性释放。2023/8/9三、选择破碎方法的依据细胞壁强度和结构(高聚432024/6/17四、选择性释放目标产物的一般原则四、选择性释放目标产物的一般原则 仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围l当目标产物存在于当目标产物存在于细胞膜附近细胞膜附近时，可采用较温和的方法，时，可采用较温和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。l当目标产物存在于当目标产物存在于细胞质内细胞质内时，则需采用强烈的机械破时，则需采用强烈的机械破碎法碎法l当目标产物处于与细胞膜或细胞壁当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合结合的状态时，调节的状态时，调节溶液溶液pHpH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。放。2023/8/9四、选择性释放目标产物的一般原则 仅破坏442024/6/17(2)(2)机械破碎法和化学法并用机械破碎法和化学法并用可使操作条件可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。件下，降低细胞的破碎程度。2023/8/9(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加452024/6/17 讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究 一一.化学法化学法 20%(W/V)大肠杆菌悬浮液大肠杆菌悬浮液+B.A 37搅拌搅拌 高速离心高速离心 测上清液酶活。测上清液酶活。1.处理时间处理时间 R%2.5h2.丁酯用量丁酯用量条件：条件：37，搅拌，搅拌3小时小时适宜的适宜的B.A加量为加量为12%，释放率释放率R=40%12%55%R%12%2.03U/mg比活2023/8/9 讨论题：462024/6/17二二.化学法化学法冻融法结合冻融法结合 加加B.A(12%,37B.A(12%,37搅拌搅拌3h3h）菌悬液菌悬液 冻融冻融(冻结冻结14h14h，融化融化)释放率释放率55%55%；比活；比活2.69 u/mg2.69 u/mg 三三.化学化学超声波振荡法结合超声波振荡法结合 先丁酯处理，再超声波（先丁酯处理，再超声波（9090秒），秒），释放率释放率72%72%，小型设备，小型设备，不能工业大规模生产。不能工业大规模生产。四四.高压匀浆法高压匀浆法 20%(W/V)20%(W/V)菌悬液，菌悬液，P=50MPaP=50MPa，N=3N=3。释放率释放率R=38.4%R=38.4%，原因原因:细胞破碎后细胞破碎后,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。仍有较多酶吸附在细胞碎片上。2023/8/9二.化学法冻融法结合 472024/6/17五五.高压匀浆高压匀浆化学法结合化学法结合 先高压匀浆，再加先高压匀浆，再加10%10%丁酯，丁酯，3737搅拌搅拌3h3h，高速离，高速离心心(3(3万万rpm)rpm)，释放率释放率：R=75%R=75%2023/8/9五.高压匀浆化学法结合 48第三节第三节 破碎率的测定及破碎技术破碎率的测定及破碎技术 的研究方向的研究方向第三节 破碎率的测定及破碎技术 492024/6/17细细胞胞破破碎碎后后，大大量量带带电电荷荷的的内内含含物物被被释释放放到到水相，使导电率上升。水相，使导电率上升。1)1)直接测定法直接测定法2)2)目的产物测定法目的产物测定法3)3)导电率测定法导电率测定法采用采用染色法区别破碎的细胞与未破碎的细胞染色法区别破碎的细胞与未破碎的细胞如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。色。将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与产物含量或活性，并与100%100%破碎率的标准值比较，破碎率的标准值比较，计算其破碎率。计算其破碎率。一、破碎率的测定一、破碎率的测定2023/8/9细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，502024/6/17二、破碎技术的研究方向二、破碎技术的研究方向1)1)多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa95MPa压压力下匀浆力下匀浆4 4次，总破碎率接近次，总破碎率接近100%100%。而单独采用高压匀。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有浆法，同样条件下破碎率只有32%32%。有机溶剂与冻融法、干燥法结合有机溶剂与冻融法、干燥法结合2023/8/9二、破碎技术的研究方向多种破碎方法相结合化学512024/6/17破碎技术的研究方向 -与上游过程相结合在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂合成的抑制剂(如青霉素如青霉素)，使新生细胞细胞壁有，使新生细胞细胞壁有缺陷，利于破碎；缺陷，利于破碎；选择较易破碎的菌种作为宿主细胞，如革兰氏阴选择较易破碎的菌种作为宿主细胞，如革兰氏阴性细菌；性细菌；用基因工程的方法对菌种进行改造。用基因工程的方法对菌种进行改造。2023/8/9破碎技术的研究方向 -与上游522024/6/17破碎技术研究方向-与下游工程相结合举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶2023/8/9破碎技术研究方向-与下游工程相结合举例：萃532024/6/17（inclusion bodies IBs)第四节 包涵体的纯化胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心,收集液相收集液相浓缩浓缩纯化。纯化。胞内表达：胞内表达：l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心，离心，收集上清收集上清纯化。纯化。l胞内周质表达：离心胞内周质表达：离心,收集菌体收集菌体低浓度溶菌酶或渗透低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物压冲击等溶解目标物离心离心,收集上清液收集上清液纯化。纯化。l不溶性包涵体：离心不溶性包涵体：离心,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心离心,收集收集沉淀沉淀包涵体洗涤包涵体洗涤目标蛋白变性溶解目标蛋白变性溶解复性复性纯化。纯化。2023/8/9（inclusion bodies IBs542024/6/17生物分离过程的一般流程本节内容2023/8/9生物分离过程的一般流程本节内容552024/6/17外源蛋白在大肠杆菌中的积累外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体-丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区-人体干扰素人体干扰素25%25%形成包涵体形成包涵体凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体-内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成包涵体2023/8/9外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白产物占菌体总蛋562024/6/17Z包涵体包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以所以没有生物活性没有生物活性。Z包涵体的形成的原因？包涵体的形成的原因？蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解诱导组分不足，不能形成溶解状态；状态；蛋白质自身不稳定。蛋白质自身不稳定。包涵体的构成2023/8/9包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白572024/6/17收集菌体细胞细胞破碎包涵体包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性 包包涵涵体的出现不仅增加了体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的白质折叠机理研究提出了新的课题。课题。欲获得天然活性态的目标欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。恢复应有的天然活性。2023/8/9基因工程包涵体的纯化方法收集菌体细胞细胞破碎582024/6/171）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。l洗涤的重要性：洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集子而聚集，给后步纯化带来困难。，给后步纯化带来困难。l洗涤剂：洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。去部分膜蛋白和脂质类杂质。l洗涤剂浓度洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。产物为原则。2023/8/91）包涵体的洗涤592024/6/172）目标蛋白的）目标蛋白的变性变性溶解溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。常用变性剂：常用变性剂：5-8 mol/L盐酸胍和盐酸胍和6-8 mol/L尿素尿素 作用：破坏离子间相互作用作用：破坏离子间相互作用 表面活性剂表面活性剂 如如1-2 SDS作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用 PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少的碱溶液和有机溶剂，使用较少影响变性因素：时间、影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和、离子强度、变性剂种类和浓度浓度2023/8/92）目标蛋白的变性溶解 602024/6/17原理：原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。，该过程称复性。复性方法：复性方法：l稀释法除变性剂稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。加入大量水或缓冲液。l膜分离法除变性剂膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。透析、超滤、电渗析。l层析法：凝胶层析，高效疏水层析。层析法：凝胶层析，高效疏水层析。3）目标蛋白的复性目标蛋白的复性2023/8/9原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态612024/6/17 蛋白质复性影响因素蛋白质复性影响因素u变性剂浓度变性剂浓度u目标蛋白浓度；目标蛋白浓度；upH和离子强度；和离子强度；u氧化还原条件。氧化还原条件。还原剂：还原剂：二硫苏糖醇、二硫苏糖醇、-巯基乙醇、还原巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；型谷胱甘肽；氧化剂：氧化剂：氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽;碱性下通空气。碱性下通空气。复性区复性区 多聚物生成区多聚物生成区 絮凝沉淀区絮凝沉淀区盐酸胍浓度盐酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度蛋白质浓度 mol/L2023/8/9 蛋白质复性影响因素盐酸胍浓度mol/L红血622024/6/17包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）2023/8/9包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）632024/6/17作业题作业题1.1.细胞破碎有何意义细胞破碎有何意义?常用的细胞破碎方法有常用的细胞破碎方法有哪些哪些?2.2.在选择细胞破碎方法时需要考虑哪些因素？在选择细胞破碎方法时需要考虑哪些因素？3.3.破碎率的计算方法？破碎率的计算方法？4.4.什么是包涵体？常用哪些试剂溶解包涵体？什么是包涵体？常用哪些试剂溶解包涵体？5.5.目前包涵体复性的方法有哪些？目前包涵体复性的方法有哪些？2023/8/9作业题细胞破碎有何意义?常用的细胞破碎方法有64