应用微生物学药物-课件

1应用微生物学药物内容提要n第一节：微生物药物发酵概况n第二节：微生物药物的分离提取、精制n第三节微生物药物的鉴别2应用微生物学药物一、微生物药物发酵概况n发酵，在生理学上是指微生物无氧呼吸和有氧呼吸以外的一种生物氧化作用。在工业生产中，发酵是利用微生物的机能获得工业产品的泛称。通过微生物的培养，使某种特定的代谢产物得以大量积累，如各种有机酸发酵、维生素发酵、酶制剂发酵、氨基酸发酵、核酸发酵以及抗生素发酵等。目前，全世界的医药产品生产已有一半是由生物合成，抗生素、维生素、激素这三大类药物几乎都是通过微生物发酵而生产的。3应用微生物学药物n发酵工程可以认为是直接利用微生物的机能将物料加工为所需产品的过程。发酵工程是一门新学科，它的内容极为丰富，涉及生物工程学的所有分支，与酶工程、遗传工程和细胞工程共同构成生物工程的四大支柱。无论从微生物中获得酶还是用遗传工程菌获得产品，都必须依赖于发酵工程技术，可见发酵工程的发展直接影响生物工程的进一步发展。4应用微生物学药物n近年来，微生物药物的产量不断增加，品种也在不断扩大，人干扰素、胰岛素、生长激素、乙肝疫苗等大批新型药物已经由基因工程菌发酵生产。随着代谢工程和蛋白质工程的研究进展以及在抗生素、蛋白质及其他生物活性物质发酵工业中的应用，微生物制药工业的水平将进一步提高，成本也将进一步下降。5应用微生物学药物1.次级代谢产物发酵的特点n所用的微生物以“纯种”状态在具有通气搅拌的发酵罐中进行发酵。n发酵过程中初级代谢和次级代谢两种不同的代谢途径交织在一起，有生长期和生产期两个截然不同的生理代谢阶段。次级代谢产物的形成与微生物的生长不同步，当微生物生长速度减低或停止生长后，次级代谢产物才开始合成。6应用微生物学药物n发酵产物积累和基质消耗之间没有明显的化学计量关系。理论产量与实际产量往往相差甚远。n发酵产物极其复杂。通常一种微生物可以发酵产生几个甚至几十个结构类似的副产物，需要经过一系列物理和化学方法对目的产物进行提取分离和精制。7应用微生物学药物n微量的金属离子(Fe2+，Fe3+，Mn2+，Co2+，Ni2+等)和磷酸盐等无机离子对次级代谢产物的形成具有显著影响。n发酵过程更加难以控制发酵过程更加难以控制。即使同一菌种，在同一厂家，也会因生产设备、原料来源等差别，使菌种的生产能力大不相同。8应用微生物学药物2.微生物发酵的操作方式n微生物发酵过程一般有3种操作方式，即分批发酵(间歇发酵)、补料分批发酵(半连续发酵)和连续发酵。发酵所采用的操作方式不同，微生物的代谢变化规律也不同。9应用微生物学药物(1)分批发酵(batchculture)n是在一个密闭的系统内一次性投入有限数量营养物的一种发酵方式。分批发酵的特点在于发酵过程是非恒态的，微生物所处的环境在不断变化，发酵过程中营养成分不断减少，微生物得到相应的生长繁殖。在分批发酵过程中，微生物的生长速度随时间而发生规律性变化，整个发酵过程分为延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期4个阶段。微生物在快速生长阶段形成的代谢产物多为初级代谢产物，而次级代谢产物的合成发生在生长缓慢的稳定期。现代发酵工业中的大多数发酵产品都由此法生产而来。10应用微生物学药物(2)补料分批发酵n补料分批发酵也称半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇地补加有限制性营养物的一种与分批发酵相似的发酵方法。补料分批发酵与传统的分批发酵相比，其优点在于发酵系统中维持较低的基质浓度，以除去快速利用基质的阻遏效应；维持适当的菌体浓度，不至于加剧供氧矛盾；延长次级代谢产物的生产时间；避免培养基中积累某些有毒代谢物，对菌体生长产生抑制。与连续发酵相比，补料分批发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题。补料分批发酵应用十分广泛，包括抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸以及高聚物等，是发酵工业研究的方向之一。11应用微生物学药物(3)连续发酵连续发酵(continuousculture)n是在一个开放的系统内，以一定的速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和代身产物的培养液以相同的速度从发酵罐内放出，从而使发酵罐内液量维持恒定，使培养物在近似恒定的状态下生长及代谢。12应用微生物学药物连续发酵的优缺点n连续发酵的优点是：与补料分批发酵相似，能维持低基质浓度；有利于提高设备的利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；发酵罐内微生物、基质、产物和溶解氧浓度等各种参数维持在一定水平，便于自动控制；微生物在近似恒定状态下进行生理代谢，发酵产品质量稳定。n缺点是：在长时间培养过程中菌种容易发生变异，有可能产生负变株；容易感染杂菌，难以保证纯种培养。连续发酵多数用于实验室研究微生物的生理特性，至今只有葡萄糖酸、酵母蛋白和酒精等少数发酵产品的生产采用连续发酵。13应用微生物学药物3.微生物药物发酵生产的一般流程n微生物药物产生菌在进入发酵罐之前，必须经过种子扩大培养。将冷冻管或沙土管的孢子接种到斜面上，待斜面孢子或菌丝成熟后接入摇瓶中培养，长好的种子接人一级种子罐中；另外，斜面孢子也可以扩大到茄子瓶(也称扁瓶)中，茄子瓶孢子长好后可制备成孢子悬液接入一级种子罐中。菌丝在一级种子罐中长好后接入二级种子罐中继续培养，待长好后接入到发酵罐中发酵生产所需的药品，通常发酵要进行110 d，收获发酵液。发酵液经预处理及提取分离，得到成品，经检验合格后包装出厂。14应用微生物学药物二、培养基n培养基(Culturemedium)是指人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物的营养物质。培养基的组成和配比是否恰当对微生物的生长、产物的合成、工艺的选择、产品的质量和产量等都有很大的影响。15应用微生物学药物1.培养基的成分n微生物药物发酵培养基主要由碳源、氮源、无机盐类、生长因子和前体物等组成。16应用微生物学药物1.1碳源n在药物发酵生产中常用的碳源有：单糖(如葡萄糖和果糖)、寡糖(如双糖和三糖)和多糖(如淀粉、糊精)等糖类，脂肪，某些有机酸，醇或碳氢化合物以及生产淀粉的原料(如玉米粉、甜薯粉)等。n葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖等糖类物质都是微生物药物发酵生产中常用的速效碳源，淀粉、糊精、糖蜜等也是常用的碳源，17应用微生物学药物碳源n油和脂肪也能被许多微生物用作碳源和能源。在药物发酵生产中加人油和脂肪，不仅具有消泡和补充碳源的作用，而且有利于提高发酵罐的装填率、解除中间代谢的抑制作用和降低原料成本等。另外，有些油和脂肪还可作为提高供氧速率的载体，有利于满足以油和脂肪为碳源时需氧量更高的要求。常用的碳源有豆油、猪油、鱼油和棉籽油等。18应用微生物学药物1.2氮源n氮源(nitrogensource)的主要作用是微生物细胞物质和含氮代谢物的氮素来源的营养物质。氮源可分为有机氮源和无机氮源两大类。19应用微生物学药物n常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后进一步分解代谢。有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是代谢产物的前体。20应用微生物学药物n常用的无机氮源有氨水、铵盐和硝酸盐等。微生物对它们的吸收利用一般比有机氮源快，所以也称为迅速利用的氮源。无机氮源的利用常常引起pH的改变。n氨水在发酵中除可以调节pH外，也是一种容易利用的氮源，在抗生素生产中得到广泛使用。氨水碱性较强，使用时要防止局部过碱，应加强搅拌，并少量多次地加入。21应用微生物学药物n多种放线菌、霉菌或细菌都能利用各种无机氮源为主要氮源或辅助氮源，常用的有铵盐、硝酸盐。铵盐中的铵氮可以直接被菌体利用来合成细胞中的含氮物质，硝基氮必须先还原成氨后才能被利用，所以铵盐的利用比硝酸盐要快。22应用微生物学药物1.3无机盐及微量元素n微生物药物生产菌和其他微生物一样，在生长、繁殖和产物的生物合成过程中，都需要某些无机盐类(mineralsalts)和微量元素(traceelements)，如镁、硫、磷、铁、钾、钙、钠、氯、锌、钴、锰等，以作为生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。23应用微生物学药物n无机盐及微量元素一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。在培养基中，镁、硫、磷、钾、钙和氯等常以盐的形式(如硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钙、氯化钙等)加人，而钴、铜、铁、锌、铝、钼、锰等缺少了对微生物生长固然不利，但因其需要量很少，除了合成培养基外，一般在复合培养基中不再另外单独加入。因为复合培养基中的许多动物、植物原料，如花生粉、黄豆饼粉、蛋白胨等都含有微量元素。24应用微生物学药物1.4生长因子n所谓生长因子(growthfactor)是指某些微生物不能从普通的碳源、氮源合成，而需要另外添加来满足生长需要的有机物质，包括氨基酸、维生素、嘌呤碱和嘧啶碱及其衍生物，有时也包括一些脂肪酸和其他膜成分。25应用微生物学药物n不同的微生物所需的生长因子互不相同，有的需要多种生长因子(如乳杆菌)，有的仅需要一种，有的不需要生长因子就可以生长(如大肠杆菌)。一种微生物所需要的生长因子也会随培养条件的变化而变化，如在培养基中是否有前体物质、通气条件、pH和温度等条件都会影响微生物对生长因子的需求。绝大多数微生物只需要简单的碳源和氮源等就能生长，不需要添加生长因子，营养缺陷型菌株必须在培养基中添加某种氨基酸、嘌呤、嘧啶或维生素等生长因子才能生长。26应用微生物学药物2.培养基的种类与选择n2.1培养基的种类根据培养基组成物质的纯度，培养基可分为合成培养基和天然培养基(复合培养基)；按培养基的物理状态，培养基可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；根据培养基的特殊用途，培养基有用于鉴别不同种类微生物的鉴别培养基，有选择分离微生物的选择性培养基、基本培养基、加富培养基和测定生理生化特性的培养基。依据在生产中的用途(或作用)，又可将培养基分为适于培养孢子的孢子培养基、培养种子的种子培养基和发酵生产目的产物的发酵培养基。27应用微生物学药物2.2培养基的配制原则n针对不同的微生物和不同的营养要求，可以有不同的培养基，但培养基的配制必须遵循一定的原则：n营养物质应满足微生物的需要。不同的微生物对营养的需求差异很大，应根据所培养菌种对各种营养要素的不同要求进行配制。n营养物的浓度和配比应恰当。营养物的浓度太低，不能满足微生物生长的需要，浓度太高，则可能抑制微生物的生长。28应用微生物学药物n适宜的pH。各大类微生物一般都有它们生长繁殖的最适pH范围，放线菌生长的最适pH为7.58.5。对于具体的微生物来说，都有各自特定的最适pH。另外，有些微生物在繁殖过程中，会产生引起培养液pH改变的代谢产物，在设计它们的培养基时，应考虑培养基的pH调节能力，可在培养基中加入磷酸缓冲液及碳酸钙等，使培养液pH稳定。29应用微生物学药物n符合培养的目的。培养基的成分直接影响培养的目标，用于培养菌体的种子培养基成分应丰富，尤其是氮源含量要高，碳氮比值低；如果需要的是微生物的次级代谢产物，则需要考虑是否加入特殊元素或特定的前体物质。30应用微生物学药物n除此之外，还应考虑到培养基的黏度、原料中杂质的含量、消毒是否容易和彻底、消毒后营养破坏程度等，它们都对菌体生长和产物合成产生影响。在设计大规模发酵生产用培养基时，还应重视培养基中各种成分的来源和价格，提倡“以粗代精”、“以废代好”。31应用微生物学药物n目前培养基组成的确定，是根据所用菌种和发酵目的物的特性，对碳源、氮源、无机盐、生长因子等营养物以及诱导剂、前体、促进剂、缓冲剂等添加物逐个进行单因子试验，了解这些因子对菌体生长和产物合成的影响，综合各种因素相互关系，进行正交试验，以确定培养基原料和浓度，得到一个基本适合发酵生产的培养基配比，但无法获得最佳的培养基配方。32应用微生物学药物2.3影响培养基质量的因素n在工业发酵过程中，出现生产水平大幅度波动或菌体代谢异常等现象的原因很多，除种子质量不稳定及发酵工艺条件控制得不严格外，培养基质量也是一个重要的因素。引起培养基质量变化的因素很多，如原材料品种和质量、培养基的配制工艺、原材料品种和质量、培养基的配制工艺、灭菌操作等灭菌操作等。33应用微生物学药物3.灭菌n微生物药物发酵工业是利用特定微生物的机能获得所需要的微生物药物产品的工业，建立和维持无菌状态是发酵工业的特殊要求，凡是与特定微生物接触的培养基、发酵罐、空气过滤器及有关设备管路、阀门等均需严格灭菌(sterilization)，以保证进行纯种发酵。34应用微生物学药物3.1灭菌方法n所谓“灭菌”，是指经过化学或物理的方法，杀灭或除掉物料及其容器中所有有生命物质的技术或工艺过程。灭菌方法有很多，有热灭菌(分湿热和干热两种)、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等。化学药剂灭菌和射线灭菌常用于无菌室、培养室、发酵车间等处的空气杀菌。化学药剂灭菌以甲醛、石炭酸、乳酸、漂白粉、硫磺、新洁尔灭、来苏儿等为主。射线灭菌主要指波长为253.7nm的紫外线灭菌和射线灭菌。加热灭菌分湿热灭菌和干热灭菌两种。干热灭菌是利用热空气进行灭菌，湿热灭菌就是用过热蒸汽进行灭菌。湿热灭菌具有经济和快速的特点，目前发酵工业广泛采用湿热灭菌方法，包括巴氏灭菌、间歇灭菌和高压蒸气灭菌，其中又以高压蒸汽灭菌法应用最广。35应用微生物学药物3.2湿热灭菌原理n湿热灭菌(moistheatsterilization)是直接用过热蒸汽灭菌，因为蒸汽具有强大穿透力，在冷凝时能释放出大量潜热，使微生物细胞中的原生质胶体和酶蛋白变性凝固、核酸分子内氢键破坏、酶失去活性，导致微生物因代谢障碍在很短时间内死亡。36应用微生物学药物4.种子培养n种子培养是指将沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量纯种的过程。这种纯培养物称为种子。37应用微生物学药物4.1种子应具备的条件u菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；u生理状态稳定；u菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；u无杂菌污染，保证纯种发酵；u保持稳定的生产能力。38应用微生物学药物4.2种子质量的判断方法n种子质量的判断方法：由于种子在种子罐中的培养时间较短，可供分析的参数较少，使种子的内在质量难于控制，为了保证各级种子移种前的质量，除了保证规定的培养条件外，在培养过程中还要定期取样测定一些参数，来了解基质的代谢变化和菌丝形态正常与否，以保证种子的质量。在生产中通常测定的参数有：39应用微生物学药物pH；培养基灭菌后的糖、氨基氮、磷的含量；菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等)；其他参数，如转种前的抗生素含量、某种酶活力等。40应用微生物学药物4.3种子的制备n制备种子的过程大致可分为以下几个步骤：将沙土孢子或冷冻孢子接种到斜面培养基中活化培养；长好的斜面孢子或菌丝转种到扁瓶固体培养基或摇瓶液体培养基中扩大培养，完成实验室种子制备；扩大培养的孢子或菌丝接种到一级种子罐，制备生产用种子；如果需要，可将一级种子再转种至二级种子罐进行扩大培养，完成生产车间种子制备；制备好的种子转种至发酵罐进行发酵。41应用微生物学药物5.接种n接种龄：种龄是指种子的培养时间。接种龄(seedage)是指种子罐中培养的菌丝转入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。在种子罐中，随着培养时间的延长，菌丝量增加，同时基质不断消耗，代谢产物不断积累，直至菌丝量不再增加，菌体趋于老化。因此，选择适当的接种龄十分必要。42应用微生物学药物n接种量：接种量(seedvolume)是指移人的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小取决于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的合成期提前到来但是如果接种量过多，菌丝往往生长过快、培养液粘度增加，造成溶解氧不足，影响产物的合成。43应用微生物学药物n在抗生素工业中，大多数抗生素发酵的最适接种量为7%15%，有时可以增加至20%25%。44应用微生物学药物影响种子质量的因素n种子质量受很多因素的影响，概括起来主要有以下几方面：n原材料质量。原材料质量的波动，使得培养基中所含的营养成分含量发生变化，影响种子的质量。n培养温度。温度对多数微生物的斜面孢子质量有显著影响。温度过低会导致菌种生长发育缓慢，温度过高会使菌丝过早自溶。45应用微生物学药物n湿度。斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量都有较大影响。湿度低，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢。n通气量。在种子罐中培养的种子除保证供给易于利用的营养物质外，应有足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量。46应用微生物学药物n斜面冷藏时间。斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子的成熟度有关，孢子成熟，则不易导致菌体细胞自溶；冷藏时间对孢子的生产能力也有影响，通常冷藏时间越长，生产能力下降越多。47应用微生物学药物种子质量的控制措施n菌种稳定性检查：要保持菌种具有稳定的生产能力，需要定期考察和挑选菌种，对菌种进行自然分离，摇瓶发酵，测定其生产能力，从中挑选具有较高生产能力的高产菌株，防止菌种生产能力下降。n适宜的生长环境：确保菌种在适宜的条件下生长繁殖，包括营养丰富的培养基、适宜的培养温度和湿度、合理的通气量等。48应用微生物学药物n种子无杂菌检查。种子无杂菌是纯种发酵的保证。因此，在种子制备过程中每移种一步均需要进行无菌检查，并对种子液进行生化分析。无菌检查是判断杂菌的主要依据，通常是采用种子液的显微镜观察和无菌试验；种子液生化分析项目主要是测定其营养基质的消耗速度、pH变化、溶氧利用、色泽和气味等。49应用微生物学药物6.发酵控制n发酵生产受多种因素的影响和工艺条件的制约，即使同一菌种，在同一厂家，也会因生产设备、原材料来源等的差别，使得菌种的生产能力不同。一般来说，菌种的生产性能越高，使其表达它应有的生产潜力所需要的环境条件就越难满足。高产菌种比低产菌种对工艺条件的波动更为敏感。因此，针对具体的发酵过程，确定工艺条件，进行优化控制是发酵工艺研究的目的之所在。50应用微生物学药物n目前，在发酵过程中需要经常测定的参数有：温度、罐压、空气流量、搅拌速度、pH、溶解氧、效价、氨基氮含量、前体(如苯乙酸)浓度、菌体浓度(干重、离心压缩细胞体积%)等。51应用微生物学药物青霉素的发酵工艺n青霉素的产生菌主要是产黄青霉(Penicillium chrysogenum)51-20和点青霉(Pnotatum)，目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。据报道，目前青霉素的发酵单位最高达到60 000 U/ml 52应用微生物学药物（一）生产孢子的制备n生产上所用的产黄青霉菌孢子是将砂土孢子用甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基进行斜面培养；然后转种到大米或小米固体培养基上，于25培养7d，孢子成熟后进行真空干燥，低温保藏备用。53应用微生物学药物（二）发酵的影响因素及控制n青霉素大规模生产是采用三级发酵，其目的主要是使青霉菌菌体数量逐步扩大和适应发酵，其次是使发酵罐连续使用，缩短发酵周期。一级发酵通常在小罐进行，主要使孢子萌芽形成菌丝；二级发酵主要是大量繁殖青霉菌菌丝体；三级发酵除了继续大量繁殖菌丝体外主要是生产青霉素。由于每级发酵的目的不同，因此需要对培养基的组成、培养温度、pH、通气量以及培养时间等条件进行控制，以利于青霉素的合成。54应用微生物学药物1）青霉素发酵的碳氮源控制n青霉素发酵培养基中采用葡萄糖和乳糖两种碳源就能适合青霉菌发酵过程中的生理变化，在发酵初期利用氧化速率快的葡萄糖使青霉菌大量、迅速、强壮地繁殖菌丝体；当葡萄糖耗尽时青霉菌进入发酵后期，此时利用氧化缓慢的乳糖，使发酵液pH较稳定，避免速效碳源的分解产物阻遏作用，有利于青霉菌大量、持久地分泌青霉素。55应用微生物学药物n玉米浆是青霉素发酵最好的氮源,因为玉米浆含有多种氨基酸，如精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸以及青霉素生物合成的前体苯乙酸及其衍生物。由于玉米浆的质量难以控制，也可选用便于保藏和质量稳定的花生饼粉或棉籽饼粉来代替。56应用微生物学药物2）前体影响及控制n苯乙酸及其衍生物苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可以作为青霉素G侧链的前体物直接结合到青霉素分子中，也可以作为养料和能源被利用。n57应用微生物学药物3）pH的影响及控制n青霉素发酵的最适pH一般认为是6.26.8，由于青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速其水解，因此，应尽量避免pH超过7.0。在青霉素发酵过程中,通过采用下列手段控制发酵过程的pH：n当pH高于最适pH时，可以通过补加糖和生理酸性物质(如硫酸铵等无机氮源)，降低pH。n当pH低于最适pH时，可以通过补加CaC03、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。n可利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液pH维持在6.87.2，以提高青霉素产量。58应用微生物学药物n用补糖来控制pH要比用酸或碱来调节好。补糖可以采用恒速补糖的方法来控制pH；也可以根据pH来补糖，即pH上升快时就多补，pH下降时就少补，以维持pH在6.66.9的范围59应用微生物学药物4）温度的影响及控制n青霉菌生长的适宜温度为30，而分泌青霉素的适宜温度是20左右，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。n如采用从26逐渐降至22的发酵温度，可延缓菌丝衰老，增加培养液的溶解氧浓度，延长发酵周期，有利于发酵后期青霉素单位的增长，减少发酵液中青霉素的降解破坏，提高产量。Constantinides等人对青霉素的分批发酵进行了研究，并以所得试验数据进行发酵试验：056h维持在27.2，然后恒速降温至18.7，并维持到184h，最后24h回复到27.2培养。采用这种变温培养方法比常温25培养产量增加16。60应用微生物学药物5）补料控制n青霉素发酵过程中，除中间补糖以控制糖浓度及pH外，补加氮源也可提高发酵单位。在发酵过程中分次补加硫酸铵、氨或尿素等氮源，可以延长发酵周期、调节pH、提高青霉素产量。补氮的标准是控制发酵液中的氨基氮含量在0.010.05。在基础料中加入0.05尿素，并在补糖时再两次补加尿素，可以扭转发酵液浓度转稀、pH降低和青霉素单位增长缓慢的情况，有利于提高产量。61应用微生物学药物n在发酵过程中与料液一起补入表面活性剂，如新洁尔灭50mg/L，或聚氧乙烯、山梨糖酐、单油酸酯、单月桂酸酯和三油酸酯等非离子化表面活性剂非离子化表面活性剂也能增加青霉素的产量。62应用微生物学药物n在青霉素发酵过程中加入少量可溶性高分子化合物，如40 mg/L 聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，能使青霉素产率增加38%.这些物质能够提高产量的原因是：当发酵罐使用较大的搅拌功率和较快的搅拌叶尖速度时，这些高分子化合物能使邻近搅拌叶的液体速度梯度降低，避免打断菌丝，而且在促进氧在培养基中充分溶解的同时还有利于除去CO2；菌丝生长时，由于高分子化合物起分散剂的作用，菌丝不致成团，界面面积得以增加，因而增加了氧传递到菌丝体内的速度。63应用微生物学药物6）铁离子的影响及控制n三价铁离子对青霉素生物合成有显著影响，一般当发酵液中Fe3+含量超过3040 g/ml，则发酵单位增长缓慢。因此，铁制发酵罐在使用前必须进行处理，可在罐壁涂上环氧树脂等保护层，使Fe3+含量控制在30 g/ml以下。64应用微生物学药物微生物药物的分离、精制微生物药物的分离、精制65应用微生物学药物一、微生物药物的分离提取n微生物药物本身是一类天然产物，其分离方法与其他天然产物类似。在进行提取工作之前需进行预试验，试验其于酸性及碱性pH条件下是否可以转入与水不相混溶的有机溶剂以及在吸附剂上的吸附及洗脱性能；如为可提取物质，则可从试验结果推论其为酸性、中性或碱性，也可从电泳结果判断其酸碱性。66应用微生物学药物n温度的稳定性检测：通常采用生物活性判定试验结果。n由于菌体中多含水溶度低的物质，需检查菌体的丙酮及甲醇提取物的生物活性。n在研究阶段，快速提取工艺的目的是获取少量的纯活性物质供鉴别与活性检测，有别于工业大生产的提取工艺研究。67应用微生物学药物n大部分微生物产生的活性物质存在于微生物的培养液中，因此最方便而且常用的方法是溶剂萃取溶剂萃取法法。n将培养液和与水不相混溶的有机溶剂相混合，使药物转入有机溶剂中。提取的pH及所用的溶剂需根据预实验的结果而定。68应用微生物学药物n一般酸性抗生素在酸性pH时转入有机溶剂，在碱性pH时转入水中；而碱性抗生素与之相反，在碱性pH转入有机溶剂，在酸性pH时转入水中。在溶剂与水之间的反复转移中，将药物与杂质分离，从而提高药物的纯度及浓度，以利于进一步纯化。低极性及中性物质亦可用溶剂萃取法提取。69应用微生物学药物n如果活性物质存在于菌体中，则需用甲醇、丙酮等有机溶剂浸泡或渗漉来提取菌体中的活性物质。n有时，同一物质的提取还可先后使用不同溶剂，以增加选择性，更好地与杂质分离。关于溶剂的选择，原则上应是，在提取效率相近时，使用极性尽可能小的溶剂。70应用微生物学药物n在初筛阶段，微生物活性物质量且浓度较低，如果直接使用溶剂法，溶剂用量会很大，在此种情况下常首先应用吸附法吸附法。n将含活性物质的培养液吸附在活性炭或大孔树脂上，然后用适宜的有机溶剂，如甲醇、丙酮或它们的水溶液洗脱，必要时亦可于其中加入稀酸或稀氨水以帮助洗脱。经过吸附法处理后，可使活性物质的浓度大大提高，然后再采用溶剂萃取进一步浓缩、纯化。即使为“溶剂不可提取”的物质，亦由于吸附法洗脱液中活性物质浓度高，而有利于进一步采用其他办法纯化。71应用微生物学药物n离子交换法：经济、实用；其应用只限于离子性化合物的分离，且树脂种类及吸附与洗脱条件的选择费时、费力，因此在研究阶段前期应用愈来愈少，除非在预实验中已知活性物质为某种类型的离子性物质，如碱性水溶性物质，才尝试采用离子交换法。72应用微生物学药物n固相萃取技术：近年来，为适应快速处理大量研究样品的要求，在原经典吸附法及离子交换法的基础上发展起来的固相萃取技术已不断得到完善。该法系利用键合型硅胶、多孔聚合物、活性炭等作为固定相，从试料中选择性地提取所需要的目的成分，然后供进一步纯化或分析、检测用。73应用微生物学药物n现在，装填有各种固定相的、各种规格的用于固相萃取的柱子已在市场上出售。该法吸附及洗脱操作都比较容易规范化，容易得到较好的重现性，省时、省力。现在已开发出了适于同时处理许多样品的固相萃取仪，并已有商品出售。在微生物药物的研究过程中，愈来愈多地使用固相萃取技术将是一个较重要的发展趋向。74应用微生物学药物二、微生物药物的精制n经过前述方法提取得到的一般仍为粗品，需进一步精制，精制方法与其他天然产物大致相同，只是许多微生物产生的活性物质对酸、碱、热及紫外线等不稳定，故需特别注意防止被破坏。由于粗品的纯度较低，量很少，进一步精制主要是借助色谱技术。75应用微生物学药物n按照分离机理,色谱法色谱法可分为吸附色谱(液固色谱)、分配色谱(液液色谱)、离子交换色谱和排阻色谱(凝胶色谱、分子筛色谱)4类。n20世纪60年代以后由于色谱填料的改进及流动相输送和被分离物质检测技术的进步，又发展了高压液相色谱技术，其分离机理同于上述经典色谱，但由于填料粒度小、均匀，因而大大改善了涡流扩散及传质过程，提高了分离效率。n20世纪70年代以后在对流分配的基础上又发展了对流色谱，现已广泛用于天然产物的分离。另外在经典色谱的基础上经过装置的改进又出现了其他一些较现代的色谱技术。76应用微生物学药物1.吸附色谱n吸附色谱(adsorptionchromatography)主要靠吸附剂对被吸附物中各组分吸附力不同而使不同组分分离。n常用于液固色谱的非极性吸附剂有活性炭及非极性大网格树脂，极性吸附剂有硅胶、氧化铝及极性大网格树脂。常用溶剂的极性顺序如下：己烷己烷环己烷环己烷甲苯甲苯苯苯乙醚乙醚氯仿氯仿乙酸乙酯乙酸乙酯丙酮丙酮正丙醇正丙醇甲醇甲醇水水77应用微生物学药物有机溶剂的极性78应用微生物学药物n强极性溶剂：强极性溶剂：甲醇乙醇异丙醇甲醇乙醇异丙醇n中等极性溶剂：中等极性溶剂：乙氰乙酸乙酯氯仿二氯甲烷乙醚甲苯乙氰乙酸乙酯氯仿二氯甲烷乙醚甲苯n非极性溶剂：非极性溶剂：环己烷，石油醚，己烷，戊烷环己烷，石油醚，己烷，戊烷79应用微生物学药物常用混合溶剂常用混合溶剂n乙酸乙酯乙酸乙酯/己烷：常用浓度己烷：常用浓度0-30%。但有时较难在。但有时较难在旋转蒸发仪上完全除去溶剂。旋转蒸发仪上完全除去溶剂。n乙醚乙醚/戊烷体系：浓度为戊烷体系：浓度为0-40%的比较常用。在旋的比较常用。在旋转蒸发器上非常容易除去转蒸发器上非常容易除去n乙醇乙醇/己烷或戊烷：对强极性化合物己烷或戊烷：对强极性化合物5-30%比较合比较合适。适。n二氯甲烷二氯甲烷/己烷或戊烷：己烷或戊烷：5-30%，当其他混合溶剂，当其他混合溶剂失败时可以考虑使用。失败时可以考虑使用。80应用微生物学药物混合溶剂的极性顺序n苯氯仿（1+1）环己烷乙酸乙酯（8+2）氯仿丙酮（95+5）苯丙酮（9+1）苯乙酸乙酯（8+2）氯仿乙醚（9+1）苯甲醇（95+5）苯乙醚（6+4）环己烷乙酸乙酯（1+1）氯仿乙醚（8+2）氯仿甲醇（99+1）苯甲醇（9+1）氯仿丙酮（85+15）苯乙醚（4+6）苯乙酸乙酯（1+1）氯仿甲醇（95+5）氯仿丙酮（7+3）苯乙酸乙酯（3+7）苯乙醚（1+9）乙醚甲醇（99+1）乙酸乙酯甲醇（99+1）苯丙酮（1+1）氯仿甲醇（9+1）81应用微生物学药物2.分配色谱法n分配色谱法(partitionchromatography)是靠混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同而将各组分分离的一种色谱方法，通常是将固定相吸着或键合在多孔的载体上。当流动相通过时，具有不同分配系数的各组分在两相中不断重新分配，从而得到分离。纸色谱是一种分配色谱，但主要用于分析。对流色谱是典型的分配色谱，现已得到广泛应用。82应用微生物学药物3离子交换色谱及离子排斥色谱n在排阻色谱(exclusion chromatography，又称凝胶色谱，gel chromatography)中，被分离的混合物中不同组分的保留程度取决于分子大小。混合物中的小分子可渗透到凝胶的微孔中而被滞留，中等分子可部分进入，大分子则完全不能进入。因此大分子比小分子先流出柱，各组分按分子大小得到分离。常用的有亲水性的葡聚糖凝胶Sephadex GIO50，以及亲脂性葡聚糖凝胶Sephadex LH-20。前者用水浸泡溶胀、洗脱，后者可在水及有机溶剂中膨胀，但多在有机溶剂中浸泡、膨胀后应用。除此之外还有疏水性凝胶，如聚苯乙烯凝胶、甲基丙烯酸酯凝胶等，专用于水不溶的有机物质的分离，用有机溶剂膨胀及洗脱。使用这类凝胶的方法一般被称之为凝胶渗透色谱法(gel-permeation chromatography)。83应用微生物学药物4.现代色谱技术n高压液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)n低压液相层析(low-pressure liquid chromatography，LPLC)n中压液相层析(mediurn-preasure liquid chromatography，MPLC)n真空层析(vacuum chromatography,VLC)n快速层析(flash chromatography)n平面层析n对流色谱(counter-current chromatography,CCC)84应用微生物学药物结束85应用微生物学药物