NDM-1分子生物学检测方法课件

产NDM-1泛耐药肠杆菌科 细菌感染诊疗指南 实验室检测方法解读徐英春 北京协和医院产NDM-1泛耐药肠杆菌科 细菌感染诊疗指南 产产KPC酶的肠杆菌科细菌特征酶的肠杆菌科细菌特征 阿米卡星阿米卡星阿米卡星阿米卡星 R R氨苄西林氨苄西林氨苄西林氨苄西林 R R氨苄西林氨苄西林氨苄西林氨苄西林-舒巴坦舒巴坦舒巴坦舒巴坦 R R氨曲南氨曲南氨曲南氨曲南 R R头孢唑林头孢唑林头孢唑林头孢唑林 R R 头孢匹肟头孢匹肟头孢匹肟头孢匹肟 R R头孢西丁头孢西丁头孢西丁头孢西丁 R R 头孢他啶头孢他啶头孢他啶头孢他啶 R R头孢曲松头孢曲松头孢曲松头孢曲松 R R氯霉素氯霉素氯霉素氯霉素 R R 环丙沙星环丙沙星环丙沙星环丙沙星 R R厄他培南厄他培南厄他培南厄他培南 R R或或或或I I庆大霉素庆大霉素庆大霉素庆大霉素 R R亚胺培南亚胺培南亚胺培南亚胺培南 R R或或或或I I左氧氟沙星左氧氟沙星左氧氟沙星左氧氟沙星 R R美罗培南美罗培南美罗培南美罗培南 R R或或或或I I哌拉西林哌拉西林哌拉西林哌拉西林-他唑巴坦他唑巴坦他唑巴坦他唑巴坦 R R四环素四环素四环素四环素 R R妥布霉素妥布霉素妥布霉素妥布霉素 R R复方磺胺复方磺胺复方磺胺复方磺胺 R RMIC(MIC(g/ml)g/ml)MIC(MIC(g/ml)g/ml)39 产KPC酶的肠杆菌科细菌特征 阿米卡星 R环丙沙星KPC 产产产产KPCKPC酶的肠杆菌科细菌耐药特点酶的肠杆菌科细菌耐药特点酶的肠杆菌科细菌耐药特点酶的肠杆菌科细菌耐药特点o所有的所有的 b b-内酰胺类耐药内酰胺类耐药n n青霉素类青霉素类青霉素类青霉素类n n广谱头孢菌素广谱头孢菌素广谱头孢菌素广谱头孢菌素n n单环单环单环单环B B内酰胺类内酰胺类内酰胺类内酰胺类n n碳青霉烯类碳青霉烯类碳青霉烯类碳青霉烯类n n质粒介导的耐药基因质粒介导的耐药基因质粒介导的耐药基因质粒介导的耐药基因n n有的菌株同时有的菌株同时有的菌株同时有的菌株同时 ESBLESBL（+）,氟喹诺酮类耐药、氨基氟喹诺酮类耐药、氨基氟喹诺酮类耐药、氨基氟喹诺酮类耐药、氨基糖苷类耐药糖苷类耐药糖苷类耐药糖苷类耐药35KPC 产KPC酶的肠杆菌科细菌耐药特点所有的 b-内酰胺 产产产产KPCKPC酶的肠杆菌科细菌耐药特点酶的肠杆菌科细菌耐药特点酶的肠杆菌科细菌耐药特点酶的肠杆菌科细菌耐药特点oo黏菌素黏菌素黏菌素黏菌素/多粘菌素多粘菌素多粘菌素多粘菌素 敏感敏感敏感敏感 MIC MIC 2 g/ml S 2 g/ml S oo替加环素替加环素替加环素替加环素 可能敏感（可能敏感（可能敏感（可能敏感（MIC 2 g/ml S;4 g/ml I;MIC 2 g/ml S;4 g/ml I;8 g/ml R8 g/ml R）52 产KPC酶的肠杆菌科细菌耐药特点黏菌素/多粘菌素 敏感NDM-1 的检测方法pNDM-1，即新德里金属-内酰胺酶-1型，是由细菌质粒上携带的blaNDM-1基因编码的。目前，国际上已有十余篇关于NDM-1的研究性文章或相关部门报告发表。p 由blaNDM-1编码产生的碳青霉烯酶及因此产生的对碳青霉烯类耐药性可以通过现有推荐使用的表型鉴定方法准确、可靠的鉴定出来11 US CDC.MMWR Morb Mortal Wkly Rep.2010 Jun 25;59(24):750.2 Yong D et al.Antimicrob Agents Chemother.2009 Dec;53(12):5046-54.NDM-1 的检测方法NDM-1，即新德里金属-内酰胺酶-CLSI M100-S20及CLSI M100-S20-U中碳青霉烯类的折点 抗菌药物纸片扩散法(mm)稀释法(mg/L)M100-S20M100-S20-UM100-S20M100-S20-US RS RS RS R多利培南-23 19-1 4厄他培南19 1523 192 80.25 1亚胺培南16 1323 194 16 1 4美罗培南16 1323 194 16 1 4CLSI M100-S20及CLSI M100-S20-U中（一）表型筛查试验 o纸片扩散法：n美罗培南（10ug）或亚胺培南（10ug）：o抑菌圈直径22mmo肉汤稀释法或Etest法n美罗培南或亚胺培南:MIC2ug/mln亚胺培南适合于大肠埃希菌，克雷伯菌属，沙门菌属，肠杆菌属o变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属对亚胺培南敏感性下降是由产碳青霉烯酶外的其他机制引起，因此对这些菌株尚未建立用亚胺培南MIC法进行筛选和确认碳青霉烯酶，并且亚胺培南纸片法对所有肠杆菌科碳青霉烯酶的筛查效果都不好 1 Yong D et al.Antimicrob Agents Chemother.2009 Dec;53(12):5046-54.2 Kumarasamy KK et al.Lancet Infect Dis.2010 Sep;10(9):597-602.（一）表型筛查试验 纸片扩散法：1 Yong D et（二）表型确证试验o纸片扩散法：oEtest法：o双纸片协同法：o改良霍奇试验改良霍奇试验(modified Hodge test)(modified Hodge test)o自动化鉴定与药敏仪器自动化鉴定与药敏仪器1 Yong D et al.Antimicrob Agents Chemother.2009 Dec;53(12):5046-54.2 Kumarasamy KK et al.Lancet Infect Dis.2010 Sep;10(9):597-602.（二）表型确证试验纸片扩散法：1 Yong D et（二）表型确证试验o纸片扩散法：亚胺培南(10ug)/亚胺培南(10ug)+EDTA(500mM 10ul)复合纸片n结果判读：复合纸片比单药纸片抑菌环直径增大5mm图：图：复合纸片法判定金属-内酰胺酶示意图(左纸片：亚胺培南/EDTA,右纸片：亚胺培南)1 Yong D et al.J Clin Microbiol.2002 Oct;40(10):3798-801.（二）表型确证试验纸片扩散法：亚胺培南(10ug)/亚胺培南（二）表型确证试验Etest法：Etest MBL(IP/IPI、MP/MPI)结果判读：单药与复合制剂的MIC比值8图图：Etest MBL(IP/IPI)1 http:/www.biomerieux- MBL(IP图：图：Etest MBL 试验示意图(亚胺培南/亚胺培南+抑制剂EDTA)1 Lee K et al.J Clin Microbiol.2005 Feb;43(2):942-4.图：Etest MBL 试验示意图1 Lee K et（二）表型确证试验o 双纸片协同法：亚胺培南(10ug)、EDTA(0.5M x 10 l约0.5mg/片)，间距10mm(0.5McF）图：图：亚胺培南-EDTA双纸片协同试验示意图(图中菌种为铜绿假单胞菌)1 Lee K et al.J Clin Microbiol.J Clin Microbiol.2003 Oct;41(10):4623-9.（二）表型确证试验 双纸片协同法：亚胺培南(10ug)、EDE.coliE.coli ATCC ATCC 2592225922厄他培南抑制厄他培南抑制厄他培南抑制厄他培南抑制 E.coliE.coli ATCC 25922 ATCC 25922 有丰富菌的有丰富菌的有丰富菌的有丰富菌的E.coliE.coli ATCC 25922 ATCC 25922生长生长生长生长#1 pos#1 pos1.1.制备制备制备制备 0.5McF0.5McF的的的的 E.coliE.coli ATCC ATCC 2592225922菌悬液菌悬液菌悬液菌悬液.1:10.1:10稀释稀释稀释稀释2.2.用棉签均匀涂布用棉签均匀涂布用棉签均匀涂布用棉签均匀涂布 MHA MHA 平皿、约平皿、约平皿、约平皿、约5 5分钟，中心贴厄他培南或美罗培南分钟，中心贴厄他培南或美罗培南分钟，中心贴厄他培南或美罗培南分钟，中心贴厄他培南或美罗培南纸片纸片纸片纸片3.3.用用用用1 ul1 ul接种环挑取接种环挑取接种环挑取接种环挑取2-32-3个菌落，从纸个菌落，从纸个菌落，从纸个菌落，从纸片边缘向外划线片边缘向外划线片边缘向外划线片边缘向外划线4.4.过夜培养（过夜培养（过夜培养（过夜培养（16-20h16-20h）.5.5.出现向内生长的菌株薇碳青霉烯酶出现向内生长的菌株薇碳青霉烯酶出现向内生长的菌株薇碳青霉烯酶出现向内生长的菌株薇碳青霉烯酶阳性（如图阳性（如图阳性（如图阳性（如图1 1，2 2）.（二）表型确证试验#2#2 pospos#3 neg#3 negCLSI M100-S20.CLSI M100-S20.改良霍奇试验改良霍奇试验(modified Hodge test)E.coli 厄他培南抑制 E.coli 有丰富菌的E.（二）表型确证试验自动化鉴定药敏仪器自动化鉴定药敏仪器BD凤凰凤凰100WalkwayMicroScanVITEK2（二）表型确证试验自动化鉴定药敏仪器 谢谢！NDM-1分子生物学检测方法课件