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第六章 分子生物学基本研究法（下）基因功能研究技术第六章 分子生物学基本研究法（下）基因功能研究技术1基因表达研究技术基因敲除技术蛋白质及RNA相互作用技术基因芯片及数据分析利用酵母鉴定靶基因功能其他分子生物学技术基因表达研究技术2 6.1 基因表达研究技术6.1.1 6.1.1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Serial Analysis of Gene ExpressionGene Expression，SAGESAGE）以DNADNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-109-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物。因此，可用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9-10个碱基序列并制成标签。将10-50个序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总标签数的比例即可分析所对应编码基因的表达频率。6.1 基因表达研究技术6.1.1 基因表达系列分析技3 常规SAGESAGE方法（short short SAGESAGE）基本流程连接子1和连接子2的5端分别加有氨基，以防止5端相连接。分离提取合成分离提取合成cDNA用锚定酶用锚定酶AE消化消化分分3端酶切端酶切两份，分别两份，分别与与S类TE标签酶识标签酶识别位点结合。别位点结合。标签酶标签酶TE酶切酶切末端补平末端补平连接两份，根据接头连接两份，根据接头1、2设计引物进行设计引物进行PCR 得到双标签，分离得到双标签，分离纯化串联入载体。纯化串联入载体。连接连接10-50个标签进个标签进行克隆，测序，分析行克隆，测序，分析 常规SAGE方法（short SAGE）基本流程分离提取合4LongSAGELongSAGE技术传统的SAGE技术用14个碱基的标签代表一个基因并不能覆盖人类基因组内所有的基因序列，因而又发展了LongSAGE技术。LongSAGE标签来自转录物33端一段21bp21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与传统的ShortSAGESAGE方法类似，只是用了不同的SS类标签酶（MmeMmeI I），并将程序做了相应修改。LongSAGE技术传统的SAGE技术用14个碱基的标签代表56.1.2 RNA6.1.2 RNA的选择性剪接技术RNARNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNAmRNA前体中产生不同的mRNAmRNA剪接异构体的过程。可分为：平衡剪切；55选择性剪切；33选择性剪切；外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCRRT-PCR法（反转录PCR）研究某个基因是否存在选择性剪切。RT-PCR：把RNA提取后反转录成cDNA，并以其为模板进行的PCR反应。6.1.2 RNA的选择性剪接技术RNA的选择性剪接是指6平衡剪切5选择性剪切3选择性剪切外显子遗漏型剪切相互排斥性剪切平衡剪切5选择性剪切3选择性剪切外显子遗漏型剪切相互排斥7一般用RT-PCR法研究一个基因是否存在选择性剪接。选择性剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列。分析人类基因组数据发现60%的基因在表达中可通过选择性剪接产生各种形式的mRNA。一般用RT-PCR法研究一个基因是否存在选择性剪接。选择性剪8该基因编码一个神经无轴突定向受体，4号外显子有12个变异体，6号外显子有48个变异体，9号外显子有33个变异体，17号外显子有2个变异体。推测该基因共有1248332=38016剪接异构体。该基因编码一个神经无轴突定向受体，4号外显子有12个变异体，96.1.3 6.1.3 原位杂交技术原位杂交(In Situ Hybridization(In Situ Hybridization，ISH)ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段，分为两大类：RNA原位杂交染色体原位杂交6.1.3 原位杂交技术原位杂交(In Situ Hy10RNARNA原位杂交：一般用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNAmRNA分子，两者杂交产生双链RNARNA，就可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。RNA原位杂交：一般用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）11用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达12荧光原位杂交(fluorescence in situ(fluorescence in situ hybridizationhybridization，FISH)FISH)首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNADNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNADNA序列在染色体上的位置。荧光原位杂交(fluorescence in situ hy136.1.4 基因定点突变(site-directed mutagenesis)该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNADNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。迄今尚未建立用于精确预测特定氨基酸变化对整个蛋白结构及活性影响的模型，即使了解一个蛋白质的三维结构，也无法了解某个氨基酸残基对其的影响。而基因定点突变为进一步了解蛋白质的结构与功能的关系提供了重要的手段。6.1.4 基因定点突变(site-directed m1470年代初，Smith等建立了体外寡核苷酸介导的DNA 突变技术，提高了突变效率。70年代初，Smith等建立了体外寡核苷酸介导的DNA 突变15目前，主要采用两种PCRPCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点 突变。重叠延伸介导的定点诱变机制：目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在16图6-7 重叠延伸介导的定点诱变机制首先模板DNA分别与引物对1（正向诱变引物FM和反向引物R2）及引物对2（正向引物F2和反向诱变引物RM）退火，通过PCR1和2反应扩增出两种靶基因片段。然后，在PCR3反应中变性后的FMR2和RMF2片段在重叠区发生退火，按虚线所示进行延伸，形成全长双链DNA。FMR2RMF2图6-7 重叠延伸介导的定点诱变机制首先模板DNA分别与引物17首先用正向突变引物（M）和反向引物（R1），扩增模板DNA产生双链大引物（PCR1），与野生型DNA分子混合后退火并使之复性，第二轮PCR中加入正向引物（F2），与PCR1中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链DNA。首先用正向突变引物（M）和反向引物（R1），扩增模板DNA产186.2 基因敲除技术6.2.1 基本原理经典遗传学（Forward geneticsForward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。现代遗传学（Reverse geneticsReverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。6.2 基因敲除技术6.2.1 基本原理经典遗传学（F19基因敲除（gene knock-outgene knock-out）又称基因打靶：通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有 专一性强、染色体DNADNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶：20基因敲除分为：完全基因敲除条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）完全基因敲除：指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性；条件型基因敲除：指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。基因敲除分为：21关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/LoxpCre/Loxp系统、Gin/GixGin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRTFLP/FRT系统和R/RSR/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/LoxpCre/Loxp系统应用最为广泛。关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gi221、完全基因敲除：Neo基因有双重作用：形成靶位点的插入突变；作为正向筛选标记。取代型插入型1、完全基因敲除：取代型插入型23由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为1010-2-21010-5-5，植物的概率为1010-4-41010-5-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。所以，得用多种PCR及Southern杂交等多种分子筛选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除的细胞系。由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为1242、条件型基因敲除：完全基因敲除往往导致胚胎死亡；而条件型基因敲除，由于具有可调节性而受到科学家的重视。特点：常将正向选择标记neor置于内含子中。2、条件型基因敲除：256.2.2 6.2.2 高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路线主要包括：构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNADNA导入胚胎干细胞纯系中。使外源DNADNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNADNA序列整合到内源基因组中并得以表达。主要实验流程及筛选步骤：6.2.2 高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路26模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)回交显微注射筛选后的ES细胞注入母体重组载体中的DNA整合到内源基因组中得以表达将正向选择标记neor置于载体中与ES细胞重组筛选重组后的ES细胞模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。胚胎干细胞(27显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。胚胎干细胞（ESES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注286.2.3 6.2.3 植物基因敲除技术T-DNAT-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-DNAT-DNA介导转化，将带有报告基因的DNADNA序列整合到基因组DNADNA上，如果这段DNADNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。T-DNAT-DNA：是农杆菌Ti或Ri质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中，已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体，是Ti质粒上的片断。Ti质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的载体。报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因。6.2.3 植物基因敲除技术T-DNA插入失活技术是目前29a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB 是指载体上的一段 引物，目的基因片 段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。b，PCR产物电泳结果。分别代表野生 型、杂合子和纯合 子PCR条带。由T-DNA介导目的基因片段LB为插入载体的引物PCR产物产物电泳电泳结果结果整合导致基因失活已知序列通过设计引物分离靶基因a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB 是306.3 6.3 蛋白质及RNARNA相互作用技术6.3.1 6.3.1 酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）是上世纪9090年代中发展起来的研究DNA-DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNADNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNADNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。6.3 蛋白质及RNA相互作用技术6.3.1 酵母单杂31将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoterminimal promoter，PminPmin）的上游，把报告基因连接到PminPmin下游。将编码待测转录因子cDNAcDNA与已知酵母转录激活结构域（transcription-activating domain,ADtranscription-activating domain,AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 PminPmin启动子，使报告基因得到表达。将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal pro32转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。上游下游结构域启动子二者融合导入酵母细胞转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告33图6-16 从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子基本流程示意图。酵母单杂交体系主要用于：l确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；l分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因；l验证反式转录调控因子的DNA结合结构域；l准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。由于该方法的敏感和可靠性，已被广泛用于克隆细胞中含量极低且用生物化学手段难以纯化的那部分转录调控因子。图6-16 从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的346.3.2 6.3.2 酵母双杂交系统（Yeast two-Yeast two-hybrid systemhybrid system）真核生物转录调控因子具有组件式结构（modularmodular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域。其中DNADNA结合结构域（binding domainbinding domain，BDBD）和转录激活结构域（activation domainactivation domain，ADAD）是转录激活因子发挥功能所必须的。6.3.2 酵母双杂交系统（Yeast two-hybr35DNADNA结合结构域（BDBD）能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录。由不同转录调控因子的BDBD和DNA转录激活结构域ADAD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。DNA结合结构域（BD）能与特定基因启动区结合，但不能激活基36BDAD杂合蛋白激活转录功能BDAD杂合蛋白激活转录功能376.3.5 RNAi6.3.5 RNAi（RNA interference,RNARNA interference,RNA干涉）技术及其应用RNAiRNAi技术：利用设计的双链小RNARNA高效、特异性降解细胞内同源mRNAmRNA，从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAiRNAi的命名来源于安德鲁法尔19981998年在自然杂志上的论文。6.3.5 RNAi（RNA interference,38RNAiRNAi作用机制示意图。初始转录产物降解细胞内同源mRNA双链小RNA核酸酶核酸酶RNA诱导的沉默复合体诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体）的核蛋白体RISC介导切割介导切割siRNAmRNA被降解，被降解，翻译受抑制翻译受抑制RNAi作用机制示意图。初始转录产物双链小RNA核酸酶RNA39研究发现，双链RNARNA是RNAiRNAi的触发物，引发与之互补的单链RNARNA（ssRNA,single-stranded RNAssRNA,single-stranded RNA）的降解。经过DicerDicer（一种具有RNAase IIIRNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNARNA（3030个核苷酸以上）首先被降解形成21212525个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNAsiRNA，short interfering RNA short interfering RNA），并有效地定位目标mRNAmRNA。研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链R40siRNAsiRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNARNA降解的重要中间媒介。具有特殊的结构特征，即55端磷酸基团和33端的羟基，其两条链的33端各有两个碱基突出于末端。由siRNAsiRNA中的反义链参与指导合成被称为RNARNA诱导的沉默复合体（RISCRISC）的核蛋白体，再由RISCRISC介导切割目的mRNAmRNA分子中与siRNAsiRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中416.4 6.4 基因芯片及数据分析基因芯片（DNA chipDNA chip），又称DNADNA微阵列（DNA DNA microarraymicroarray）技术，是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录的变化规律。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。6.4 基因芯片及数据分析基因芯片（DNA chip），又4243简易基因芯片使用机械臂把DNADNA片段点在玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以 直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到 寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA cDNA 或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组 织或同一组织不同发育时期或不同生理条件 下的表达模式。简易基因芯片使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜上，经过44大规模基因芯片的应用大规模基因芯片的应用45基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，确定哪些基因的表达受抑制或激活。基因芯片可用于进行基因诊断。46作业：1、简述酵母单杂交系统的主要原理。2、简述酵母双杂交系统的主要原理。3、基因敲除技术作业：1、简述酵母单杂交系统的主要原理。47n9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。6月-246月-24Saturday,June 15,2024n10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。23:48:1723:48:1723:486/15/2024 11:48:17 PMn11、越是没有本领的就越加自命不凡。6月-2423:48:1723:48Jun-2415-Jun-24n12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。23:48:1723:48:1723:48Saturday,June 15,2024n13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。6月-246月-2423:48:1723:48:17June 15,2024n14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。15 六月 202411:48:17 下午23:48:176月-24n15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。六月 2411:48 下午6月-2423:48June 15,2024n16、业余生活要有意义，不要越轨。2024/6/15 23:48:1723:48:1715 June 2024n17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。11:48:17 下午11:48 下午23:48:176月-24n9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。6月-246月-24Saturday,June 15,2024n10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。23:48:1723:48:1723:486/15/2024 11:48:17 PMn11、越是没有本领的就越加自命不凡。6月-2423:48:1723:48Jun-2415-Jun-24n12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。23:48:1723:48:1723:48Saturday,June 15,2024n13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。6月-246月-2423:48:1723:48:17June 15,2024n14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。15 六月 202411:48:17 下午23:48:176月-24n15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。六月 2411:48 下午6月-2423:48June 15,2024n16、业余生活要有意义，不要越轨。2024/6/15 23:48:1723:48:1715 June 2024n17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。11:48:17 下午11:48 下午23:48:176月-24n9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。6月-246月-24Saturday,June 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