外源基因的表达课件

外源基因表达系统由基因表达载体和外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。相应的受体细胞两部分组成。基因表达系统有原核生物基因表达系基因表达系统有原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统。统和真核生物基因表达系统。第一节外源基因表达系统第一节外源基因表达系统外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细1据受体细胞的不同可分为：据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统：原核表达系统：将将外外源源基基因因引引入入原原核核细细胞胞，并并使使其其在在原原核核细细胞胞中中以以发发酵酵形形式式快快速速高高效效地地表表达达、合成基因产物的体系。合成基因产物的体系。2真核表达系统：使外源基因在真核细真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。胞中表达的体系。据受体细胞的不同可分为：2（1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。（2）基因组结构简单，便于基因操作和分析。）基因组结构简单，便于基因操作和分析。（3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。构建相应的表达载体。（4）生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。）生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。（5）不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物）不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。无特定的空间构象。（6）内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达）内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。产物的不稳定性。原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点：原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点：（1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅3 外源基因在受体细胞中的表达包括转录外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个环节，它是在一系列酶蛋白和调和翻译两个环节，它是在一系列酶蛋白和调控序列的共同作用下完成的。控序列的共同作用下完成的。一、启动子一、启动子启动子启动子(promoter,P)是指能被是指能被RNA聚合聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。序列。第二节基因表达的调控元件第二节基因表达的调控元件外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个环节，它是41.原核生物的启动子原核生物的启动子 原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区。起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区。识别区识别区 Pribnow框框 转录起点转录起点 1619bp 59bp5 TTGACA TATAAT A（G）33 AACTGT ATATTA T（C）5 -35序列序列 -10序列序列 图示：图示：原核生物启动子结构模式原核生物启动子结构模式1.原核生物的启动子原核生物的启动子一般5 （1）转录起始位点）转录起始位点:大多数细菌启动子转大多数细菌启动子转录起始区的序列为录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基（开始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）。）。（2）Pribnow框框:在距转录起始位点上游在距转录起始位点上游存在一个存在一个6bp保守序列：保守序列：TATAAT，由于富含，由于富含A、T，又称为，又称为TATA box，中间的碱基位于转录，中间的碱基位于转录起始点上游的起始点上游的10bp处，又称为处，又称为 10序列区序列区。少。少数数Pribnow框中间碱基的位置在框中间碱基的位置在 9-18之间之间变化。变化。（1）转录起始位点:大多数细菌启动子转录起始区的序6 （3）Sextama框框:在转录启动区的另一个六联体在转录启动区的另一个六联体保守序列位于距转录起始位点上游保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称处，通常称为为-35区区，该保守序列为，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱，其中前三个碱基具有较强的保守性，它是基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点。聚合酶的识别位点。（4）间隔区间隔区:原核生物启动子在转录起始位点与原核生物启动子在转录起始位点与Pribnow框之间、框之间、Pribnow框与框与Sextama框之间存在框之间存在长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重要要,但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要因素。因素。启动子强弱取决于启动子强弱取决于-35区和区和-10区的碱基组成及其间区的碱基组成及其间隔序列隔序列（3）Sextama框:在转录启动区的另一个六联7 原核原核RNA聚合酶不能识别真核基因的启聚合酶不能识别真核基因的启动子。动子。原核表达系统中通常使用可调控的强启原核表达系统中通常使用可调控的强启动子有动子有Lac、Trp、PL、Tac等。等。一般认为，大肠杆菌一般认为，大肠杆菌RNA聚合酶识别聚合酶识别并结合启动子并结合启动子-35区和区和RNA聚合酶聚合酶 亚基结亚基结合，合，-10区和区和RNA聚合酶的核心酶结合，在聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近，转录起始位点附近，DNA被解旋形成单链，被解旋形成单链，RNA聚合酶使第聚合酶使第1和第和第2核苷酸形成磷酸二核苷酸形成磷酸二酯键，以后酯键，以后RNA聚合酶向前推进，形成新聚合酶向前推进，形成新的的RNA链。链。原核RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。89根据真核基因编码的产物和根据真核基因编码的产物和RNA聚合酶的聚合酶的种类可把真核生物的启动子分为三类：种类可把真核生物的启动子分为三类：型启动子型启动子:rRNA基因启动子。基因启动子。型启动子型启动子:mRNA基因启动子。基因启动子。型启动子型启动子:tRNA启动子。启动子。2真核生物的启动子真核生物的启动子根据真核基因编码的产物和RNA聚合酶的种类可把真核生物的启10 所属的基因绝大多数为编码蛋白质。所属的基因绝大多数为编码蛋白质。型启动子型启动子也具有两也具有两个高度保守的共有序列。其一是在个高度保守的共有序列。其一是在25附近的一段附近的一段AT富集序富集序列，其共有序列是列，其共有序列是TATAA，称，称为为TATA盒盒。TATA盒与原核的盒与原核的Pribonow盒相似，盒相似，是与是与DNA双链的解链有关，决定转录的起双链的解链有关，决定转录的起始始。其二是在多数启。其二是在多数启动动子中，子中，-70附近共有序列附近共有序列CAAT区，称区，称为为CAAT盒盒，与，与RNA酶的结合有关酶的结合有关。除以上两个区域外，有。除以上两个区域外，有些启些启动动子上游中含有子上游中含有GC盒盒，是，是转录转录因子与因子与DNA分子此它分子此它们们可可影响影响转录转录起始的起始的频频率。启率。启动动子决定了被子决定了被转录转录基因的启基因的启动频动频率率与精确性，同与精确性，同时时启启动动子在子在DNA序列中的位置和方向是序列中的位置和方向是严严格固格固定的，是由定的，是由5到到3方向。方向。型启动子型启动子：所属的基因绝大多数为编码蛋白质。型启动子也具有11 转录终止过程包括：转录终止过程包括：（1）RNA聚合酶停在聚合酶停在DNA模板上不再前进，模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上；的延伸也停止在终止信号上；（2）完成转录的）完成转录的RNA从从RNA聚合酶上释放出来；聚合酶上释放出来；（3）RNA聚合酶从模板上释放出来。聚合酶从模板上释放出来。二二 终止子（终止子（terminatorterminator，T T）:位于基位于基因因33端端,给予给予RNARNA聚合酶转录终止信聚合酶转录终止信号的号的DNADNA序列。序列。转录终止过程包括：二终止子（termin12 对对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，有有一些共同的特点，有1段富含段富含A/T的区域和的区域和1段富段富含含G/C的区域，的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构，富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。并具有茎环结构。并且有与且有与A/T富含区对应的一串富含区对应的一串U。G/C富含区富含区2 G/C富含区富含区1 A/T富含区富含区 DNA NNAA GCGCCG NNNN CCGGCGC TTTTTT NNN NNTT CGCGGC NNNN GGCCGCG AAAAAA NNN RNA NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有13NN N N C G CC G C G RNA结构结构G CC GG CA UA UNNNN UUUU-OH3图：图：强终止子模式图强终止子模式图N14 mRNA的翻译起始效率主要由其的翻译起始效率主要由其5端的结构序列端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列），它包括下列四个特征要素：四个特征要素：（1）位于翻译起始密码子上游的）位于翻译起始密码子上游的6至至8个核苷酸序个核苷酸序列列5UAAGGAGG3，即，即Shine-Dalgarno(SD)序列，序列，富含嘌呤核苷酸，通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中富含嘌呤核苷酸，通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的的16S rRNA 3端的富含嘧啶区域端的富含嘧啶区域3AUUCCUCC5并并与之专一性结合，将与之专一性结合，将RNA定位于核糖体上，从而启动定位于核糖体上，从而启动翻译翻译。三、三、SD序列序列:lSD序列是核糖体序列是核糖体RNA的识别和结合位点的识别和结合位点。mRNA的翻译起始效率主要由其5端的结构15（2）翻译起始密码子，大肠杆菌绝大）翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用但有些基因也使用GUG或或UUG作为翻译作为翻译起始密码子起始密码子。（3）SD序列与翻译起始密码子之间的序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。距离及碱基组成。（4）基因编码区）基因编码区5端若干密码子的碱基端若干密码子的碱基序列。序列。（2）翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅16 在组成蛋白质的在组成蛋白质的20种氨基酸中，只有甲硫氨酸种氨基酸中，只有甲硫氨酸和色氨酸仅对应唯一的密码子，另外和色氨酸仅对应唯一的密码子，另外18种氨基酸均种氨基酸均拥有拥有2至至6种不同的密码子，这些编码相同氨基酸的种不同的密码子，这些编码相同氨基酸的不同密码子称为简并密码子。不同密码子称为简并密码子。在在E.coli中，并非每一种密码子都拥有自己的中，并非每一种密码子都拥有自己的tRNA，同一种，同一种tRNA分子往往可以识别多种简并密分子往往可以识别多种简并密码子。码子。四、密码子：四、密码子：在组成蛋白质的20种氨基酸中，只有甲硫氨酸和色氨17 采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子。应简并密码子。原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。是密码子的正确选择。采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码子的偏爱性规18 增强子（增强子（enhancer）是能够增强启）是能够增强启动子转录活性的动子转录活性的DNA顺式作用序列。顺式作用序列。增强子的结构类似启动子，由多个增强子的结构类似启动子，由多个元件组成，每个元件可以与一种或多种元件组成，每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。转录调控因子结合。转录调控区通常含有多个自主的增转录调控区通常含有多个自主的增强子，每个长强子，每个长501500bp不等。每个不等。每个增强子都有一种特定的功能。增强子都有一种特定的功能。五、增强子五、增强子:增强子（enhancer）是能够增强启动子转录活性的D19六、翻译终止子六、翻译终止子如果用如果用UAAU来终止翻译，效率会增加。来终止翻译，效率会增加。20第三节第三节 表达载体表达载体1.表达载体：表达载体：适用于在受体细胞中表达外源适用于在受体细胞中表达外源基因的载体。基因的载体。主要元件：强启动子主要元件：强启动子 转录终止子转录终止子 SD SD顺序顺序 增强子增强子 翻译终止子翻译终止子 其它调控基因其它调控基因 第三节表达载体1.表达载体：适用于在受体细胞中21启动子：建立表达载体时，选择强启动子。启动子：建立表达载体时，选择强启动子。常见原核强启动子：常见原核强启动子：Plac：受：受Lac阻遏蛋白负调，受阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和启动子和Trp启动子的杂合启动子。启动子的杂合启动子。PL和和PR启动子：噬菌体早期左启动子：噬菌体早期左/右向启动子，右向启动子，受受噬菌体噬菌体cI基因负调控。温度诱导。基因负调控。温度诱导。启动子：建立表达载体时，选择强启动子。常见原核强启动子：22（1）融合型表达载体）融合型表达载体:融合蛋白融合蛋白 例如例如:pGEX系统系统 （2）非融合型表达蛋白载体）非融合型表达蛋白载体:天然完整天然完整蛋白蛋白 例如例如:pKK223-3 （3）分泌型克隆表达载体）分泌型克隆表达载体:产物可跨膜产物可跨膜分泌至胞周间隙分泌至胞周间隙 例如例如:pIN-III系统系统2.常见的表达载体常见的表达载体（1）融合型表达载体:融合蛋白2.常见的表达载体23（1）融合型表达载体）融合型表达载体 PSDForeign DNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因（1）融合型表达载体PSDForeignDNA融合型表达24位相载体位相载体-含有含有3种读码框的系列载体种读码框的系列载体Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物切割方便：产物切割方便：pGEX-1T pGEX-2T pGEX-3T位相载体位相载体位相载体-含有3种读码框的系列载体Ptac：IPTG诱25（2）非融合型表达载体）非融合型表达载体 PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因（2）非融合型表达载体PSDForeignDNA非融合型26非融合型表达载体非融合型表达载体-pPL-LamdaPL启动子启动子-温度温度诱导诱导插入位点插入位点-HpaI非融合型表达载体-pPL-LamdaPL启动子-温27外源基因的表达课件28（3）分泌型表达载体：）分泌型表达载体：1、主要元件：、主要元件：启动子和启动子和SD序列序列信信号号肽肽序序列列：SD下下游游，编编码码信信号号肽肽，可引导蛋白跨膜可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。、优点：分泌表达，避免降解。（3）分泌型表达载体：29分泌型表达载体分泌型表达载体-pINIII-ompA1分泌型表达载体-pINIII-ompA130分泌型融合表达载体分泌型融合表达载体-pEZZ18分泌型融合表达载体-pEZZ1831第四节第四节 真核生物基因在原核表达真核生物基因在原核表达 系统中的表达系统中的表达一、外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：一、外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：1.删除内含子和删除内含子和5非编码区非编码区2.外源基因置于强启动子和外源基因置于强启动子和SD顺序控制下顺序控制下3.维持正确开放阅读框架（维持正确开放阅读框架（ORF）4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解5.调控外原基因的表达，防止表达产物对寄主菌的毒害。调控外原基因的表达，防止表达产物对寄主菌的毒害。第四节真核生物基因在原核表达32二、二、外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式表达产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞表达产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞外培养基中外培养基中,其表达形式有其表达形式有:（1 1）包涵体蛋白）包涵体蛋白 （2 2）融合蛋白）融合蛋白 （3 3）整合型外源蛋白）整合型外源蛋白 （4 4）分泌型外源蛋白。）分泌型外源蛋白。二、外源基因在大肠杆菌表达的形式33 外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。包涵体主要存在于细胞质中，在某些条件下也能包涵体主要存在于细胞质中，在某些条件下也能在细胞周质中形成。在细胞周质中形成。包涵体主要由蛋白质组成，并且大部分蛋白质为包涵体主要由蛋白质组成，并且大部分蛋白质为外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列，外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列，但空间构象却是错误的，因而一般没有生物学活性。但空间构象却是错误的，因而一般没有生物学活性。在包涵体中还含有受体细胞本身的一些表达产物，在包涵体中还含有受体细胞本身的一些表达产物，如如RNARNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。此外还包括码的蛋白等。此外还包括DNADNA、RNARNA和脂多糖等非蛋白和脂多糖等非蛋白分子。分子。（1 1）包涵体蛋白：）包涵体蛋白：外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚34 以包涵体形式表达的外源蛋白最突出以包涵体形式表达的外源蛋白最突出的优点是易于分离纯化，因为包涵体的水难的优点是易于分离纯化，因为包涵体的水难溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可与其他蛋白区分开来。即可与其他蛋白区分开来。包涵体对蛋白酶也表现出较好的抗性。包涵体对蛋白酶也表现出较好的抗性。外源基因的表达课件35将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框，以这种方式表达一起，但不改变两个基因阅读框，以这种方式表达的蛋白成为融合蛋白。的蛋白成为融合蛋白。受体菌蛋白位于受体菌蛋白位于NN端，外端，外源蛋白位于源蛋白位于CC端。端。外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋白的方式表外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋白的方式表达后达后:稳定性大大增加。稳定性大大增加。具有较高的水溶性和一定的生物学活性。具有较高的水溶性和一定的生物学活性。表达能以较高的效率进行并且易于分离纯化。表达能以较高的效率进行并且易于分离纯化。（2 2）融合蛋白）融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两36l在融合蛋白被表达之后，必须从融合蛋在融合蛋白被表达之后，必须从融合蛋白中将原核多肽去掉。常用的有化学降白中将原核多肽去掉。常用的有化学降解法及酶解法，一般而言，化学降解法解法及酶解法，一般而言，化学降解法缺乏选择特异性，且反应条件剧烈（如缺乏选择特异性，且反应条件剧烈（如溴化氰）；而酶解法特异性较高，但切溴化氰）；而酶解法特异性较高，但切割效率不高。割效率不高。在融合蛋白被表达之后，必须从融合蛋白中将原核多肽去掉。常用的37 将要表达的外源基因整合到染色体的将要表达的外源基因整合到染色体的特定位置上，使之成为染色体结构的一部分特定位置上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传和表达。而稳定地遗传和表达。为了获得含有整合基因的重组体，被选择为了获得含有整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些不能在受体细胞内进行自的载体一般是那些不能在受体细胞内进行自主复制的质粒主复制的质粒。（3 3）整合型外源蛋白：）整合型外源蛋白：将要表达的外源基因整合到染色体的特定位置上，38 分泌型蛋白是指外源基因的表达产物通过运输分泌型蛋白是指外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。以分泌型蛋白的形式表达外源基因具有以下优点：以分泌型蛋白的形式表达外源基因具有以下优点：(1)(1)简化了发酵后处理的纯化工艺；简化了发酵后处理的纯化工艺；(2)(2)减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的概率；减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的概率；(3)(3)通过对分泌表达的设计有利于形成正确的空间通过对分泌表达的设计有利于形成正确的空间构象，获得有较好生物学活性的蛋白质。构象，获得有较好生物学活性的蛋白质。外源基因以分泌型蛋白表达时，须在外源基因以分泌型蛋白表达时，须在N N端加入信端加入信号肽序列号肽序列(由由15153030个氨基酸组成个氨基酸组成)，对蛋白质分，对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。泌到细胞膜外起决定性作用。（4 4）分泌型外源蛋白）分泌型外源蛋白 分泌型蛋白是指外源基因的表达产物通过运输或分39三、影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素三、影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：1 1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。2 2、基因剂量：、基因剂量：3 3、核糖体结合位点：、核糖体结合位点：SDSD顺序与顺序与16srRNA316srRNA3末端互补程度。末端互补程度。AUGSDAUGSD间距离。间距离。三、影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：2、基因剂量：404、提高表达水平的手段、提高表达水平的手段（1 1）、选择合适载体，提高翻译水平）、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子强启动子-提高转录水平提高转录水平核糖体结合位点（核糖体结合位点（ATG-SDATG-SD）避免产物降解避免产物降解 ：分泌：分泌/融合表达融合表达 细菌蛋白酶抑制剂细菌蛋白酶抑制剂4、提高表达水平的手段41（2）、选择合适宿主）、选择合适宿主 Lac 启动子启动子-LacI菌菌PL/PR -cI857 溶源菌溶源菌 （3）、诱导表达）、诱导表达 温度诱导温度诱导-PL/PRIPTG的化学诱导的化学诱导-Plac、Ptac （4）、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解）、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解（2）、选择合适宿主（3）、诱导表达42lI.I.调整调整SDSD序列与序列与AUGAUG间的距离。间的距离。l II.II.用点突变的方法改变某些碱基。用点突变的方法改变某些碱基。l III.III.增加增加mRNAmRNA的稳定性。的稳定性。5.5.提高翻译水平提高翻译水平I.调整SD序列与AUG间的距离。5.提高43外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达。外源基因的表达。常用的方法有：常用的方法有：I.I.诱导表达诱导表达:使细菌的生长与外源基因使细菌的生长与外源基因的表达分开的表达分开。II.II.表达载体的诱导复制表达载体的诱导复制:将宿主菌的将宿主菌的生长和表达质粒的复制分开。生长和表达质粒的复制分开。III.III.表达分泌蛋白表达分泌蛋白 6.诱导表达减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的诱导表达减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平表达水平外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细44在大肠杆菌中表达的外源蛋白往往不够稳定，在大肠杆菌中表达的外源蛋白往往不够稳定，常被细菌的蛋白酶降解，因而会使外源基因的表常被细菌的蛋白酶降解，因而会使外源基因的表达水平大大降低。达水平大大降低。有效的解决方法有效的解决方法:I.I.克隆一段原核序列，表达融合蛋白。克隆一段原核序列，表达融合蛋白。II.II.采用某种突变菌株，保护表达蛋白采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解。不被降解。III.III.表达分泌蛋白。表达分泌蛋白。7.提高表达蛋白的稳定性，防止其降解提高表达蛋白的稳定性，防止其降解在大肠杆菌中表达的外源蛋白往往不够稳定，常被细菌的蛋白酶45五表达产物的检测：五表达产物的检测：1、特异性鉴定：、特异性鉴定：荧光抗体法荧光抗体法免疫沉淀法免疫沉淀法2、生物学活性鉴定、生物学活性鉴定 五表达产物的检测：46六六.大肠杆菌表达系统的问题大肠杆菌表达系统的问题l（1 1）原原核核细细胞胞内内蛋蛋白白表表达达后后，缺缺乏乏真真核核细细胞胞特有的加工后处理，如糖基化修饰。特有的加工后处理，如糖基化修饰。l（2 2）原原核核细细胞胞内内表表达达的的外外源源蛋蛋白白，常常以以不不溶溶性性的的包包涵涵体体形形式式存存在在，表表达达的的蛋蛋白白质质纯纯化化时时，必必须须经经过过变变性性、复复性性处处理理，才才能能恢恢复复其其生生物物活活性性，而而复复性性的的处处理理，对对分分子子量量大大的的尤尤其其是是分分子子内二硫键比较多的蛋白质，其效率非常低。内二硫键比较多的蛋白质，其效率非常低。六.大肠杆菌表达系统的问题47l（3 3）利利用用大大肠肠杆杆菌菌分分泌泌信信号号，可可以以将将外外源源蛋蛋白白分分泌泌到到周周质质或或分分泌泌到到培培养养基基中中，但但是是很很难难大大量量表表达达分分泌泌性性蛋蛋白白，产产量量不不高高，信信号号肽肽不不被被切切割或者不在特异位置上进行切割。割或者不在特异位置上进行切割。l（4 4）表表达达的的真真核核蛋蛋白白在在原原核核细细胞胞中中不不稳稳定定，容易被细菌蛋白酶破坏。容易被细菌蛋白酶破坏。l（5 5）表表达达的的真真核核基基因因，必必须须是是mRNAmRNA的的转转录录产产物物即即cDNAcDNA，不不能能表表达达基基因因组组DNADNA，因因为为真真核核基基因因一一般般有有内内含含子子，而而原原核核细细胞胞又又缺缺乏乏真真核核细细胞胞转转录录后后加加工工体体系系，转转录录的的mRNAmRNA中中的的内内含含子子不不能能被被切切除除，形形成成不不了了成成熟熟的的mRNAmRNA，因因此此，不不能能表表达真核蛋白质。达真核蛋白质。l（6 6）培培养养过过程程中中，产产生生的的内内毒毒素素难难以以除除尽尽，影响产品的纯度。影响产品的纯度。l（3）利用大肠杆菌分泌信号，可以将外源蛋白分泌到周质或分泌到48谢谢谢谢49外源基因的表达课件50