第二章基因工程制药新版课件

三、外源DNA和目的基因的分离和获得（一）基本操作方法（二）不同类别DNA的提取技术（三）目的基因的制备三、外源DNA和目的基因的分离和获得（一）基本操作方法1（一）基本操作方法 细胞内的细胞内的DNADNA大多与大多与RNARNA及蛋白质形成复合物，需及蛋白质形成复合物，需要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的DNADNA。1 1、操作条件、操作条件 2 2、提取方法、提取方法 3 3、分离方法、分离方法 4 4、纯化方法、纯化方法（一）基本操作方法 细胞内的DNA大多与RNA及蛋白质形成21、操作条件（1 1）含盐的中性缓冲液）含盐的中性缓冲液-以防在除去蛋白质的时以防在除去蛋白质的时候，使核酸产生不可逆转的变性。候，使核酸产生不可逆转的变性。（2 2）低温条件）低温条件-防止防止DNADNA在振荡、机械操作过程在振荡、机械操作过程中的降解、断裂。中的降解、断裂。（3 3）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、EDTAEDTA）-以防止以防止DNADNA被酶解。被酶解。1、操作条件（1）含盐的中性缓冲液-以防在除去蛋白质的32、提取方法（1 1）机械法）机械法-破坏细胞，释放出破坏细胞，释放出DNADNA。（2 2）酶消化法）酶消化法-破坏细胞，释放出破坏细胞，释放出DNADNA。（3 3）用酶使蛋白质变性）用酶使蛋白质变性-除去蛋白质之后，就剩除去蛋白质之后，就剩下下DNADNA。（4 4）用酚、去垢剂使蛋白质变性）用酚、去垢剂使蛋白质变性-除去蛋白质，除去蛋白质，剩下剩下DNADNA。2、提取方法（1）机械法-破坏细胞，释放出DNA。43、分离方法 是指从大分子的是指从大分子的混合物中分离出混合物中分离出DNADNA。具体方法。具体方法有：有：（1 1）DEAEDEAE纤维纤维素柱层析法。素柱层析法。（2 2）羟基磷灰石）羟基磷灰石柱层析法。柱层析法。3、分离方法 是指从大分子的混合物中分离出DNA。具体方法54、纯化方法分子筛层析法。凝胶电泳法。乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法。4、纯化方法分子筛层析法。6（二）不同类别DNA的提取技术1、质粒DNA的提取2、细菌染色体DNA的提取3、真核生物DNA的提取4、病毒DNA的提取（二）不同类别DNA的提取技术1、质粒DNA的提取71、质粒DNA的提取 细菌培养细菌培养 质粒扩增质粒扩增 菌落收集菌落收集 溶菌技术溶菌技术 分离技术分离技术-采用热或者碱使采用热或者碱使DNADNA变性变性变性变性，然后再进行，然后再进行冷却或者恢复到冷却或者恢复到中性中性中性中性PHPH值值值值，由于质粒，由于质粒DNADNA易于复性，易于复性，而染色体而染色体DNADNA则不易复性、会沉淀下来则不易复性、会沉淀下来 提纯技术提纯技术-采用溴乙锭密度梯度离心、二碘丙锭的采用溴乙锭密度梯度离心、二碘丙锭的氯化铯密度梯度离心，质粒氯化铯密度梯度离心，质粒DNADNA插入染料区带较多、插入染料区带较多、而染色体而染色体DNADNA插入染料区带则较少。从而可以分离插入染料区带则较少。从而可以分离。1、质粒DNA的提取 细菌培养质粒扩增菌82、细菌染色体DNA的提取 采用冻融、溶菌酶、采用冻融、溶菌酶、EDTAEDTA处理、去垢剂处理使得细胞裂解。处理、去垢剂处理使得细胞裂解。裂解液用胰裂解液用胰RNaseRNase和蛋白酶处理，使和蛋白酶处理，使RNARNA和蛋白质降解。和蛋白质降解。残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿=1=1：1 1）溶液进）溶液进行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机相与水相之间。相与水相之间。含含DNADNA的水相用的水相用乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀，以获得，以获得丝状的丝状的丝状的丝状的DNADNA沉淀物，沉淀物，沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂。沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂。最后采用氯化铯（最后采用氯化铯（CsCl2CsCl2）进行密度梯度离心法分离。）进行密度梯度离心法分离。2、细菌染色体DNA的提取 采用冻融、溶菌酶、EDTA处理93、真核生物DNA的提取（1 1 1 1）提取方法）提取方法）提取方法）提取方法 同同同同2 2 2 2（2 2 2 2）注意事项）注意事项）注意事项）注意事项 对于纯度要求较高的对于纯度要求较高的DNADNA，必须采用，必须采用氯化铯氯化铯氯化铯氯化铯（CsCl2CsCl2CsCl2CsCl2）密度梯度离心法）密度梯度离心法）密度梯度离心法）密度梯度离心法进行分离。进行分离。操作时要防止丢失线粒体操作时要防止丢失线粒体DNADNA、和卫星、和卫星DNADNA等密度等密度异常成份。异常成份。要防止低分子量的要防止低分子量的DNADNA的污染。的污染。3、真核生物DNA的提取（1）提取方法104、病毒DNA的提取 用少量用少量噬菌体感染宿主，然后用大量的培养噬菌体感染宿主，然后用大量的培养基进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被基进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被噬菌体感染。此法适应于制备大多数噬菌体。噬菌体感染。此法适应于制备大多数噬菌体。4、病毒DNA的提取 用少量噬菌体感染宿主，然后用大量的11（三）目的基因的制备目的基因：目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。（三）目的基因的制备目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的12需要克隆的需要克隆的DNADNA片段片段编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构和功研究某基因结构和功能的关系能的关系研究某基因与疾病研究某基因与疾病的关系的关系需要克隆的DNA片段编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系131、物理分离法2、化学合成法3、逆转录法4、RT-PCR技术法5、筛选新基因的其它新方法1、物理分离法141、物理分离法（1）分离方法（2）物理分离法实例1、物理分离法（1）分离方法15（1）分离方法 直接用酶切割、或者机械破碎分离法。DNA经过直接用酶切割、或者机械破碎之后，可产生编码不同基因的DNA片段，由于不同基因中的G-C碱基对含量、与A-T碱基对含量有差异，结果就导致它们之间的密度不同，因此通过分离技术分离技术+观察技术观察技术+鉴定技术鉴定技术结合，就能将其分离。分离技术-平衡等密度离心法、凝胶电泳法、溴乙锭染色法。观察技术-荧光显微镜观察。鉴定技术-核酸杂交法、瑟萨恩印迹转移技术。（1）分离方法 直接用酶切割、或者机械破碎分离法。DNA经16物理学密度梯度离心法物理学密度梯度离心法 不同不同不同不同DNADNA片片片片段，其密度段，其密度段，其密度段，其密度不同，借此不同，借此不同，借此不同，借此进行密度梯进行密度梯进行密度梯进行密度梯度离心，实度离心，实度离心，实度离心，实现分离。现分离。现分离。现分离。物理学密度梯度离心法 不同DNA片段，其密度不同，借此进17凝胶电泳分离技术凝胶电泳分离技术n n通过凝胶电泳，通过凝胶电泳，通过凝胶电泳，通过凝胶电泳，分段收集大小不分段收集大小不分段收集大小不分段收集大小不同的同的同的同的DNADNA片段，片段，片段，片段，n n然后用快速转化然后用快速转化然后用快速转化然后用快速转化法来检验其目的法来检验其目的法来检验其目的法来检验其目的蛋白质，进行基蛋白质，进行基蛋白质，进行基蛋白质，进行基因定位。实现分因定位。实现分因定位。实现分因定位。实现分离。离。离。离。凝胶电泳分离技术通过凝胶电泳，分段收集大小不同的DNA片段，18（2）物理分离法实例海胆组蛋白基因海胆组蛋白基因苏芸金杆菌晶体蛋白基因苏芸金杆菌晶体蛋白基因多角病毒的多角体蛋白基因多角病毒的多角体蛋白基因-半乳糖苷酶蛋白基因半乳糖苷酶蛋白基因（2）物理分离法实例海胆组蛋白基因192、化学合成法（1）化学合成法的概念（2）化学合成法的优缺点（3）化学合成法的实例2、化学合成法（1）化学合成法的概念20（1）化学合成法的概念和分类 概念概念-以以5或或3-脱氧核苷酸、脱氧核苷酸、5-磷酰基寡核苷酸片段为磷酰基寡核苷酸片段为原料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学原料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学合成法。合成法。1976年年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并提出了用化学方法合成基因的设想，并于于1979年在年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。基因的论文。要求：要求：1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、分子量较小的目的基因的制备分子量较小的目的基因的制备（1）化学合成法的概念和分类 概念-以5或3-脱21第二章基因工程制药新版课件22DNADNA多聚酶多聚酶Klenow Klenow 片段片段+dNTPs+dNTPs磷酸化磷酸化退火退火分子克隆分子克隆磷酸化磷酸化退火退火DNADNA多聚酶多聚酶Klenow Klenow 片段片段限制性内切酶限制性内切酶分子克隆分子克隆基因的化学基因的化学-酶促合成图解酶促合成图解DNA多聚酶Klenow 片段+dNTPs磷酸化退火分子克23（2）化学合成法的优缺点n n化学合成法的优点化学合成法的优点化学合成法的优点化学合成法的优点-随意性强随意性强随意性强随意性强，可通过人工设计，进行，可通过人工设计，进行，可通过人工设计，进行，可通过人工设计，进行合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有力的手段，力的手段，力的手段，力的手段，较小分子蛋白质或多肽编码的基因，较小分子蛋白质或多肽编码的基因，15-30bp效果最好，效果最好，1天完成。现在可达到一次合成寡核苷天完成。现在可达到一次合成寡核苷酸片段长达酸片段长达50-60bpn n化学合成法的缺点：化学合成法的缺点：化学合成法的缺点：化学合成法的缺点：（1 1）反应专一性不强、副反应多）反应专一性不强、副反应多）反应专一性不强、副反应多）反应专一性不强、副反应多;（2 2）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低;（3 3）无法合成太长的基因，无法合成太长的基因，无法合成太长的基因，无法合成太长的基因，不能大于不能大于60bp;（4 4）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子带来很大困难，带来很大困难，带来很大困难，带来很大困难，人工合成时，遗传密码的简并性可导致人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变中性突变;（5 5）合成）合成）合成）合成费用较高费用较高费用较高费用较高。（2）化学合成法的优缺点化学合成法的优点-随意性强，可24（3）化学合成法的实例 讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产物的基因。主要有以下种类：物的基因。主要有以下种类：细菌酪氨酸细菌酪氨酸t-RNAt-RNA人生长激素人生长激素干扰素干扰素干扰素干扰素血管紧张素血管紧张素人胰岛素人胰岛素人生长激素抑制释放因子人生长激素抑制释放因子溶菌酶溶菌酶组织血纤维蛋白溶酶原激活剂组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（3）化学合成法的实例 讫今为止，通过化学合成方法已经了近253、逆转录法（1）逆转录法的理由（2）逆转录法的理论依据（3）逆转录所产生的DNA的特性（4）逆转录法的具体步骤（5）逆转录法的实例3、逆转录法（1）逆转录法的理由26（1 1）逆转录法的理由）逆转录法的理由 真核生物的基因不能直接分离，原因：真核生物的基因不能直接分离，原因：真核生物的基因不能直接分离，原因：真核生物的基因不能直接分离，原因：（A A）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的十万十万十万十万千万分之一千万分之一千万分之一千万分之一，数量十分微小，这就导致直接从真核，数量十分微小，这就导致直接从真核，数量十分微小，这就导致直接从真核，数量十分微小，这就导致直接从真核生物染色体上制备目的基因的生物染色体上制备目的基因的生物染色体上制备目的基因的生物染色体上制备目的基因的极为困难极为困难极为困难极为困难。（B B）真核基因内一般都有）真核基因内一般都有）真核基因内一般都有）真核基因内一般都有内含子内含子内含子内含子，会阻止基因的不正，会阻止基因的不正，会阻止基因的不正，会阻止基因的不正常表达。常表达。常表达。常表达。（C C）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞中缺乏中缺乏中缺乏中缺乏mRNAmRNA转录后的加工系统，因此，从真核基因转录后的加工系统，因此，从真核基因转录后的加工系统，因此，从真核基因转录后的加工系统，因此，从真核基因转录出的转录出的转录出的转录出的mRNAmRNA无法提到加工处理，也就不能成为成无法提到加工处理，也就不能成为成无法提到加工处理，也就不能成为成无法提到加工处理，也就不能成为成熟的熟的熟的熟的mRNAmRNA。（1）逆转录法的理由 真核生物的基因不能直接分离，原因27（2）逆转录法的理论依据逆转录法就是从逆转录法就是从mRNAcDNADNAmRNAProteinmRNAcDNADNAmRNAProtein的方的方法。法。（A A）提取真核细胞的）提取真核细胞的mRNAmRNA。（B B）以）以mRNAmRNA为模板，在逆转录酶有作用下，为模板，在逆转录酶有作用下，反转录合成反转录合成cDNAcDNA第一链。第一链。（C C）再以）再以cDNAcDNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，合成下，合成DNADNA互补双链。互补双链。（2）逆转录法的理论依据逆转录法就是从mRNAcDNAD28（3）逆转录所产生的DNA的特性（A A）只反映）只反映mRNAmRNA经过加工之后的经过加工之后的基因编码序基因编码序基因编码序基因编码序列列列列，而不象真核生物的原始，而不象真核生物的原始DNADNA那样具有复杂那样具有复杂的信息承载。的信息承载。（B B）不含内含子不含内含子不含内含子不含内含子，可以在任何场合进行表达。，可以在任何场合进行表达。（3）逆转录所产生的DNA的特性（A）只反映mRNA经过加工29（4）逆转录法的具体步骤A A、mRNAmRNA的纯化的纯化B B、cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成C C、cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成D D、cDNAcDNA的克隆和重组的克隆和重组E E、将重组体导入宿主细胞、将重组体导入宿主细胞F F、cDNAcDNA文库的鉴定文库的鉴定G G、目的、目的cDNAcDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定H H、cDNAcDNA目的基因的阳性克隆的鉴定和验证技术目的基因的阳性克隆的鉴定和验证技术（4）逆转录法的具体步骤A、mRNA的纯化30A、mRNA的纯化 mRNA mRNA的的33端端端端常常含常常含polyApolyA，它能够吸附在寡聚，它能够吸附在寡聚脱氧胸腺苷酸脱氧胸腺苷酸Oligo dT-Oligo dT-纤维素纤维素纤维素纤维素上，借此可以将上，借此可以将mRNAmRNA与其它与其它RNARNA进行分离。进行分离。当当RNARNA提取液流经寡聚脱氧胸腺苷酸提取液流经寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-Oligo dT-纤纤维素柱时，在维素柱时，在高盐缓冲液高盐缓冲液高盐缓冲液高盐缓冲液的作用下，的作用下，mRNAmRNA被特异被特异性地吸附在柱上，其它性地吸附在柱上，其它RNARNA成份则被冲刷走掉，成份则被冲刷走掉，最后，用最后，用低盐溶液低盐溶液低盐溶液低盐溶液或者或者蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水冲刷纤维素柱，冲刷纤维素柱，mRNAmRNA就被洗脱下来。就被洗脱下来。经过经过2-32-3次寡聚脱氧胸腺苷酸次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-Oligo dT-纤维素柱之纤维素柱之后，就可得到较高纯度的后，就可得到较高纯度的mRNAmRNA。A、mRNA的纯化 mRNA的3端常常含p31 mRNA的分离Oligo-dTOligo-dT纤维素柱纤维素柱Oligo-dTOligo-dT磁珠法磁珠法 mRNA的分离Oligo-dT纤维素柱Oligo-dT磁珠32B、cDNA第一链的合成 由于由于mRNAmRNA的的33端常含端常含polyApolyA，所以可用寡聚脱，所以可用寡聚脱氧胸腺苷酸氧胸腺苷酸Oligo dTOligo dT做引物做引物做引物做引物，在，在逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶催化催化下，合成下，合成cDNAcDNA。为测算为测算cDNAcDNA的合成效率，可在合成体系中加的合成效率，可在合成体系中加入放射性标记的入放射性标记的dNTPdNTP，如，如-32P-dATP-32P-dATP、-32P-32P-dCTPdCTP，这样就可通过放射自显影技术，来计算，这样就可通过放射自显影技术，来计算dNTPdNTP的的渗入量渗入量渗入量渗入量。B、cDNA第一链的合成 由于mRNA的3端常含pol33C、cDNA第二链的合成 先用先用碱水解碱水解碱水解碱水解的方法，或用的方法，或用RNaseHRNaseH酶解的方法，酶解的方法，除去除去cDNA-mRNAcDNA-mRNA杂交链中的杂交链中的mRNAmRNA链。链。然后，再以然后，再以cDNAcDNA第一链为模板，在第一链为模板，在DNADNA聚合聚合酶的作用下，合成酶的作用下，合成DNADNA互补双链。互补双链。C、cDNA第二链的合成 先用碱水解的方法，或用RNas34mRNAmRNA-cDNA Hybridnick逆转录酶逆转录酶RNase H DNA聚合酶聚合酶 T4连接酶连接酶T4 DNA聚合酶处理形成平头末端聚合酶处理形成平头末端NickTranslation cDNA的合成方法mRNAmRNA-cDNAnick逆转录酶RNase H 35D、cDNA的克隆和重组（D1）、用于cDNA的克隆的载体（D2）、cDNA的片段与载体的连接D、cDNA的克隆和重组（D1）、用于cDNA的克隆的载体36（D1）、用于cDNA的克隆的载体当当cDNAcDNA的插入片段的插入片段小于小于小于小于10Kb10Kb时，应选用时，应选用质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体。当当cDNAcDNA的插入片段的插入片段大于大于大于大于10Kb10Kb时，应选用时，应选用噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体。表达型表达型表达型表达型-是指重组后插入的是指重组后插入的cDNAcDNA能够经过转录、翻译，最终能够经过转录、翻译，最终合成蛋白质。合成蛋白质。非表达型非表达型非表达型非表达型-是指重组后插入的是指重组后插入的cDNAcDNA不能经过转录、转译，合不能经过转录、转译，合成蛋白质。成蛋白质。质粒质粒质粒质粒噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体表达型表达型表达型表达型PUCPUCgt11gt11非表达型非表达型非表达型非表达型pBR322pBR322gt10gt10（D1）、用于cDNA的克隆的载体当cDNA的插入片段小于137（D2）、cDNA的片段与载体的连接（1 1）借助同型多聚体尾巴的连接方法）借助同型多聚体尾巴的连接方法-用用3-3-末端脱氧核苷末端脱氧核苷末端脱氧核苷末端脱氧核苷酸转移酶酸转移酶酸转移酶酸转移酶催化，在催化，在cDNAcDNA的的3 3 末端加上末端加上polyGpolyG（或者（或者（或者（或者polyTpolyT）的尾巴、而在载体的末端加上）的尾巴、而在载体的末端加上polyCpolyC（或者（或者（或者（或者 polyApolyA）的的尾巴，就能够实现尾巴，就能够实现cDNAcDNA的片段与载体的片段与载体DNADNA的连接。的连接。（2 2）加人工接头的连接法）加人工接头的连接法-所谓加所谓加人工接头人工接头人工接头人工接头的连接法，是的连接法，是指用采用指用采用T4DNAT4DNA连接酶，在连接酶，在cDNAcDNA的末端加上人工接头，的末端加上人工接头，然后再使用特定的限制酶来然后再使用特定的限制酶来切出粘性末端切出粘性末端切出粘性末端切出粘性末端，从而实现与载，从而实现与载体体DNADNA的连接。的连接。（D2）、cDNA的片段与载体的连接（1）借助同型多聚体尾巴38E、将重组体导入宿主细胞 噬菌体感染大肠杆菌形成噬菌斑噬菌斑。以便于使得质粒转化到大肠杆菌内。E、将重组体导入宿主细胞 噬菌体感染大肠杆菌形成噬菌斑。39F、cDNA文库的鉴定 表型鉴定法：表型鉴定法：（1 1）抗性基因失活法）抗性基因失活法（2 2）菌落颜色）菌落颜色 （3 3）噬菌斑颜色改变）噬菌斑颜色改变 分子鉴定法：分子鉴定法：（1 1）凝胶电泳）凝胶电泳（2 2）分子杂交）分子杂交（3 3）DNADNA序列测定序列测定F、cDNA文库的鉴定 表型鉴定法：（1）抗性基因失40G、目的cDNA克隆的分离和鉴定（1 1）核酸探针杂交法核酸探针杂交法核酸探针杂交法核酸探针杂交法-根据目的蛋白质纯品的根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡合成相应的单链寡合成相应的单链寡合成相应的单链寡核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸作为作为探针探针探针探针，从，从cDNAcDNA文库分离特异的文库分离特异的cDNAcDNA克隆。克隆。G、目的cDNA克隆的分离和鉴定（1）核酸探针杂交法-41（2 2）特异亲合鉴定法特异亲合鉴定法特异亲合鉴定法特异亲合鉴定法-对于那些表达水平低对于那些表达水平低,不能不能纯化得到足量蛋白质的进行序列测定纯化得到足量蛋白质的进行序列测定,利用一种能利用一种能与与靶蛋白靶蛋白靶蛋白靶蛋白特异结合的特异结合的配体配体配体配体,从已构建的表达型重组从已构建的表达型重组文库中文库中筛选筛选筛选筛选该蛋白的基因。该蛋白的基因。已知的可在体内与靶蛋白已知的可在体内与靶蛋白相互作用相互作用相互作用相互作用的蛋白的蛋白/小分小分子化合物子化合物 抗靶蛋白抗原决定簇的抗靶蛋白抗原决定簇的IgGIgG 可被靶蛋白识别的小段可被靶蛋白识别的小段DNADNA序列序列（2）特异亲合鉴定法-对于那些表达水平低,不能纯化得到42（5）逆转录法的实例 通过逆转录法，已经合成了下列基因克隆株：（1）人生长激素（2）-人干扰素（3）-人干扰素（4）人尿激酶。（5）逆转录法的实例 通过逆转录法，已经合成了下列基因克隆株434、RT-PCR技术法1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。特点：mRNA反转录合成cDNA第一链后，不用不用再合成cDNA第二链只是在特异性引物作用下，扩增近g级级的特异cDNA产物通过RT-PCR成功克隆的基因：IL-2,3,6,9、G-CSF、TNF、IFN-等4、RT-PCR技术法1985，PCR发明以后，RT-PCR44是一种在体外利用酶促反应大量获得特是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组异序列的基因组DNA或或cDNA的专门技术，又的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。称为无细胞的分子克隆。聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或45模板模板DNA引物引物4种种dNTPTaq DNA聚合酶聚合酶含含Mg2+的缓冲液。的缓冲液。PCR的反应体系模板DNAPCR的反应体系46（1 1）变性变性变性变性，加热至，加热至，加热至，加热至95 95，使模板，使模板，使模板，使模板DNADNA解开成单链；解开成单链；解开成单链；解开成单链；（2 2）退火退火退火退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3 3）延伸延伸延伸延伸，温度升至，温度升至，温度升至，温度升至72 72 ，DNADNA聚合酶以聚合酶以聚合酶以聚合酶以4 4种种种种dNTPdNTP为底物，在引物的为底物，在引物的为底物，在引物的为底物，在引物的3 3-OH-OH上，合成与模板互补的上，合成与模板互补的上，合成与模板互补的上，合成与模板互补的DNADNA新链。新链。新链。新链。PCR的基本反应步骤及原理（1）变性，加热至95，使模板DNA解开成单链；PCR的47PCR反应条件变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR反应条件变性延伸退火485 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCR基本工作原理基本工作原理5Primer 15Primer 2Cycle 2Cyc49Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。Cycle 35 5555 5 555 550第二章基因工程制药新版课件51第二章基因工程制药新版课件525 5、筛选新基因的其它新方法、筛选新基因的其它新方法 岛屿获救岛屿获救PCRPCR法法nCpG岛富有G-C(60%)，有高含量的CpG二核苷酸。nCpG 岛含有罕见的Eag I、Sac I、BssHI酶切位点，每个酶在CpG岛的酶切频率为1-2次/岛。nCpG岛是很多基因5端的标志。n对GenBank数据库375个基因的统计，几乎所有的看家基因与40%的组织特异性基因与CpG 岛相关联。nAlu重复较均一的散布在基因组，约每3kb出现1次。由由CpG 岛延伸至相邻的岛延伸至相邻的Alu重复的探针应能重复的探针应能用来分离与用来分离与CpG 岛相关联的基因。岛相关联的基因。5、筛选新基因的其它新方法 岛屿获救53 选泡状接头及泡状引物是为了保证选泡状接头及泡状引物是为了保证PCR反应的选择反应的选择性。泡状引物的序列与泡状接头里非互补区的一条性。泡状引物的序列与泡状接头里非互补区的一条链的序列相同。由于泡状引物不能与泡状接头里对链的序列相同。由于泡状引物不能与泡状接头里对应的链互补，只有应的链互补，只有Alu引物能够启动引物能够启动PCR反应进行第反应进行第一个扩增循环，其后两个引物均能参与扩增。这样，一个扩增循环，其后两个引物均能参与扩增。这样，不含不含Alu重复的重复的DNA 片段将不能被扩增。片段将不能被扩增。用罕见的限制酶切酵母人工染色体用罕见的限制酶切酵母人工染色体DNADNA，酶切片断连上，酶切片断连上泡状接头，用泡状引物和泡状接头，用泡状引物和AluAlu特异引物特异引物PCRPCR扩增。扩增。所扩所扩片断经琼脂糖凝胶电泳分离，找出特异片段来筛选片断经琼脂糖凝胶电泳分离，找出特异片段来筛选cDNAcDNA文库文库。选泡状接头及泡状引物是为了保证PCR反应的选择性。泡54酶切片断连上泡状接头酶切片断连上泡状接头用泡状引物和用泡状引物和Alu特异引物特异引物PCR扩增扩增罕见的限制酶切罕见的限制酶切凝胶分离特异片段筛选凝胶分离特异片段筛选cDNA文库文库获得特异片段获得特异片段酶切片断连上泡状接头用泡状引物和Alu特异引物PCR扩增罕见55 此法会漏掉不含CpG岛的基因。如果Alu重复与CpG 岛相距太远而无法PCR扩增，相应的基因也会漏掉。此法对分离基因此法对分离基因5端十分有利，而基因端十分有利，而基因5端常是最难克隆的。端常是最难克隆的。此法会漏掉不含CpG岛的基因。56粘粒粘粒DNA库经限制酶酶切库经限制酶酶切(也可不用酶切，用超声处理也可不用酶切，用超声处理并补平并补平)并连上接头，然后用并连上接头，然后用5生物素标记的引物生物素标记的引物(与接头与接头1个臂的序列相同个臂的序列相同)做做PCR扩扩增。增。cDNA文库插入片断也用载文库插入片断也用载体引物行体引物行PCR，然后与生物，然后与生物素标记的基因组片段杂交。素标记的基因组片段杂交。基因组基因组DNA-cDNA复合物用复合物用链霉抗生物素蛋白覆盖的磁链霉抗生物素蛋白覆盖的磁珠捕捉。除掉未结合的非特珠捕捉。除掉未结合的非特异性异性cDNA。捕捉到的。捕捉到的cDNA洗脱后用载体引物行洗脱后用载体引物行PCR扩扩增。增。表达序列的磁珠捕捉法表达序列的磁珠捕捉法是具有代表是具有代表性，利用磁场力对性，利用磁场力对cDNA文库中目文库中目的基因进行富集的一种方法。的基因进行富集的一种方法。编码序列富集法编码序列富集法粘粒DNA库经限制酶酶切(也可不用酶切，用超声处理并补平)并57鸟枪法鸟枪法n n先将供体细胞的染色体先将供体细胞的染色体先将供体细胞的染色体先将供体细胞的染色体DNADNA，经过酶处理、或，经过酶处理、或，经过酶处理、或，经过酶处理、或者物理学方法切割成基因水平的很多片段。者物理学方法切割成基因水平的很多片段。者物理学方法切割成基因水平的很多片段。者物理学方法切割成基因水平的很多片段。将每一片段和载体进行重组。将每一片段和载体进行重组。将每一片段和载体进行重组。将每一片段和载体进行重组。转化到受体菌中进行基因增殖。转化到受体菌中进行基因增殖。转化到受体菌中进行基因增殖。转化到受体菌中进行基因增殖。采用适当的筛选方法，从众多的菌落中选出带采用适当的筛选方法，从众多的菌落中选出带采用适当的筛选方法，从众多的菌落中选出带采用适当的筛选方法，从众多的菌落中选出带有目的基因的菌株。有目的基因的菌株。有目的基因的菌株。有目的基因的菌株。从选择出的菌株中回收重组从选择出的菌株中回收重组从选择出的菌株中回收重组从选择出的菌株中回收重组DNADNA鸟枪法先将供体细胞的染色体DNA，经过酶处理、或者物理学方法58第二章基因工程制药新版课件59鸟枪法的优缺点鸟枪法的优缺点n n鸟枪法的优点鸟枪法的优点-采用鸟枪射击去命中采用鸟枪射击去命中“预定目标预定目标”的原理，该方法能够绕过直的原理，该方法能够绕过直接分离目的基因的难关。接分离目的基因的难关。n n鸟枪法的难点鸟枪法的难点-必须有一种有效的目的必须有一种有效的目的基因检测方法，常用基因检测方法，常用mRNA作为探针，作为探针，进行原位杂交法检验。进行原位杂交法检验。鸟枪法的优缺点鸟枪法的优点-采用鸟枪射击去命中“预定目60 功能克隆法功能克隆法可采用基因敲除技术、RNAi技术、酵母双杂交技术及流式细胞术，从基因水平、表达调控水平、蛋白质水平和细胞水平获得基因功能信息基因功能信息。功能克隆法可采用基因敲除技术、RNAi技术、酵母双杂交技术61 差异显示技术差异显示技术利用mRNA差异显示技术、减数PCR技术、差减杂交技术寻找新基因。如通过比较正常组织和肿瘤组织某些基因和蛋白质的差异表达，寻找在肿瘤细胞中的高表达基因表达基因或沉默基因沉默基因，从而推测可能是癌基因癌基因或抑癌抑癌基因基因。差异显示技术利62差异展示差异展示PCR法法（DD-PCR)原理：将具有两组细胞在某原理：将具有两组细胞在某一条件下可表达的一条件下可表达的mRNA 群群体通过逆转录方法变成相应体通过逆转录方法变成相应的的cDNA 群体，以此为模板，群体，以此为模板，利用一对特殊引物，在一定利用一对特殊引物，在一定条件下进行条件下进行PCR扩增，得到扩增，得到与与mRNA相对应的相对应的DNA。通。通过变性聚丙烯酰胺电泳，检过变性聚丙烯酰胺电泳，检测差异条带。测差异条带。差异展示PCR法（DD-PCR)原理：将具有两组细胞在某一条63构建构建cDNAcDNA文库文库 依据表达序列标签EST，设计引物用PCR技术扩增基因组中特异片段。构建cDNA文库 依据表达序列标签EST，设计引物用P64四、外源四、外源DNADNA与载体与载体DNADNA的切割与连接的切割与连接 DNA DNA DNA DNA连接连接连接连接-目的基因目的基因目的基因目的基因DNADNADNADNA片段与载体片段与载体片段与载体片段与载体DNADNADNADNA，在，在，在，在DNADNADNADNA连接连接连接连接酶作用下，通过形成磷酸二酯键，最终构成重组酶作用下，通过形成磷酸二酯键，最终构成重组酶作用下，通过形成磷酸二酯键，最终构成重组酶作用下，通过形成磷酸二酯键，最终构成重组DNADNADNADNA分分分分子的过程，称为子的过程，称为子的过程，称为子的过程，称为DNADNADNADNA的连接。的连接。的连接。的连接。粘接法粘接法粘接法粘接法-具有互补粘性末端的目的基因，与载体具有互补粘性末端的目的基因，与载体具有互补粘性末端的目的基因，与载体具有互补粘性末端的目的基因，与载体DNADNADNADNA，在，在，在，在DNADNADNADNA连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为粘结法。具体有粘结法。具体有粘结法。具体有粘结法。具体有插入灭活法插入灭活法插入灭活法插入灭活法、定向克隆法定向克隆法定向克隆法定向克隆法、载体脱磷载体脱磷载体脱磷载体脱磷克隆法克隆法克隆法克隆法、同聚接尾法同聚接尾法同聚接尾法同聚接尾法、双接头法双接头法双接头法双接头法、合成连接一步法合成连接一步法合成连接一步法合成连接一步法。平接法平接法平接法平接法-具有具有具有具有3-3-3-3-羟基、和羟基、和羟基、和羟基、和5-5-5-5-磷酰基的平齐末端的磷酰基的平齐末端的磷酰基的平齐末端的磷酰基的平齐末端的DNADNADNADNA之间，在之间，在之间，在之间，在T4-DNAT4-DNAT4-DNAT4-DNA连接酶连接酶连接酶连接酶的作用下，通过形成共价键结的作用下，通过形成共价键结的作用下，通过形成共价键结的作用下，通过形成共价键结合，称为平结法。合，称为平结法。合，称为平结法。合，称为平结法。下面具体讲解下面具体讲解下面具体讲解下面具体讲解6 6 6 6种方法。种方法。种方法。种方法。四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 DNA连接-65（一）、插入灭活法1 1、定义与方法、定义与方法2 2、例子、例子3 3、优缺点、优缺点（一）、插入灭活法1、定义与方法661、定义与方法 定义定义-将外源性基因插入到载体的选择性基因将外源性基因插入到载体的选择性基因区域（标记区域）、并使这一选择性标记区域失区域（标记区域）、并使这一选择性标记区域失活的连接法，称为活的连接法，称为插入灭活法插入灭活法插入灭活法插入灭活法。方法方法-将外源性将外源性DNADNA与质粒用同一限制酶消化，与质粒用同一限制酶消化，并且限制酶的切割位点是在标记基因区域，当目并且限制酶的切割位点是在标记基因区域，当目的基因插入标记区域时，就使得标记基因失去表的基因插入标记区域时，就使得标记基因失去表达作用。达作用。1、定义与方法 定义-将外源性基因插入到载体的选择性672 2、例子2、例子68插入失活蓝白斑筛选技术根据插入失活原理，筛选重组子。由于外源基因的插入，导致LacZ失去活性，菌落显白色，而未插入未插入重组子的菌落显蓝色蓝色。插入失活蓝白斑筛选技术根据插入失活原理，筛选重组子。由于外源693、优缺点优点-比较简单简单，容易操作。缺点-杂合重组率重组率低，在重组的产物中除了产生同时嵌合体重组DNA之外，还混有（1）pBR322环合DNA、（2）目的基因环合DNA、（3）pBR322线性DNA、（4）目的基因线性DNA。3、优缺点优点-比较简单，容易操作。70（二）、定向克隆法1、定义与方法2、连接方式3、优缺点（二）、定向克隆法1、定义与方法711 1、定义与方法（1 1）定义）定义-利用特异性的单一切点的限制酶，将目的基因按利用特异性的单一切点的限制酶，将目的基因按正确方向正确方向正确方向正确方向插入到载体插入到载体DNADNA的方法，称为的方法，称为定向克隆法定向克隆法定向克隆法定向克隆法。（2 2 2 2）操作依据操作依据操作依据操作依据-质粒载体一般都有多个限制酶的单一切点。质粒载体一般都有多个限制酶的单一切点。（3 3）方法）方法-将外源将外源DNADNA、pBR322pBR322同时用同时用Hihd-IIIHihd-III、BamH-IBamH-I进进行切割，那末，外源性目的基因、行切割，那末，外源性目的基因、pBR322pBR322载体就会同时产生载体就会同时产生出出Hihd-IIIHihd-III粘性末端、粘性末端、BamH-IBamH-I粘性末端。在进行退火时，外粘性末端。在进行退火时，外源性目的基因和载体之间就会按照粘性末端互补的原则进行源性目的基因和载体之间就会按照粘性末端互补的原则进行连接。连接。1、定义与方法（1）定义-利用特异性的单一切点的限制酶72 (1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接2 2、连接、连接方式 (1)同一限制酶切位点连接2、连接方式73第二章基因工程制药新版课件74第二章基因工程制药新版课件753、优缺点优点优点-在连接过程中，只要外源性目的基因、载在连接过程中，只要外源性目的基因、载体之间粘性末端不互补，就不会产生自身环化现体之间粘性末端不互补，就不会产生自身环化现象。象。缺点：缺点：（1 1）若外源性基因不能以正确的方向插入到载体）若外源性基因不能以正确的方向插入到载体之中，则重组之中，则重组DNADNA在宿主中就不能表达。在宿主中就不能表达。（2 2）反应过程中仍然会产生自身线性聚合体。）反应过程中仍然会产生自身线性聚合体。3、优缺点优点-在连接过程中，只要外源性目的基因、载体76（三）、载体脱磷克隆法1 1、定义定义定义定义-载体载体DNADNA经过限制酶切割之后，再使用经过限制酶切割之后，再使用碱性磷酸碱性磷酸碱性磷酸碱性磷酸酯酯酯酯酶水解，除去酶水解，除去5-5-磷酰基，然后再与目的基因连接的方法，磷酰基，然后再与目的基因连接的方法，称为载体脱磷克隆法。称为载体脱磷克隆法。2 2、优点优点优点优点：（1 1）载体脱磷克隆法）载体脱磷克隆法避免了载体避免了载体避免了载体避免了载体DNADNADNADNA的自身环化现象，的自身环化现象，的自身环化现象，的自身环化现象，（2 2）也降低了载体）也降低了载体DNADNA的线性聚合现象。的线性聚合现象。（3 3）能够）能够提高提高提高提高杂合杂合杂合杂合重组率重组率重组率重组率，也能够提高，也能够提高转化效率转化效率转化效率转化效率。3 3 3 3、缺点、缺点、缺点、缺点-无法避免目的基因的自身环化无法避免目的基因的自身环化+目的基因的线性目的基因的线性聚合现象。聚合现象。（三）、载体脱磷克隆法1、定义-载体DNA经过限制酶切77（四）、同聚接尾法1、定义2、方法3、优缺点（四）、同聚接尾法1、定义781 1、定义 在载体DNA、目的基因DNA的两端分别接上能够进行互相配对的同一碱基聚合单链，然后进行重组的方法，称为同聚接尾法同聚接尾法1、定义 在载体DNA、目的基因DNA的两端分别接上能够进795335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3355 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体53载体DNA53目的基因限制酶或机械剪切限制酶 802、方法（1 1）将载体）将载体DNADNA、目的基因、目的基因DNADNA分别用限制酶切割。分别用限制酶切割。（2 2）在小牛胸腺）在小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶的作用下，在载体的作用下，在载体两端两端3-OH3-OH3-OH3-OH上引入上引入20-3020-3020-3020-30个个个个dGdGdGdG（或者引入（或者引入50-15050-15050-15050-150个个个个dAdAdAdA）、在）、在目的基因两端目的基因两端3-OH3-OH上引入上引入20-3020-30个个dCdC（或者引入（或者引入50-15050-150个个dTdT）。）。（3 3）将混合物进行退火操作。）将混合物进行退火操作。（4 4）用）用DNADNA聚合酶聚合酶-I-I补足裂口处缺失的核苷酸。补足裂口处缺失的核苷酸。（5 5）最后，在）最后，在DNADNA连接酶的作用下，就可以形成环状重组连接酶的作用下，就可以形成环状重组DNADNA2、方法（1）将载体DNA、目的基因DNA分别用限制酶切割。813 3、优缺点优点优点优点优点：（1 1）对载体、外源性）对载体、外源性DNADNA的切割部位无特殊限制。的切割部位无特殊限制。（2 2）具有任何末端的载体、外源性）具有任何末端的载体、外源性DNADNA均可以通过此法进均可以通过此法进行重组。行重组。（3 3）载体、外源性）载体、外源性DNADNA均不产生自身环合现象均不产生自身环合现象+线性聚合线性聚合现象。现象。（4 4）方法简单，应用范围广。）方法简单，应用范围广。缺点缺点缺点缺点-必须保证接尾后的基因片段中间不能存在裂口，必须保证接尾后的基因片段中间不能存在裂口，否则，重组后的否则，重组后的DNADNA将没有感染能力。将没有感染能力。3、优缺点优点：（1）对载体、外源性DNA的切割部位无特殊82（五）、双接头法1、定义2、优缺点（五）、双接头法1、定义83Eco REco REco R人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R人工接头及其应用CCGA841 1、定义 在目的基因两端分别接上不同的在目的基因两端分别接上不同的 linker linker，然后将，然后将其与载体同时用二种不同的限制酶进行切割，再其与载体同时用二种不同的限制酶进行切割，再将切割产物进行连接的方法。称为双接头法。将切割产物进行连接的方法。称为双接头法。linkerlinker-用化学方法合成的、具有某些限制酶专用化学方法合成的、具有某些限制酶专一识别位点的、由一识别位点的、由8-128-12个脱氧核苷酸残基组成的个脱氧核苷酸残基组成的单链。单链。linker linker linker linker的特性的特性的特性的特性-其自身就可以形成互补双链。其自身就可以形成互补双链。1、定义 在目的基因两端分别接上不同的 linker，然后852 2、优缺点优点优点-适用于所有外源性DNA片段的定向克隆缺点缺点：（1）载体会产生自身线性聚合。（2）外源性目的基因会产生自身线性聚合。2、优缺点优点-适用于所有外源性DNA片段的定向86（六）、平接法1、定义定义2、优缺点优缺点（六）、平接法1、定义871 1、定义 具有具有3-羟基、和羟基、和5-磷酰基的平齐末端的磷酰基的平齐末端的DNA之间，在之间，在T4-DNA连接酶连接酶的作用下，通过形的作用下，通过形成共价键结合，称为平接法。成共价键结合，称为平接法。适用于：限制性内切酶切割产生的平端适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端1、定义 具有3-羟基、和5-磷酰基的平齐末端的DNA之间88目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶重组体892、优缺点优点优点优点优点：（1 1）本方法是）本方法是DNADNA重组中最简单的一种方法。重组中最简单的一种方法。（2 2）任何一种）任何一种平齐末端平齐末端平齐末端平齐末端的外源性的外源性DNADNA片段、和片段、和载体之间均可以进行平接法重组。载体之间均可以进行平接法重组。缺点缺点缺点缺点：（：（1 1）存在）存在DNADNA片段的自身环化现象、和片段的自身环化现象、和DNADNA线性化现象。线性化现象。（2 2）反应速度较慢反应速度较慢反应速度较慢反应速度较慢。只有。只有粘接法的粘接法的粘接法的粘接法的1%1%。2、优缺点优点：（1）本方法是DNA重组中最简单的一种方法90 基因重组和基因工程（课堂练习）基因重组和基因工程（课堂练习）1.1.基因工程中常用的限制性内切酶是基因工程中常用的限制性内切酶是 A.A.型限制酶型限制酶 B.B.型限制酶型限制酶C.C.型限制酶型限制酶 D.D.核酸内切酶核酸内切酶E.E.核酸外切酶核酸外切酶 催化催化DNADNA缺口平移反应的酶是缺口平移反应的酶是1.1.末端转移酶末端转移酶 B.DNAB.DNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶 D.DNA D.DNA聚合酶聚合酶C.C.Taq DNA Taq DNA聚合酶聚合酶E.E.基因重组和基因工程（课堂练习）913.Klenow片断具有下列酶活性片断具有下列酶活性A.A.5353外切外切酶酶和和 5353聚合酶活性聚合酶活性B.B.53 53 和和3535外切酶活性外切酶活性C.53C.53聚合酶聚合酶 和和3535外切酶活性外切酶活性3.3.53 53 和和3535聚合酶活性聚合酶活性E.53 E.53 外切酶和外切酶和3535聚合酶活性聚合酶活性B.B.碱性磷酸酶的作用是碱性磷酸酶的作用是C.C.A.A.使核酸片段使核酸片段33端加上磷酸基端加上磷酸基B.B.去除核酸片段的去除核酸片段的33端磷酸基端磷酸基 去除核酸片段的去除核酸片段的55端磷酸基端磷酸基D.D.使核酸片段的使核酸片段的55端加上磷酸基端加上磷酸基B.B.E.E.使核酸链水解断裂使核酸链水解断裂 Klenow片断具有下列酶活性925.下列是关于基因克隆常用载体的叙述，正确的是A.A.在连接酶作用下，载体可与目的在连接酶作用下，载体可与目的DNADNA连接构成重组体连接构成重组体B.B.载体是将目的载体是将目的DNADNA引入宿主细胞的运载蛋白引入宿主细胞的运载蛋白C.C.载体是将目的载体是将目的DNADNA引入宿主细胞的引入宿主细胞的DNADNA分子分子D.D.常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等 E.E.载体可将目的载体可将目的DNADNA运载入宿主细胞内而本身不进入细胞运载入宿主细胞内而本身不进入细胞5.5.DNADNA重组应包括下列过程重组应包括下列过程 A.A.分离并获得目的基因和载体分离并获得目的基因和载体B.B.B.B.连接目的基因和载体构成重组体连接目的基因和载体构成重组体C.C.将重组体导入宿主细胞内将重组体导入宿主细胞内D.D.从转化菌落中筛选并鉴定含阳性重组体的菌落从转化菌落中筛选并鉴定含阳性重组体的菌落E.E.E.E.以上都包括以上都包括下列是关于基因克隆常用载体的叙述，正确的是93精品课件精品课件！精品课件！94精品课件精品课件！精品课件！957.7.目的目的DNADNA可来自可来自A.A.直接从组织中提取直接从组织中提取 B.B.基因文库基因文库 C.C.cDNAcDNA文库文库 D.PCRD.PCR扩增扩增 E.DNAE.DNA合成仪合成合成仪合成8.8.目的目的DNADNA与载体的连接方法可有与载体的连接方法可有7.7.粘性末端连接粘性末端连接 B.B.平头末端连接平头末端连接A.A.同源多聚尾连接同源多聚尾连接 D.D.人工接头法