真核生物基因组总DNA的提取与鉴定ppt课件

基因组基因组DNA的分离与纯化的分离与纯化基因组DNA的分离与纯化一、酚抽提法的原理一、酚抽提法的原理 以含以含EDTA、SDS的裂解液的裂解液裂解裂解细细胞，经胞，经蛋白酶蛋白酶K消化消化后，用后，用PH8.0的的Tris 饱和酚饱和酚抽提抽提蛋白质，离心后取上层蛋白质，离心后取上层水相，水相，无水乙醇无水乙醇沉淀沉淀DNA。一、酚抽提法的原理 以含EDTA、SDS的裂解二、技术路线二、技术路线破破 膜膜提提 纯纯沉淀、洗涤沉淀、洗涤细胞膜碎片，细细胞膜碎片，细胞器，脂、蛋白胞器，脂、蛋白质，质，DNA，RNA 去除脂、去除脂、蛋白质蛋白质 浓缩浓缩DNA、去盐杂质去盐杂质二、技术路线破 膜提 纯沉淀、洗涤细胞膜碎片，细胞器，脂、蛋真核生物基因组真核生物基因组 DNA的提取（一）的提取（一）1.低渗去除红细胞低渗去除红细胞2.裂解白细胞裂解白细胞真核生物基因组DNA的提取（一）1.低渗去除红细胞2.裂解白真核生物基因组真核生物基因组 DNA的提取（二）的提取（二）3.酚抽提酚抽提4.无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀500l真核生物基因组DNA的提取（二）3.酚抽提4.无水乙醇沉淀5真核生物基因组真核生物基因组 DNA的提取（三）的提取（三）5.DNA沉淀的洗涤与干燥沉淀的洗涤与干燥6.DNA溶解与电泳鉴定溶解与电泳鉴定真核生物基因组DNA的提取（三）5.DNA沉淀的洗涤与干燥6三三 结果结果 琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定EBEB与与DNADNA的结合的结合EB可嵌入到碱可嵌入到碱基平面，使核基平面，使核酸在酸在 UV 激发激发下发出桔红色下发出桔红色荧光。荧光。三 结果 琼脂糖凝胶电泳鉴定EB与DNA的结合EB可嵌入三三 结果结果 琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定三 结果 琼脂糖凝胶电泳鉴定The EndThe End裂解液的作用裂解液的作用裂裂 解解 液液EDTASDS乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸(络合物络合物)二价金属螯合剂，抑制二价金属螯合剂，抑制DNA酶酶十二烷基磺酸钠（去污剂）十二烷基磺酸钠（去污剂）使细胞膜破裂；将核酸释放出来；使细胞膜破裂；将核酸释放出来；使蛋白质变性使蛋白质变性Tris-HCl缓冲夜，维持稳定的缓冲夜，维持稳定的pH值（值（8.0）裂解液的作用裂EDTASDS乙二胺四乙酸(络合物)十二烷基磺DNA酚抽提法示意图酚抽提法示意图酚的作用酚的作用酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。酶活性。PH8.0的的Tris溶液可以使抽提出的溶液可以使抽提出的DNA进入水相进入水相。DNA酚抽提法示意图酚的作用酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNDNA酚抽提法示意图酚抽提法示意图蛋白酶蛋白酶K K的作用的作用水解组蛋白，促进水解组蛋白，促进DNA与组蛋白的分开。与组蛋白的分开。DNA酚抽提法示意图蛋白酶K的作用水解组蛋白，促进DNA与组DNA的沉淀的沉淀无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀l 沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaAc等盐离子，作用是中和等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。聚集。l 无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。的损伤。DNA的沉淀无水乙醇沉淀TE10mmol/L Tris-HCl1mmol/L EDTATE10mmol/L Tris-HCl1mmol/L EDT上样缓冲溶液（上样缓冲溶液（6 或或10）溴酚蓝（电泳指示剂，约相当于溴酚蓝（电泳指示剂，约相当于300bpDNA）二甲苯氰（电泳指示剂，约相当于二甲苯氰（电泳指示剂，约相当于4000bpDNA）甘油甘油/蔗糖（增加蔗糖（增加DNA溶液的密度）溶液的密度）0.51.4%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶上样缓冲溶液（6 或10）溴酚蓝（电泳指示剂，约相当于水相的吸取水相的吸取水相的吸取SDS（去垢剂）（去垢剂）SDS（去垢剂）