蛋白质电泳技术介绍ppt课件

LOGO我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物电泳技术介绍电泳技术介绍我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGESDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE2我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基本原理基本原理1.SDS1.SDS能能断断裂裂分分子子内内和和分分子子间间氢氢键键，破破坏坏蛋蛋白白质质的的二二级级和和三三级级结结构构，强强还还原原剂剂能能使使半半胱胱氨氨酸酸之之间间的的二二硫键断裂。硫键断裂。2.2.蛋蛋白白质质样样品品在在100100用用SDSSDS和和还还原原剂剂处处理理，可可解解聚聚成亚基成亚基,加入加入SDSSDS，改变了，改变了蛋白质蛋白质的构象的构象。3.3.各各种种SDS-SDS-蛋蛋白白质质复复合合物物均均带带相相同同密密度度的的负负电电荷荷，其其荷荷电电超超过过了了原原蛋蛋白白质质，消消除除了了不不同同蛋蛋白白质质的的荷荷电差异。电差异。基本原理1.SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级3我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物图解图解图解4我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物多孔凝胶多孔凝胶混合大分子混合大分子电泳电泳多孔凝胶混合大分子电泳5我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物操作流程操作流程制胶制胶上样上样电泳电泳染色染色脱色脱色操作流程制胶上样电泳染色脱色6我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v制胶制胶v1 1将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好v2 2 按照配方制备分离胶，按照配方制备分离胶，TEMEDTEMED在灌胶前加入混匀，迅速灌胶在灌胶前加入混匀，迅速灌胶v3 3 在分离胶上迅速并轻柔的加上水或无水乙醇进行水封（凝在分离胶上迅速并轻柔的加上水或无水乙醇进行水封（凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面）胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面）v4 4 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶按比例配好浓缩胶,连连续平稳加入浓缩胶至离边缘续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm处处,迅速插入样梳迅速插入样梳,静置静置4040分钟分钟具体步骤制胶具体步骤7我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v上样上样按一定顺序在加样孔中加入样品，根据按一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGESDS-PAGE电泳玻璃板电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量。间隙厚度不同，选择加入样品量。v电泳电泳打开电源将电压调到打开电源将电压调到80v80v（一般（一般15min15min左右），待样品跑过压左右），待样品跑过压缩胶后将电压调到缩胶后将电压调到120v120v至样品电泳到胶底部为止。至样品电泳到胶底部为止。上样8我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v染色染色将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液（考马斯亮蓝将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液（考马斯亮蓝），用摇床摇），用摇床摇2 23h3hv脱色脱色待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。将脱色液倒掉待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。将脱色液倒掉，可以用，可以用Quality OneQuality One，或者相应的成像系统拍照、分析、，或者相应的成像系统拍照、分析、估算蛋白浓度。估算蛋白浓度。染色9我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物等电聚焦电泳等电聚焦电泳 (Isoelectro focusing IEF or EF)等电聚焦电泳(Isoelectro focusing I10我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物等电聚焦电泳等电聚焦电泳 ，是利用有，是利用有pHpH梯度的介质分离梯度的介质分离等等电点不同电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可到达可到达0.01pH0.01pH单位，因此特别适合于分离单位，因此特别适合于分离分子量分子量相近而等电点不同相近而等电点不同的蛋白质组分。的蛋白质组分。适用适用:1.:1.研究蛋白质微观不均一性研究蛋白质微观不均一性 2.2.测定蛋白质等电点测定蛋白质等电点基本原理基本原理等电聚焦电泳，是利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质11我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Company Logo4形成电场形成电场3蛋白质加样蛋白质加样21用电流在凝用电流在凝胶溶液中建胶溶液中建立一个稳定立一个稳定的的PHPH梯度梯度蛋白质移动到它蛋白质移动到它们各自的等电点，们各自的等电点，不同等电点的蛋不同等电点的蛋白质被分开白质被分开Company Lo12我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Company Logo+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH Company Lo13我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物pHpH梯度构建梯度构建载体两性电解质载体两性电解质pH梯度梯度(Carrier ampholytes pH gradients，CA):在电场中通过两性缓冲离子建立的在电场中通过两性缓冲离子建立的pH梯度。梯度。固相固相pH梯度（梯度（immobilized pH gradients，IPG）将缓冲基团将缓冲基团共价键合在介质上成为凝胶介共价键合在介质上成为凝胶介质的一部分而建立质的一部分而建立pH梯度（线性和非线性），分辨梯度（线性和非线性），分辨率比前者高一个数量级。率比前者高一个数量级。pH梯度构建载体两性电解质pH梯度14我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物载体两性电解质（载体两性电解质（CA）应具备的条件）应具备的条件v(1)在等电点处必需有足够的缓冲能力在等电点处必需有足够的缓冲能力 v(2)在等电点必需有足够高的电导在等电点必需有足够高的电导 v(3)分子量要小，便于与被分离的高分子物质用分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。透析或凝胶过滤法分开。v(4)化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。v(5)应不与分离物质反应或使之变性。应不与分离物质反应或使之变性。载体两性电解质（CA）应具备的条件(1)在等电点处必需有足够15我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物操作流程操作流程制胶制胶装管装管装槽，电泳装槽，电泳剥胶剥胶固定固定测定测定pHpH梯度梯度操作流程1234制胶装管装槽，电泳剥胶5固定6测定pH梯度16我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物具体步骤具体步骤v1.1.配胶配胶v2.2.装管装管 每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将圆每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管的容量约为玻璃管的容量约为1.5-1.8ml1.5-1.8ml）,液面加至距管口液面加至距管口1mm1mm处，用处，用注射器轻轻加入少许注射器轻轻加入少许H2OH2O，进行水封，以消除弯月面使胶柱，进行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约顶端平坦。胶管垂直聚合约3030分钟，聚合完成时可观察到水分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。封下的折光面。具体步骤1.配胶17我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v3.3.装槽和电泳装槽和电泳 v用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。每支管约记下管号。每支管约1/31/3在上槽，在上槽，2/32/3在下槽。上槽加入在下槽。上槽加入500ml 0.1M H3PO4500ml 0.1M H3PO4，下槽加入，下槽加入500ml 0.1M NaOH500ml 0.1M NaOH，淹没各，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V160V，聚焦，聚焦2 2至至3 3小时，小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。至电流近于零不再降低时，停止电泳。3.装槽和电泳 18我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v4.4.剥胶剥胶 取下胶管，用取下胶管，用H2O H2O 将胶管和两端洗将胶管和两端洗2 2次，用注射器沿管壁轻次，用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端注入注入H2OH2O少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头头”，负极，负极端为端为“尾尾”，若分不清时，可用，若分不清时，可用pHpH试纸鉴定，酸性端为正，试纸鉴定，酸性端为正，碱碱性端为负。性端为负。4.剥胶 19我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v5.5.固定固定 取取2 2支胶条置于一个小培养皿内，倒入支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%10%三氯乙酸溶液至没三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“L2”L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度长度“L”L”。固定后的胶条可在康强固定后的胶条可在康强860860紫外紫外/可见分光光可见分光光度计上用度计上用280nm280nm或或238nm238nm波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。应的测量和计算。5.固定 20我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v6.6.测定测定pHpH梯度梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pHpH胶条的长度胶条的长度“L1”L1”。按照由正极至负极的顺序，用镊子和。按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成小刀依次将胶条切成10mm10mm长的小段，分别置于小试管中，长的小段，分别置于小试管中，加入加入1ml H2O1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长带细长pHpH复合电极的复合电极的pHpH计测出每管浸出液的计测出每管浸出液的pHpH值。值。6.测定pH梯度 21我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物优缺点优缺点v优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，不仅可测定蛋白或多肽的等电点由，重现性好，不仅可测定蛋白或多肽的等电点而且能将不同等电点的混合生物大分子进行而且能将不同等电点的混合生物大分子进行分离分离和和鉴定鉴定。v缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解不溶解或发生或发生变性变性的蛋白。的蛋白。优缺点优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，22我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物双向电泳双向电泳（2-D electrophoresis）双向电泳23我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Company Logo基本原理第第一一向向进进行行等等电电聚聚焦焦，蛋蛋白白质质沿沿pHpH梯梯度度分分离离（将将适适宜宜的的IPGIPG试试剂剂添添加加至至混混合合物物中中用用于于凝凝胶胶聚聚合合，在在聚聚合合中中缓缓冲冲基基团团通通过过乙乙烯烯键键共共价价聚聚合合至至聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺骨骨架架中中而而形形成成pHpH梯梯度度），至至各各自自的的等等电电点点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。Company Logo基本原理第一向进行等电聚焦，蛋白质沿24我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第一向第一向第一向第一向：等电聚焦电泳等电聚焦电泳第二向第二向第二向第二向：SDS-PAGESDS-PAGE水平方向：反映出蛋白在水平方向：反映出蛋白在pIpI上的差异上的差异垂直方向：反映出它们在分子量上的差别垂直方向：反映出它们在分子量上的差别图解图解第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS-PAGE水平方向：反映出25我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2D2D电泳操作流程电泳操作流程细胞裂解细胞裂解匀浆匀浆预分级预分级除杂质除杂质浓缩浓缩定量定量样品制备样品制备挖点挖点酶解酶解点靶点靶蛋白鉴定蛋白鉴定分离分离双向电泳双向电泳第一向第一向第二向第二向染色染色银染银染 考染考染 荧光荧光图谱分析图谱分析图像获取图像获取图谱分析图谱分析2D电泳操作流程细胞裂解匀浆样品制备挖点蛋白鉴定分离双向电泳26我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v1.1.样品制备样品制备v2.2.固相预制胶条的水化固相预制胶条的水化v3.3.第一向等电聚焦第一向等电聚焦v3.1.3.1.取出取出IPGIPG预制胶条（预制胶条（7cm pH 4-77cm pH 4-7），室温平），室温平衡。衡。v3.2.3.2.在聚焦盘或水化盘中加入样品。在聚焦盘或水化盘中加入样品。v3.3.3.3.去除预制去除预制IPGIPG胶条上的保护层胶条上的保护层 。具体步骤具体步骤1.样品制备具体步骤27我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v3.4.3.4.将将IPGIPG胶条置于聚焦盘或水化盘中胶条置于聚焦盘或水化盘中 。v3.5.3.5.在每根胶条上覆盖在每根胶条上覆盖1ml1ml矿物油。矿物油。v3.6.3.6.对好正、负极，盖上盖子。对好正、负极，盖上盖子。v3.7.3.7.设置等电聚焦程序。设置等电聚焦程序。v4.4.胶条的平衡胶条的平衡v4.14.1冰箱中取出的胶条，于室温放置冰箱中取出的胶条，于室温放置1010分钟。分钟。3.4.将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中。28我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v4.24.2配制胶条平衡缓冲液配制胶条平衡缓冲液 I I。v4.34.3吸去胶条上的矿物油及多余的样品。吸去胶条上的矿物油及多余的样品。v4.44.4第一次平衡。振荡第一次平衡。振荡1515分钟。分钟。v4.54.5配制胶条平衡缓冲液配制胶条平衡缓冲液 IIII。v4.64.6第二次平衡第二次平衡 ，振荡，振荡1515分钟。分钟。v4.74.7吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。4.2配制胶条平衡缓冲液 I。29我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物v4.84.8琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制11电泳缓电泳缓冲液。冲液。v5.5.第二向第二向SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳v6.6.凝胶的染色及检测凝胶的染色及检测v7.PDQuest7.PDQuest软件分析软件分析v8.8.质谱鉴定质谱鉴定4.8琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1电泳缓冲液。30LOGO我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Thank You!