氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略课件

氨基酸代谢控制发酵机制氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略及育种策略徐庆阳中国氨基酸技术服务中心中国氨基酸技术服务中心氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略徐庆阳中国氨基酸技术服务1目目 录录Chapter1 代谢机制理论基础Chapter2 L-谷氨酸Chapter3 L-亮氨酸Chapter4 L-缬氨酸Chapter5 L-异亮氨酸目 录Chapter1 代谢机制理论基础2Chapter1 代谢机制理论基础Chapter1 代谢机制理论基础3氨基酸发酵机制氨基酸发酵机制 在一般情况下，微生物在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中胞只合成本身需要的中间代代谢产物，物，严格防止氨基酸、核苷酸等中格防止氨基酸、核苷酸等中间物物质的大量的大量积累。当累。当氨基酸或核苷酸等物氨基酸或核苷酸等物质进入入细胞后，微生物胞后，微生物细胞立即停止胞立即停止该物物质的合成，一直到所供的合成，一直到所供应的养料消耗到很低的养料消耗到很低浓度，微度，微生物生物细胞才能重新开始胞才能重新开始进行行该物物质的合成。微生物的合成。微生物细胞中胞中这种种调节控制作用主要靠两个因素，即参与控制作用主要靠两个因素，即参与调节的有关的有关酶酶的活性和的活性和酶酶量量 氨基酸发酵机制 在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中间4代代谢控制机制的研究已控制机制的研究已经证明，明，酶酶的生物合成受基因和代的生物合成受基因和代谢物的双重控制。物的双重控制。一方面，从一方面，从DNA的分子水平上的分子水平上阐明了明了酶酶生物合成的控制机生物合成的控制机制，制，酶酶的合成像普通蛋白的合成像普通蛋白质的合成一的合成一样，受到，受到结构基因的构基因的控制，由控制，由结构基因决定形成构基因决定形成酶酶分子的一分子的一级结构；构；另一方面另一方面,酶酶的生物合成的生物合成还受代受代谢物（物（酶酶反反应的底物、的底物、产物物及其及其类似物）的控制和似物）的控制和调节。当有。当有诱导物存在物存在时，酶酶的生的生成量可以几倍乃至几百倍的数量增加。相反，某些成量可以几倍乃至几百倍的数量增加。相反，某些酶酶促反促反应的的产物，特物，特别是是终产物，又能物，又能产生阻遏作用，使生阻遏作用，使酶酶的合的合成量大大减少。成量大大减少。代谢控制机制的研究已经证明，酶的生物合成受基因和代谢物的双重5参与氨基酸生物合成的关参与氨基酸生物合成的关键酶酶主要有主要有12种：种：磷酸果糖激磷酸果糖激酶酶；柠檬酸合成檬酸合成酶酶；N-乙乙酰谷氨酸激谷氨酸激酶酶；鸟氨酸氨酸转氨基甲氨基甲酰酶酶；天冬氨酸激天冬氨酸激酶酶；高高丝氨酸脱氨酸脱氢酶酶；苏氨酸脱水氨酸脱水酶酶；-乙乙酰乳酸合成乳酸合成酶酶；DAHP（2-酮-3-脱氧脱氧-D-阿拉伯糖型庚糖酸阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成磷酸）合成酶酶；分支酸分支酸变位位酶酶；11预苯酸脱水苯酸脱水酶酶；12预苯酸脱苯酸脱氢酶酶。参与氨基酸生物合成的关键酶主要有12种：磷酸果糖激酶；柠6一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支点点酶酶（branching enzyme）可以成）可以成为关关键酶酶，但关，但关键酶酶并不并不都是分支点都是分支点酶酶。关。关键酶酶的关的关键效果也只是在特定的氨基酸效果也只是在特定的氨基酸生物合成生物合成过程中成立，而在其他氨基酸的生物合成程中成立，而在其他氨基酸的生物合成过程中程中则不成立。例如，不成立。例如，-乙乙酰乳酸合成乳酸合成酶酶在在缬氨酸生物合成途径氨酸生物合成途径中起主中起主导性的关性的关键酶酶作用，但在异亮氨酸的生物合成中，作用，但在异亮氨酸的生物合成中，起主起主导性关性关键作用的却是作用的却是苏氨酸脱水氨酸脱水酶酶。该酶酶位于位于-乙乙酰乳乳酸合成酸合成酶酶的前一的前一阶段，并且不是分支点段，并且不是分支点酶酶。一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支点酶（br7反馈控制与优先合成反馈控制与优先合成氨基酸生物合成的基本氨基酸生物合成的基本调节机制有反机制有反馈控制（反控制（反馈阻遏与阻遏与反反馈抑制）和在合成途径分支点抑制）和在合成途径分支点处的的优先合成先合成如如图所示的反所示的反馈控制，由催化合成途径最初反控制，由催化合成途径最初反应AB的初的初始始酶酶受受终产物氨基酸物氨基酸E的反的反馈抑制和合成途径上各种抑制和合成途径上各种酶酶受受终产物氨基酸物氨基酸E的反的反馈阻遏阻遏组成。成。反馈控制与优先合成8优先合成优先合成 底物底物A经分支合成途径生成两种分支合成途径生成两种终产物物E和和G，由于，由于a酶酶的的酶酶活性活性远远大于大于b酶酶的的酶酶活性，活性，结果果优先合成先合成E。E合成达到一合成达到一定定浓度度时，就会抑制，就会抑制a酶酶，使代，使代谢转向合成向合成G。G合成达到合成达到一定一定浓度度时就会就会对c酶酶产生抑制作用生抑制作用优先合成 底物A经分支合成途径生成两种终产物E和G，由于a酶9平衡合成（平衡合成（balanced synthesis）底物底物A经分支合成途径生成两种分支合成途径生成两种终产物物E与与G，由于，由于a酶酶的的酶酶活性活性远远大于大于b酶酶，结果果优先合成先合成E。E过量后就会抑制量后就会抑制a酶酶，使代使代谢转向合成向合成G。G过量后，就会拮抗或逆量后，就会拮抗或逆转E的反的反馈抑抑制作用，制作用，结果代果代谢流又流又转向合成向合成E，如此循，如此循环 平衡合成（balanced synthesis）底物A经分10微生物体内代微生物体内代谢过程的各种生物化学反程的各种生物化学反应，都是由各种，都是由各种酶酶来来催化的。按各种催化的。按各种酶酶在代在代谢调节中作用的不同，又可将中作用的不同，又可将酶酶分分为以下三以下三类调节酶酶（常称关（常称关键酶酶，与代，与代谢调节关系密切）关系密切）变构构酶酶：通：通过酶酶分子构象的分子构象的变化来改化来改变酶酶活性的一活性的一类酶酶同功同功酶酶：具有同一种：具有同一种酶酶的底物的底物专一性，但分子一性，但分子结构不同的一构不同的一类酶酶多功能多功能酶酶：能：能够催化两种以上不同反催化两种以上不同反应的一的一类酶酶静静态酶酶 一般与代一般与代谢调节关系不大的一关系不大的一类酶酶潜在潜在酶酶 指指酶酶原、非活性型或与抑制原、非活性型或与抑制剂结合的合的酶酶微生物体内代谢过程的各种生物化学反应，都是由各种酶来催化的。11同功同功酶酶酶酶I和和酶酶都是催化都是催化AB的同功的同功酶酶。G过量量时，酶酶停止活停止活动，C也不能也不能经过F到到G与此同与此同时，酶酶I活力不受影响，活力不受影响，A可以可以顺利地到利地到E，从而使，从而使G过量，量，但并不干但并不干扰E的合成的合成同功酶12反馈抑制与反馈阻遏的比较反馈抑制与反馈阻遏的比较项目目类型型反反馈阻遏阻遏反反馈抑制抑制控制控制对象象酶酶的生物合成的生物合成酶酶的活性的活性控制量控制量终产物物浓度度终产物物浓度度控制的水平控制的水平DNAmRNA酶酶蛋白蛋白酶酶蛋白的构象蛋白的构象变化化控制装置控制装置终产物与阻遏蛋白的物与阻遏蛋白的亲和力和力终产物与物与变构部位的构部位的亲和力和力控制装置的控制装置的动作作阻遏蛋白与操阻遏蛋白与操纵基因基因结合，合，通通过变构效构效应，酶酶的的结构构发生生变化化不能合成不能合成mRNA形成的控制形成的控制开、关控制开、关控制控制控制酶酶活性大小活性大小反反应迟缓、粗的控制、粗的控制迅速、精确的控制迅速、精确的控制代代谢途径途径无定向代无定向代谢途径和合成代途径和合成代谢途径分支点等途径分支点等无定向代无定向代谢途径和合成代途径和合成代谢途径分支途径分支点等点等细胞胞经济高分子化合物高分子化合物(酶酶蛋白蛋白)低分子化合物低分子化合物(酶酶反反应生成物生成物)反馈抑制与反馈阻遏的比较项目反馈阻遏反馈抑制控制对象酶的生物13协同反同反馈抑制或称多价反抑制或称多价反馈抑制抑制当一条代当一条代谢途径中有两个以上途径中有两个以上终产物物时，任何一个，任何一个终产物都不物都不能能单独抑制途径第一个共同的独抑制途径第一个共同的酶酶促反促反应，但当两者同，但当两者同时过剩剩时，它它们协同抑制第一个同抑制第一个酶酶反反应协同反馈抑制或称多价反馈抑制14合作反合作反馈抑制（抑制（Cooperative feedback inhibition）合作反合作反馈抑制也可称抑制也可称为增效反增效反馈抑制（抑制（Synergistic feedback inhibition）。）。这种反种反馈抑制不同于抑制不同于协同反同反馈抑制，也不同于抑制，也不同于积累反累反馈抑制抑制当任何一个当任何一个终产物物单独独过剩剩时，只部分地反，只部分地反馈抑制第一个抑制第一个酶酶的的活性，只有当活性，只有当G、E两个两个终产物同物同时过剩存在剩存在时，才能引起，才能引起强强烈烈抑制，其抑制程度大于各自抑制，其抑制程度大于各自单独存在的和独存在的和合作反馈抑制（Cooperative feedback in15积累反累反馈抑制（抑制（Cumulative feedback inhibition）在在积累反累反馈抑制中，每一个最抑制中，每一个最终产物只物只单独地、部分地抑制共独地、部分地抑制共同步同步骤的第一个的第一个酶酶，并且各最，并且各最终产物的抑制作用互不影响。所物的抑制作用互不影响。所以几个最以几个最终产物同物同时存在存在时，它，它们的抑制作用是的抑制作用是积累的累的积累反馈抑制（Cumulative feedback inh16顺序反序反馈抑制抑制(Sequential feedback inhibition)顺序反序反馈抑制的抑制的过程是：程是：F积累，停止累，停止DE反反应，减少，减少F的的进一一步合成，更多的步合成，更多的D转到到G，再由，再由G合成合成I或或K；I积累，抑制累，抑制GH的反的反应；K积累，抑制累，抑制GJ的反的反应，结果造成果造成G的的积累，引起累，引起G对AB的反的反馈抑制，使整个途径停止抑制，使整个途径停止假反假反馈抑制抑制(Pseudo-feedback inhibition)假反假反馈抑制是指抑制是指结构构类似物引起的反似物引起的反馈抑制抑制顺序反馈抑制(Sequential feedback inh17Chapter2 L-谷氨酸谷氨酸Chapter2 L-谷氨酸18谷氨酸的生物合成途径生成谷氨酸的主要酶反应生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸的生物合成途径生成谷氨酸的主要酶反应19谷氨酸的生物合成包括谷氨酸的生物合成包括 糖酵解作用（糖酵解作用（糖酵解作用（糖酵解作用（glycolysis,EMPglycolysis,EMP途径）途径）途径）途径）戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathwaypentose phosphate pathway，HMPHMP途径）途径）途径）途径）三羧酸循环（三羧酸循环（三羧酸循环（三羧酸循环（tricarboxylic acid cycletricarboxylic acid cycle，TCATCA循环）循环）循环）循环）乙醛酸循环乙醛酸循环乙醛酸循环乙醛酸循环(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（COCO2 2固定反应）等固定反应）等固定反应）等固定反应）等谷氨酸的生物合成包括20生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸脱谷氨酸脱氢酶酶（GHD）所催化的）所催化的还原氨基化反原氨基化反应转氨氨酶酶（AT）催化的）催化的转氨反氨反应生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基21谷氨酸脱氢酶（谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应）所催化的还原氨基化反应 谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应 22转氨酶（转氨酶（AT）催化的转氨反应）催化的转氨反应 转氨酶（AT）催化的转氨反应 23谷氨酸合成谷氨酸合成酶酶（GS）催化的反）催化的反应生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸合成酶（GS）催化的反应生成谷氨酸的主要酶反应24谷氨酸合成酶（谷氨酸合成酶（GS）催化的反应）催化的反应 谷氨酸合成酶（GS）催化的反应 25由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径26 C6H12O6+NH3+3/2O2 C5H9O4N+CO2+3H2O谷氨酸生物合成的理想途径 C6H12O6+NH3+3/2O2 27由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的总反应方程式为：物合成谷氨酸的总反应方程式为：C6H12O6+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2+3H2O 由于由于1摩尔葡萄糖可以生成摩尔葡萄糖可以生成1摩尔的谷氨酸，因此理摩尔的谷氨酸，因此理论糖酸转化率为论糖酸转化率为81.7%。由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的28谷氨酸发酵的代谢途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的代由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径途径谷氨酸发酵的代谢途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径29葡萄糖首先葡萄糖首先经EMP及及HMP两个途径生成丙两个途径生成丙酮酸。其中以酸。其中以EMP途径途径为主，生物主，生物素充足素充足时HMP所占比例是所占比例是38%，控制生物素，控制生物素亚适量，适量，发酵酵产酸期，酸期，EMP所占所占的比例更大，的比例更大，HMP所占比例所占比例约为26%。生成的丙生成的丙酮酸，一部分在丙酸，一部分在丙酮酸脱酸脱氢酶酶系的作用下氧化脱系的作用下氧化脱羧生成乙生成乙酰CoA，另，另一部分一部分经CO2固定反固定反应生成草生成草酰乙酸或苹果酸，催化乙酸或苹果酸，催化CO2固定反固定反应的的酶酶有丙有丙酮酸酸羧化化酶酶、苹果酸、苹果酸酶酶和磷酸和磷酸烯醇式丙醇式丙酮酸酸羧化化酶酶。草草酰乙酸与乙乙酸与乙酰CoA在在柠檬酸合成檬酸合成酶酶催化作用下，催化作用下，缩合成合成柠檬酸，檬酸，进入三入三羧酸酸循循环，柠檬酸在檬酸在顺乌头酸酸酶酶的作用下生成异的作用下生成异柠檬酸，异檬酸，异柠檬酸再在异檬酸再在异柠檬酸脱檬酸脱氢酶酶的作用下生成的作用下生成-酮戊二酸，戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。-酮戊二酸在谷氨酸脱戊二酸在谷氨酸脱氢酶酶作用下作用下经还原氨基化反原氨基化反应生成谷氨酸生成谷氨酸谷氨酸发酵的代谢途径葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途30l控制谷氨酸合成的重要措施控制谷氨酸合成的重要措施-酮戊二酸氧化能力微弱，即-酮戊二酸脱氢酶活力微弱谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征就是-酮戊二酸氧化能力微弱。丧失-酮戊二酸脱氢酶的重要性已经用要求生物素和不分泌谷氨酸的大肠杆菌得以证明。甚至发现不要求生物素的一株丧失-酮戊二酸脱氢酶的突变株，能分泌2.3g/L谷氨酸，而其亲株却什么也不分泌。谷氨酸产生菌的-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏条件下，三羧酸循环到达-酮戊二酸时，即受到阻挡。把糖代谢流阻止在-酮戊二酸的堰上，对导向谷氨酸形成具有重要意义。在铵离子存在下，-酮戊二酸因谷氨酸脱氢酶的催化作用，经还原氨基化反应生成谷氨酸。谷氨酸发酵的代谢途径控制谷氨酸合成的重要措施谷氨酸发酵的代谢途径31谷氨酸脱氢酶活性强谷氨酸脱氢酶活性强32细胞膜对谷氨酸的通透性高谷氨酸的分泌可降低细胞内产物的浓度，消除了谷氨酸转化成其它代谢物的可能，减低了对谷氨酸脱氢酶的抑制，并使谷氨酸的生成途径畅通。由生物素亚适量可造成细胞膜对产物的高通透性。生物素改变细胞膜通透性的机制与影响细胞膜磷脂的含量及成分有关。还可通过添加表面活性剂、高级饱和脂肪酸，或青霉素等控制细胞膜对谷氨酸的通透性。通过选育温度敏感突变株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突变株也可控制细胞膜对谷氨酸的通透性。细胞膜对谷氨酸的通透性高33CO2固定固定酶酶系系活力活力强强Citrate synthase,Aconitase,ICDH,GDH酶酶活力活力强强乙乙醛酸循酸循环弱弱异异柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶活力欠缺或微弱活力欠缺或微弱-酮戊二酸氧化戊二酸氧化能力缺失或微弱能力缺失或微弱CO2固定酶系活力强Citrate synthase,Ac34l乙乙醛酸循酸循环的作用的作用谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径乙乙醛酸循酸循环途径可看作途径可看作三三羧酸循酸循环的支路和中的支路和中间产物的物的补给途径途径在菌体生在菌体生长期之后，期之后，进入谷氨酸生成期，入谷氨酸生成期，为了了大量生成、大量生成、积累谷氨酸累谷氨酸，最好没有异，最好没有异柠檬酸裂檬酸裂解解酶酶催化反催化反应，封，封闭乙乙醛酸循酸循环乙醛酸循环的作用谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径可看作三羧35谷氨酸生物合成的调节机制优先合成与反馈调节优先合成与反馈调节糖代谢的调节糖代谢的调节氮代谢的调节氮代谢的调节谷氨酸生物合成的调节机制优先合成与反馈调节36优先合成黄色短杆菌中谷氨酸的代黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制机制-酮戊二酸合成后由于-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸。优先合成黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制-酮戊二酸合成后由37反馈调节黄色短杆菌中谷氨酸的代黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制机制1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2-柠檬酸合成酶 3-异柠檬酸脱氢酶 4-酮戊二酸脱氢酶 5-谷氨酸脱氢酶反馈调节黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制1-磷酸烯醇式丙酮酸38l优先合成先合成 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸l磷酸磷酸烯醇式丙醇式丙酮酸酸羧化化酶酶的的调节 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反应的关键酶，受固定反应的关键酶，受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏优先合成与反馈调节优先合成优先合成与反馈调节39l柠檬酸合成檬酸合成酶酶的的调节 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制l异异柠檬酸脱檬酸脱氢酶酶的的调节 细胞内细胞内-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当-酮酮戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成成-酮戊二酸酮戊二酸优先合成与反馈调节柠檬酸合成酶的调节优先合成与反馈调节40l-酮戊二酸脱戊二酸脱氢酶酶的的调节 在谷氨酸产生菌中，在谷氨酸产生菌中，-酮戊二酸脱氢酶活性微弱酮戊二酸脱氢酶活性微弱l谷氨酸脱谷氨酸脱氢酶酶的的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。-酮酮戊二酸合成后由于戊二酸合成后由于-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸酶的活力很强，故优先合成谷氨酸优先合成与反馈调节-酮戊二酸脱氢酶的调节优先合成与反馈调节41糖代谢的调节 l能荷能荷细胞所处的能量状态用细胞所处的能量状态用ATP、ADP和和AMP之间的关系来表示，之间的关系来表示，称为能荷（称为能荷（energy charge）能荷值在能荷值在0和和1之间变动。已知大多数细胞的能荷处于之间变动。已知大多数细胞的能荷处于0.80到到0.95之间，处于一种动态平衡）之间，处于一种动态平衡）糖代谢的调节 能荷能荷值在0和1之间变动。已知大多数细胞的42糖代谢的调节l能荷控制能荷控制能量生成代能量生成代谢系的系的调节如图所示，当生物体内即能荷降低，就会激活某些催化糖类分解的酶或解除ATP对这些酶的抑制（如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等），并抑制糖元合成的酶（如糖元合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等），从而加速糖酵解、TCA循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。当能荷高时，就会抑制糖元降解、糖酵解和 TCA循环的关键酶，如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶，并激活糖类合成的酶，如糖元合成酶和果糖-1,6-二磷酸酯酶，从而抑制糖的分解，加速糖元的合成。1-磷酸果糖激酶 2-果糖1,6-二磷酸酯酶 3-柠檬酸合成酶 4-异柠檬酸脱氢酶5-反丁烯二酸酶 6-乙酰CoA羧化酶 7-糖原磷酸化酶 8-糖原合成酶糖代谢的调节能荷控制能量生成代谢系的调节如图所示，当生物体内43糖代谢的调节l生物素生物素对糖代糖代谢的的调节生物素对糖代谢速率的影响生物素对糖代谢速率的影响 生物素生物素对糖代糖代谢速率的影响，主要是影响糖降解速率，而不是影响速率的影响，主要是影响糖降解速率，而不是影响EMP与与HMP途径的比率。在生物素充足条件下，丙途径的比率。在生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性酸以后的氧化活性虽然然也有提高，但由于糖降解速率也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化酸氧化速率之速率之间的平衡，丙的平衡，丙酮酸酸趋于生成乳酸的反于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出，因而会引起乳酸的溢出生物素对生物素对CO2固定反应的影响固定反应的影响 生物素是丙生物素是丙酮酸酸羧化化酶酶的的辅酶酶，参与，参与CO2固定反固定反应，据，据报道，生物素大道，生物素大过量量时（100 g/L以上），以上），CO2固定反固定反应可提高可提高30%糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节44糖代谢的调节l生物素生物素对糖代糖代谢的的调节生物素对乙醛酸循环的影响生物素对乙醛酸循环的影响乙乙醛酸循酸循环的关的关键酶酶异异柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所醋酸所诱导以葡萄糖以葡萄糖为原料原料发酵生酵生产谷氨酸谷氨酸时，通，通过控制生物素控制生物素亚适量，几适量，几乎看不到异乎看不到异柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶的活性。原因是丙的活性。原因是丙酮酸氧化能力下降，酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以醋酸的生成速度慢，所以为醋酸所醋酸所诱导形成的异形成的异柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶就就很少很少由于异由于异柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶受琥珀酸阻遏，在生物素受琥珀酸阻遏，在生物素亚适量条件下，因适量条件下，因琥珀酸氧化能力降低而琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反累的琥珀酸就会反馈抑制抑制该酶酶的活性，的活性，并阻遏并阻遏该酶酶的合成，乙的合成，乙醛酸循酸循环基本上是封基本上是封闭的，代的，代谢流向异流向异柠檬酸檬酸-酮戊二酸戊二酸谷氨酸的方向高效率地移谷氨酸的方向高效率地移动糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节45氮代谢的调节控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成氨酸不去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成在生物素亚适量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，在生物素亚适量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时又由于完全氧化降低的结果，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时又由于完全氧化降低的结果，使使ATP形成量减少，导致蛋白质合成活动停滞，在铵离子适量存在下，形成量减少，导致蛋白质合成活动停滞，在铵离子适量存在下，使得菌体生成积累谷氨酸使得菌体生成积累谷氨酸生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白质生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白质在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶活力增强，琥珀酸氧化力增强，在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶活力增强，琥珀酸氧化力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酸乙酸、苹果酸脱羧丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酸乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其它氨基酸量增加用生成的其它氨基酸量增加氮代谢的调节控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力46谷氨酸细胞膜渗透性的控制细胞膜的结构细胞膜的结构 控制细胞膜渗透性的方法控制细胞膜渗透性的方法谷氨酸细胞膜渗透性的控制细胞膜的结构47氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略课件48细胞膜的脂质主要是磷脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能细胞膜的脂质主要是磷脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能溶于水的极性头和一个不带电荷、不溶于水的非极性尾所构成溶于水的极性头和一个不带电荷、不溶于水的非极性尾所构成,极极性头朝向膜的内外两个表面，呈亲水性；而非极性的疏水尾则埋性头朝向膜的内外两个表面，呈亲水性；而非极性的疏水尾则埋藏在膜的内层，从而形成一个磷脂双分子层。膜内的蛋白质有的藏在膜的内层，从而形成一个磷脂双分子层。膜内的蛋白质有的是酶，有的是携带胞外物质进入细胞的载体蛋白，镶嵌或埋在脂是酶，有的是携带胞外物质进入细胞的载体蛋白，镶嵌或埋在脂质双层内或附着在它的表面，主要分为嵌入蛋白和表在蛋白。有质双层内或附着在它的表面，主要分为嵌入蛋白和表在蛋白。有的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖链主要朝向外表面。的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖链主要朝向外表面。细胞膜是一个选择性半渗透性膜，它的重要生理功能是控制细胞细胞膜是一个选择性半渗透性膜，它的重要生理功能是控制细胞内外物质的运送和交换，是细胞同外界环境进行物质交换和信息内外物质的运送和交换，是细胞同外界环境进行物质交换和信息交流的接触面。通过改变细胞膜的组成成分可改变膜的渗透性。交流的接触面。通过改变细胞膜的组成成分可改变膜的渗透性。细胞膜的脂质主要是磷脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能溶于49控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成生物素缺陷型生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸行谷氨酸发酵，通酵，通过限制限制发酵培养基中酵培养基中生物素的生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成作用机制：生物素作作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反催化脂肪酸生物合成最初反应的关的关键酶酶乙乙酰CoA羧化化酶酶的的辅酶酶，参与了脂肪酸的合成，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞胞变形，谷氨酸形，谷氨酸向膜外漏出，向膜外漏出，积累于累于发酵液中酵液中控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成50控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成添加表面活性剂添加表面活性剂使用生物素使用生物素过量的原料（如糖蜜等）量的原料（如糖蜜等）发酵生酵生产谷氨酸谷氨酸时，通，通过添添加表面活性加表面活性剂（如吐温（如吐温60）或是高）或是高级饱和脂肪酸（和脂肪酸（C1618）及其）及其亲水聚醇水聚醇酯类，同，同样能清除渗透障碍物，大量能清除渗透障碍物，大量积累谷氨酸累谷氨酸作用机制：表面活性作用机制：表面活性剂、高、高级饱和脂肪酸的作用，并不在于它的和脂肪酸的作用，并不在于它的表面效果，而是在不表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成和脂肪酸的合成过程中，作程中，作为生物素的拮生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通过拮抗脂肪酸的生物合成，拮抗脂肪酸的生物合成，导致磷脂合成不足，致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的果形成磷脂不足的细胞膜，提高了胞膜，提高了细胞膜胞膜对谷氨酸的渗透性谷氨酸的渗透性控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成51控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成油酸缺陷型油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸行谷氨酸发酵，通酵，通过限制限制发酸培养基中油酸培养基中油酸的酸的浓度而控制磷脂的合成。度而控制磷脂的合成。作用机制：由于油酸缺陷突作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，株阻断了油酸的后期合成，丧失了失了自身合成油酸的能力；即自身合成油酸的能力；即丧失脂肪酸生物合成能力，必失脂肪酸生物合成能力，必须由外界由外界供供给油酸，才能生油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和量的多少和细胞膜的渗透性；通胞膜的渗透性；通过控制油酸控制油酸亚适量，使磷脂合成适量，使磷脂合成量减少到正常量的量减少到正常量的1/2左右左右时，细胞胞变形，谷氨酸分泌于形，谷氨酸分泌于细胞外胞外控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成52控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成甘油缺陷型甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸行谷氨酸发酵，通酵，通过限制限制发酵培养基中甘酵培养基中甘油的油的浓度而控制磷脂的合成度而控制磷脂的合成作用机制：甘油缺陷突作用机制：甘油缺陷突变株的株的遗传阻碍是阻碍是丧失失-磷酸甘油脱磷酸甘油脱氢酶酶，所以自身不能合成所以自身不能合成-磷酸甘油和磷脂，必磷酸甘油和磷脂，必须由外界供由外界供给甘油才能甘油才能生生长。在甘油限量供。在甘油限量供应下，由于控制了下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量，从而使谷氨酸得以关系的磷脂含量，从而使谷氨酸得以积累累控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成53控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成温度敏感突变株温度敏感突变株温度敏感突温度敏感突变株是通株是通过诱变得到的在低温下生得到的在低温下生长，而在高温下却，而在高温下却不能生不能生长繁殖的突繁殖的突变株。利用温度敏感突株。利用温度敏感突变株株进行谷氨酸行谷氨酸发酵酵时，由于由于仅控制温度就能控制温度就能实现谷氨酸生谷氨酸生产，所以又把，所以又把这种新工种新工艺称称为物理控制方法。物理控制方法。作用机制：温度敏感突作用机制：温度敏感突变株的突株的突变位置是位置是发生在决定与谷氨酸分生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的泌有密切关系的细胞膜的胞膜的结构基因上，构基因上，发生碱基的生碱基的转换或或颠换，这样为基因所指基因所指导译出的出的酶酶，在高温，在高温时失活，失活，导致致细胞膜某些胞膜某些结构的改构的改变控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成54控制细胞壁的合成通通过控制控制细胞壁的合成，形成不完全的胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，胞壁，进而而导致形成不完全致形成不完全的的细胞膜，胞膜，间接控制接控制细胞膜通透性。胞膜通透性。这可以通可以通过在在发酵酵对数生数生长期的期的早期，添加青霉素或早期，添加青霉素或头孢霉素霉素C等抗生素来等抗生素来实现。作用机制：添加青霉素是抑制谷氨酸作用机制：添加青霉素是抑制谷氨酸产生菌生菌细胞壁的后期合成，主要胞壁的后期合成，主要是抑制糖是抑制糖肽转肽酶酶，影响，影响细胞壁糖胞壁糖肽的生物合成的生物合成控制细胞壁的合成通过控制细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进55日常菌种工作定期分定期分纯 一般一般12个月分个月分纯次，把次，把产酸高、生酸高、生长快、无噬菌体感染的菌株挑快、无噬菌体感染的菌株挑选出来出来小小剂量量诱变刺激刺激 用紫外用紫外线(1020s)、通、通电、激光等、激光等轻微微处理，可以淘汰生理，可以淘汰生长微弱的菌微弱的菌株，并能激株，并能激发溶原性噬菌体，使挑溶原性噬菌体，使挑选出来的菌是出来的菌是产酸高、生酸高、生长旺盛、旺盛、无噬菌体感染的无噬菌体感染的优良菌株良菌株高高产菌制做安瓿管菌制做安瓿管 通通过诱变育种或分育种或分纯挑出来的高挑出来的高产菌株，要菌株，要马上做安瓿管，防止菌种上做安瓿管，防止菌种变异异日常菌种工作定期分纯56谷氨酸发酵的代谢控制育种策略（进通节堵出）选育耐高渗透压菌种选育耐高渗透压菌种选育不分解利用谷氨酸的突变株选育不分解利用谷氨酸的突变株选育细胞膜渗透性好的突变株选育细胞膜渗透性好的突变株选育强化选育强化CO2固定反应的突变株固定反应的突变株选育减弱乙醛酸循环的突变株选育减弱乙醛酸循环的突变株选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株酮戊二酸代谢的突变株选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育强化能量代谢的突变株选育强化能量代谢的突变株选育减弱选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株途径后段酶活性的突变株谷氨酸发酵的代谢控制育种策略（进通节堵出）选育耐高渗透压菌种57选育耐高渗透压菌种耐高糖突耐高糖突变株株 选育在含育在含2030葡萄糖的平板上生葡萄糖的平板上生长好的突好的突变株株耐高谷氨酸突耐高谷氨酸突变株株 选育在含育在含1520味精的平板上生味精的平板上生长好的突好的突变株株耐高糖、高谷氨酸突耐高糖、高谷氨酸突变株株 选育在含育在含20葡萄糖和葡萄糖和15味精的平板上生味精的平板上生长好的突好的突变株株选育耐高渗透压菌种耐高糖突变株58选育不分解利用谷氨酸的突变株谷氨酸谷氨酸发酵，目的是酵，目的是积累谷氨酸累谷氨酸如果菌种一如果菌种一边合成谷氨酸，一合成谷氨酸，一边分解利用谷氨酸，就达不到分解利用谷氨酸，就达不到积累累谷氨酸的目的谷氨酸的目的所以必所以必须使菌种不能分解利用谷氨酸，切断使菌种不能分解利用谷氨酸，切断-酮戊二酸戊二酸继续向下向下氧化的反氧化的反应，即，即选育以谷氨酸育以谷氨酸为唯一碳源菌体不唯一碳源菌体不长或生或生长微弱的微弱的突突变株株选育不分解利用谷氨酸的突变株谷氨酸发酵，目的是积累谷氨酸59选育细胞膜渗透性好的突变株 谷氨酸谷氨酸产生菌生菌细胞膜渗透性的改胞膜渗透性的改变是是发酵法生酵法生产谷氨酸的关谷氨酸的关键抗抗Vp类衍生物衍生物 据有关据有关资料料报道，抗道，抗Vp类衍生物如香豆素、芦丁等能衍生物如香豆素、芦丁等能遗传性地改性地改变细胞膜的渗透性胞膜的渗透性选育溶菌育溶菌酶酶敏感性突敏感性突变株株选育二氨基庚二酸缺陷突育二氨基庚二酸缺陷突变株株选育温度敏感突育温度敏感突变株株选育细胞膜渗透性好的突变株 谷氨酸产生菌细胞膜渗透性的改60选育强化CO2固定反应的突变株选育以琥珀酸育以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株快、大的菌株 以琥珀酸为唯一碳源，菌体要想生长，碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反以琥珀酸为唯一碳源，菌体要想生长，碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应。菌休生长越快，四碳二羧酸的脱羧反应越强，而四碳二羧酸的脱羧反应。菌休生长越快，四碳二羧酸的脱羧反应越强，而四碳二羧酸的脱羧反应与二氧化碳固定反应是相同酶所催化的，所以以琥珀酸为唯一碳源，菌应与二氧化碳固定反应是相同酶所催化的，所以以琥珀酸为唯一碳源，菌体长得越好，二氧化碳固定反应越强体长得越好，二氧化碳固定反应越强 选育氟丙育氟丙酮酸敏感性突酸敏感性突变株株 氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，菌种对氟丙酮酸越敏感，说明菌种丙氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，菌种对氟丙酮酸越敏感，说明菌种丙酮酸向乙酰酮酸向乙酰CoA的转化反应越弱，相对地的转化反应越弱，相对地CO2固定反应比例也就越大固定反应比例也就越大选育丙育丙酮酸缺陷、天冬氨酸缺陷突酸缺陷、天冬氨酸缺陷突变株株克隆丙克隆丙酮酸酸羧化化酶酶基因基因选育强化CO2固定反应的突变株选育以琥珀酸为唯一碳源的培养基61选育减弱乙醛酸循环的突变株选育琥珀酸敏感型突育琥珀酸敏感型突变株株 琥珀酸是乙醛酸循环关键酶异柠檬酸裂解酶的阻遏物，菌种对琥珀酸是乙醛酸循环关键酶异柠檬酸裂解酶的阻遏物，菌种对琥珀酸越敏感，异柠檬酸裂解酶的合成能力越弱，乙醛酸循环琥珀酸越敏感，异柠檬酸裂解酶的合成能力越弱，乙醛酸循环就越弱就越弱 选育不利用乙酸的突育不利用乙酸的突变株株利用基因工程技利用基因工程技术，使异，使异柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶活力降低活力降低选育减弱乙醛酸循环的突变株选育琥珀酸敏感型突变株62选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株选育育柠檬酸合成檬酸合成酶强酶强的突的突变株株 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，强化该酶能加柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，强化该酶能加强谷氨酸的生物合成强谷氨酸的生物合成 选育抗氟乙酸、氟化育抗氟乙酸、氟化钠、氮、氮丝氨酸和氟氨酸和氟柠檬檬酸等突酸等突变株株 抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬酸都是乌头酸抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬酸都是乌头酸酶的抑制剂，抗这些物质的突变株，可强化乌头酸酶的酶的抑制剂，抗这些物质的突变株，可强化乌头酸酶的活力活力 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株选育柠63选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育耐高谷氨酸的突育耐高谷氨酸的突变株株选育谷氨酸育谷氨酸结构构类似物抗性突似物抗性突变株，如谷氨酸株，如谷氨酸氧氧肟酸酸盐抗性突抗性突变株株选育谷氨育谷氨酰胺抗性突胺抗性突变株株选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育耐高谷氨酸的64选育强化能量代谢的突变株 谷氨酸高产菌的两个显著持点：谷氨酸高产菌的两个显著持点：-酮戊二酸继续向下氧化酮戊二酸继续向下氧化的能力缺陷和乙醛酸循环弱，使能量代谢受阻；的能力缺陷和乙醛酸循环弱，使能量代谢受阻；TCA循环循环前一阶段的代谢减慢。强化能量代谢，可补救上述两点不前一阶段的代谢减慢。强化能量代谢，可补救上述两点不足，使足，使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成的速度加快循环前一段代谢加强，谷氨酸合成的速度加快 选育呼吸抑制育呼吸抑制剂抗性突抗性突变株株 可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株 选育育ADP磷酸化抑制磷酸化抑制剂抗性突抗性突变株株 可选育可选育2,4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株 选育抑制能量代育抑制能量代谢的抗生素的抗性突的抗生素的抗性突变株株 可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株 选育强化能量代谢的突变株 65选育减弱选育减弱HMP途径后段酶活性的途径后段酶活性的突变株突变株选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生生长的突的突变株株选育抗育抗嘌嘌呤、呤、嘧啶类似物的突似物的突变株株选育抗核苷酸育抗核苷酸类抗生素突抗生素突变抹，如德夸菌素、抹，如德夸菌素、狭雷素狭雷素C抗性突抗性突变株株选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株选育莽草酸缺陷型或添加芳66Chapter3 L-亮氨酸亮氨酸Chapter3 L-亮氨酸67L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制亮氨酸生物合成的代谢调节机制 L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制 68丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，-酮基异戊酸是合成L-缬氨酸的直接前体物，又是合成L-亮氨酸间接前体物。催化丙酮酸生成-酮基异戊酸的酶系，与催化-酮基丁酸生成-酮基-甲基戊酸的酶系是相同的，这些酶的合成均受到三种支链氨基酸的协同反馈阻遏。其中的乙酰羟基酸合成酶是由丙酮酸合成-酮基异戊酸的关键（限速）酶，还受到L-缬氨酸的反馈抑制。在由-酮基异戊酸合成L-亮氨酸过程中，-异丙基苹果酸合成酶是关键（限速）酶，受到L-亮氨酸的反馈抑制和阻遏。乙酰羟基酸合成酶对-酮基丁酸的亲和力比对丙酮酸的高。-异丙基苹果酸合成酶对-酮基异戊酸的亲和力比支链氨基酸转氨酶对-酮基异戊酸的亲和力约高十倍。所以，三种支链氨基酸生物合成的优先顺序为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。据此可知，在-酮基丁酸之前减弱或切断异亮氨酸的代谢流，对亮氨酸的优先合成有重要作用。丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，-酮基异戊69L-亮氨酸产生菌的育种策略亮氨酸产生菌的育种策略 出发菌株的选择出发菌株的选择 目前棒杆菌属、短杆菌属的目前棒杆菌属、短杆菌属的L-亮氨酸生物合成途径及亮氨酸生物合成途径及其调节机制已弄清，以鼠伤寒沙门氏菌（其调节机制已弄清，以鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、谷氨酸棒杆菌（）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、粘质赛氏杆菌（）、粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）、）、乳糖发酵短杆菌（乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、）、钝齿棒杆菌（钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）、黄色短杆）、黄色短杆菌（菌（Brevibacterium flavum）为出发菌株，均有选育出）为出发菌株，均有选育出L-亮氨酸高产菌的文献报道亮氨酸高产菌的文献报道 L-亮氨酸产生菌的育种策略 出发菌株的选择70切断进一步代谢途径切断进一步代谢途径要大量积累L-亮氨酸，需切断或减弱亮氨酸进一步向下代谢的途径，使合成的亮氨酸不再被消耗，如选育以L-亮氨酸为唯一碳源不能生长或生长微弱的突变株 切断进一步代谢途径71解除反馈抑制与阻遏解除反馈抑制与阻遏 解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰羟基酸合成酶等3个共用酶的协同反馈阻遏作用解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用 解除L-亮氨酸对-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和阻遏作用以上可通过使菌体带上L-亮氨酸和L-缬氨酸结构类似物抗性标记(如：2-TAr、-ABr、-HLr、Valr等遗传标记)来实现 解除反馈抑制与阻遏 解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰72减弱或切断支路代谢，并增加前体物的合成减弱或切断支路代谢，并增加前体物的合成 选育异亮氨酸缺陷突变株来解除3个共用酶受所到的反馈阻遏 选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突变株，可增大L-亮氨酸生物合成代谢流，节约碳源，从而有利于L-亮氨酸产量的提高。选育以琥珀酸为唯一碳源生长微弱的突变株，即可获得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱的突变株减弱或切断支路代谢，并增加前体物的合成 选育异亮氨酸缺陷突变73改变菌体的正常代谢改变菌体的正常代谢筛选磺胺胍抗性标记（SGr）菌株，在氨基酸产生菌选育上具有普遍提高产酸能力的作用，关于其详细机制，尚未见到令人信服的报道。一般认为，磺胺胍是细菌的生长因子-对氨基苯甲酸（PAPA）的结构类似物，而PAPA是叶酸的一个组分，不少细菌要求外界提供PAPA以合成其代谢中必不可少的辅酶-四氢叶酸，因而二者起竞争性拮抗作用。一旦菌株带有磺胺胍抗性标记，菌体的正常代谢发生改变，从而导致像氨基酸这样的代谢产物大量的积累 改变菌体的正常代谢筛选磺胺胍抗性标记（SGr）菌株，在氨基酸74改变菌体的正常代谢改变菌体的正常代谢筛选利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮氨酸产量提高，其机制尚不清楚，可能是通过改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。利福平为半合成广谱抗菌素，对革兰氏阳性和阴性细菌以及结核分支杆菌均有明显抗菌效应。抗菌机理是：通过与细菌RNA聚合酶的亚基结合，抑制细菌RNA聚合酶的活性，妨碍细菌RNA转录的启始。但是RNA转录一旦开始，利福平则不起作用 改变菌体的正常代谢筛选利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮75利用基因工程技术构建利用基因工程技术构建L-亮氨酸工程菌亮氨酸工程菌基因工程技术主要通过目的基因扩增，增加生物合成途径中的限速酶，以提高目的产物的产量。从L-亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制可知，-异丙基苹果酸合成酶是L-亮氨酸生物合成途径中真正意义上的限速酶，将编码该酶的基因克隆到L-亮氨酸产生菌中，增加该酶的数量，以解除其“瓶颈”的限速作用，从而提高L-亮氨酸的产量 利用基因工程技术构建L-亮氨酸工程菌76综合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高产菌可以带有的遗传标记为天冬氨酸族氨基酸缺陷，如：蛋氨酸缺陷（Met-）、异亮氨酸缺陷（Ile-）等；脯氨酸或丙氨酸缺陷（Ala-）；结构类似物抗性，如：2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）、-氨基丁酸抗性(-ABr)、-羟基亮氨酸抗性（-HLr）、亮氨酸氧肟酸盐抗性（LeuHxr）或缬氨酸抗性（Valr）、磺胺胍抗性(SGr)和利福平抗性(Rifr)等 综合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高产菌可以带有的遗传标记为77氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略课件78Chapter4 L-缬氨酸缬氨酸Chapter4 L-缬氨酸79L-缬氨酸的生物合成途径缬氨酸的生物合成途径 L-缬氨酸的生物合成途径 80代谢调节机制丙酮酸是L-缬氨酸的直接前体物，催化丙酮酸生成-乙酰异戊酸的酶系，与催化-酮基丁酸生成-酮基-甲基戊酸的酶系是相同的。这些酶的合成均受到三种分支链氨基酸的协同阻遏。其中-乙酰乳酸合成酶是L-缬氨酸生物合成途径中的关键酶，受到L-缬氨酸的反馈抑制。L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的最后一步转氨反应都是由同一种转氨酶催化完成的。代谢调节机制81L-缬氨酸高产菌株的育种思路缬氨酸高产菌株的育种思路 出发菌株的选择出发菌株的选择:目前，世界上利用发酵法生产L-缬氨酸的出发菌株有北京棒杆菌（Corynebacterium pekineise），谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutacium），乳糖发酵短杆菌34(Brevibacterium lactofermentum)，大肠杆菌（Escherichia coli），黄色短杆菌（Brevibacterium flavum），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens），芽孢杆菌属（Bacillus）和埃希氏菌属（Escherichia）的菌株等，这些菌株均可以作为选育L-缬氨酸生产菌的出发菌株 L-缬氨酸高产菌株的育种思路 出发菌株的选择:目前，世界上82切断或改变平行代谢途径切断或改变平行代谢途径 L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途径是平行进行的，L-缬氨酸、L-亮氨酸与L-异亮氨酸的生物合成途径中共用了三种酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育L-亮氨酸、L-异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的共用酶系完全用于L-缬氨酸的生物合成，进而提高L-缬氨酸的产量。-酮基异戊酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物。切断L-亮氨酸的合成途径不仅可以节省碳源而且解除了菌体生成L-缬氨酸酶系的反馈抑制和多价阻遏，使-异丙基苹果酸合成酶脱敏，显著提高L-缬氨酸的产量 切断或改变平行代谢途径 L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途83解除菌体自身的反馈调节解除菌体自身的反馈调节L-缬氨酸合成中的第一个限速酶乙酰乳酸合成酶受L-缬氨酸的反馈抑制，同时L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成酶系受三个末端：即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的多价阻遏。如果解除乙酰乳酸合成酶的反馈抑制和L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸生物酶系的多价阻遏，必将大大提高L-缬氨酸的积累。可选育L-缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除L-缬氨酸的反馈调节。常用的L-缬氨酸结构类似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、-氨基丁酸（-AB）、氟亮氨酸、正L-缬氨酸等 解除菌体自身的反馈调节L-缬氨酸合成中的第一个限速酶乙酰乳84增加前体物质的合成增加前体物质的合成 L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸，为了积累更多的L-缬氨酸，必须提高丙酮酸的产量，可以选育以琥珀酸为唯一碳源生长慢、丙氨酸缺陷型以及氟丙酮敏感突变株来达到目的 增加前体物质的合成 L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸，为85切断进一步代谢途径要积累大量L-缬氨酸，需切断或减弱L-缬氨酸进一步向下的代