聚合酶链反应及基因突变检测方法课件

聚合酶链反应聚合酶链反应及基因突变检测方法及基因突变检测方法上海交通大学医学院刘湘帆 讲师1感谢你的观看2109年5月18日聚合酶链反应及基因突变检测方法上海交通大学医学院1感谢你n n聚合酶链式反应聚合酶链式反应于于1983年由美国年由美国Cetus公司的公司的K.Mullis建立，并建立，并和定点突变的发明者和定点突变的发明者M.SmithM.Smith一起荣获一起荣获19931993年度诺贝尔化学奖，年度诺贝尔化学奖，为为生命科学领域的研究开创了崭新时代。生命科学领域的研究开创了崭新时代。2感谢你的观看2109年5月18日聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.MullPCR反应的特点n n特异性强特异性强特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 n n灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 指数增长指数增长指数增长指数增长，从从从从pg(10pg(10-12-12)可扩增至可扩增至可扩增至可扩增至 m m m mg(10g(10-6-6)水平水平水平水平 n n简便、快速简便、快速简便、快速简便、快速 2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增小时完成扩增小时完成扩增n n对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 DNA DNA 粗制品及总粗制品及总粗制品及总粗制品及总RNARNA均可作为扩增模板均可作为扩增模板均可作为扩增模板均可作为扩增模板 3感谢你的观看2109年5月18日PCR反应的特点特异性强3感谢你的观看2109年5月18日一、PCR反应原理和反应过程DNA的的体体外外复复制制包包括括3 3个个步步骤骤：n n变变性性（denaturation）:94 C C 95 C C n n退退火火（annealing）:40 C C 70 C C n n延延伸伸（extension）:72 C C 3 3个个步步骤骤作作为为PCR的的一一个个循循环环，每每当当完完成成一一个个循循环环，一一个个分分子子的的模模板板被被复复制制为为二二个个，产产物物量量以以指指数数形形式式增增长长。4感谢你的观看2109年5月18日一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：4PCR原理原理5533d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5353535353535353添加反应混合液添加反应混合液及样本及样本变性变性535353535353退火退火加入试管中加入试管中5感谢你的观看2109年5月18日PCR原理5533d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5延伸延伸53535353继续延伸继续延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循环循环PCR原理原理6感谢你的观看2109年5月18日延伸53535353继续延伸53535353535355335353第二个循环第二个循环4个拷贝个拷贝第三个循环第三个循环8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353第第n个循环个循环2n个拷贝个拷贝PCR原理原理7感谢你的观看2109年5月18日53535353553353594 C(30 s)40-60 C(30 s)72 C(30-60 s/kb)MeltAnnealExtendThe Polymerase Chain Reaction(PCR)1820-30X8感谢你的观看2109年5月18日94 C40-60 C72 CMeltAnnealEx94 C(30 s)40-60 C(30 s)72 C(30-60 s/kb)MeltAnnealExtendCycle#2NIH20-30X9感谢你的观看2109年5月18日94 C40-60 C72 CMeltAnnealEx10感谢你的观看2109年5月18日10感谢你的观看2109年5月18日11感谢你的观看2109年5月18日11感谢你的观看2109年5月18日二、二、PCR的反应体系和反应条件的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。12感谢你的观看2109年5月18日二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系12感谢你1模板n n包括基因组包括基因组包括基因组包括基因组DNADNA、RNARNA、质粒质粒质粒质粒DNADNA、线粒体线粒体线粒体线粒体DNADNA等等等等n n模板模板模板模板DNADNA需较高的浓度需较高的浓度需较高的浓度需较高的浓度n nRNARNA作为模板时，须先将作为模板时，须先将作为模板时，须先将作为模板时，须先将RNARNA逆转录为逆转录为逆转录为逆转录为cDNAcDNA，再再再再以以以以 cDNA cDNA作为作为作为作为扩增的模板扩增的模板扩增的模板扩增的模板n n模板量：模板量：模板量：模板量：1000100010001000ngng、500ng500ng、100ng100ng、50ng50ng13感谢你的观看2109年5月18日1 模板13感谢你的观看2109年5月18日2、引物（Primers)引物决定引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段是化学合成的寡核苷酸片段n n化学合成的寡核苷酸化学合成的寡核苷酸n n能与模板特异地结合能与模板特异地结合n n引物决定产物的特异性和长度引物决定产物的特异性和长度n n引物设计引物设计时必须遵循一些原则时必须遵循一些原则 14感谢你的观看2109年5月18日2、引 物（Primers)引物决定PCR扩增产物的设计引物的原则：n n二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补链序列互补链序列互补链序列互补n n长度为长度为长度为长度为18181818 25252525个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸n n二条引物之间避免形成引物二聚体二条引物之间避免形成引物二聚体二条引物之间避免形成引物二聚体二条引物之间避免形成引物二聚体n n引物的碱基组成应平衡引物的碱基组成应平衡引物的碱基组成应平衡引物的碱基组成应平衡n n引物退火温度计算：引物退火温度计算：引物退火温度计算：引物退火温度计算：Tm=2Tm=2（A+TA+T）+4+4（C+GC+G）n n引物的引物的引物的引物的5555端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）点、生物素等标记）点、生物素等标记）点、生物素等标记）引物浓度：引物浓度：0.1 0.2umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体浓度过高容易生成引物二聚体15感谢你的观看2109年5月18日设计引物的原则：二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负3、脱氧核苷三磷酸（、脱氧核苷三磷酸（dNTP）n n是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物 n n 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 n n 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加 dNTPdNTP浓度：浓度：浓度：浓度：2020 200200umol/L,umol/L,浓度升高增加非特异性扩增浓度升高增加非特异性扩增浓度升高增加非特异性扩增浓度升高增加非特异性扩增16感谢你的观看2109年5月18日3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGT4、DNA聚合酶n n从一种生活在热泉（从一种生活在热泉（从一种生活在热泉（从一种生活在热泉（80908090）中的水栖）中的水栖）中的水栖）中的水栖 噬热菌（噬热菌（噬热菌（噬热菌（Thermus aquaticus,TaqThermus aquaticus,Taq）中提取，中提取，中提取，中提取，有很高的耐热稳定性有很高的耐热稳定性有很高的耐热稳定性有很高的耐热稳定性 n nTaq Taq 酶的作用酶的作用酶的作用酶的作用:模板指导下，以模板指导下，以模板指导下，以模板指导下，以dNTPdNTP为原料，在引物为原料，在引物为原料，在引物为原料，在引物3-3-OHOH末端加末端加末端加末端加上脱氧单核苷酸，形成上脱氧单核苷酸，形成上脱氧单核苷酸，形成上脱氧单核苷酸，形成3,5-3,5-磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNADNA链沿链沿链沿链沿5353方向延伸，催化方向延伸，催化方向延伸，催化方向延伸，催化DNADNA合成。合成。合成。合成。最适酶量：最适酶量：最适酶量：最适酶量：1-2.51-2.5U U （酶量过多，导致非特异性扩增）酶量过多，导致非特异性扩增）酶量过多，导致非特异性扩增）酶量过多，导致非特异性扩增）17感谢你的观看2109年5月18日4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（8090）中的水栖1n nTaq DNA聚合酶复制的保真性：聚合酶复制的保真性：n nTaq DNA聚合酶无聚合酶无3 5外切酶活性，因而外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。基错配。n nTaq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为变率为1/30000，碱基替换率为，碱基替换率为1/8000，故扩，故扩增的片段越长，错配的机率越高。增的片段越长，错配的机率越高。18感谢你的观看2109年5月18日Taq DNA聚合酶复制的保真性：18感谢你的观看2109年n n耐热的耐热的 DNA多聚酶：多聚酶：n nPwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率的保真性，降低碱基错配率2 10倍。倍。19感谢你的观看2109年5月18日耐热的 DNA多聚酶：19感谢你的观看2109年5月18日5、镁离子浓度n n镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高系统本身、稳定核苷酸和提高系统本身、稳定核苷酸和提高系统本身、稳定核苷酸和提高Taq Taq 酶的活性有直酶的活性有直酶的活性有直酶的活性有直接影响接影响接影响接影响 虽然虽然虽然虽然Taq Taq 酶的活性只与游离的酶的活性只与游离的酶的活性只与游离的酶的活性只与游离的MgMg2+2+浓度有关，浓度有关，浓度有关，浓度有关，但但但但PCRPCR反应体系中反应体系中反应体系中反应体系中dNTPdNTP、引物、模板引物、模板引物、模板引物、模板DNADNA及及及及 鳌合剂的存在均可与鳌合剂的存在均可与鳌合剂的存在均可与鳌合剂的存在均可与MgMg2+2+结合而降低游离结合而降低游离结合而降低游离结合而降低游离 MgMg2+2+的浓度从而影响酶的活性。的浓度从而影响酶的活性。的浓度从而影响酶的活性。的浓度从而影响酶的活性。当当当当dNTPdNTP浓度为浓度为浓度为浓度为200200umol/Lumol/L时，时，时，时，MMgCl2gCl2的浓度为的浓度为的浓度为的浓度为1 1.5.5mmol/Lmmol/L较宜。较宜。较宜。较宜。20感谢你的观看2109年5月18日5、镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应20感6、其它反应因素n npHpH：调节至酶反应所需的最适调节至酶反应所需的最适调节至酶反应所需的最适调节至酶反应所需的最适pHpH（pH=7.2 pH=7.2左右左右左右左右）n n盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交与模板杂交与模板杂交与模板杂交n n基质：基质：基质：基质：BSABSA、gelatin gelatin、Tween20Tween20、DTTDTT等（等（等（等（牛血清牛血清牛血清牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护白蛋白或明胶等基质可以保护白蛋白或明胶等基质可以保护白蛋白或明胶等基质可以保护Taq Taq 酶的活性）酶的活性）酶的活性）酶的活性）21感谢你的观看2109年5月18日6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（pH（二）PCR的反应条件 n n反应温度（变性、退火、延伸）反应温度（变性、退火、延伸）n n反应时间（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）n n循环次数（循环次数（PCR效率及产物量）效率及产物量）22感谢你的观看2109年5月18日（二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸）22感谢1、温度 变性温度：变性温度：94 94 97 97 退火温度：低于引物退火温度：低于引物TmTm 5 5 左右左右 温度过高：降低扩增效率；温度过高：降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：延伸温度：7272度，此时度，此时TaqTaq酶具有较高的酶酶具有较高的酶 促活性促活性23感谢你的观看2109年5月18日1、温度 变性温度：94 97 23感谢你的2、时间 第一次变性应给予足够时间（第一次变性应给予足够时间（5 7分钟）分钟）每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为一般为30秒秒 1分钟，时间过长易导致非特分钟，时间过长易导致非特异性扩增异性扩增24感谢你的观看2109年5月18日2、时间 第一次变性应给予足够时间（5 7分钟）24感3、循环次数n n重复次数一般设为重复次数一般设为重复次数一般设为重复次数一般设为25253535个循环个循环个循环个循环n n扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应：理论上，理论上，理论上，理论上，PCRPCR反应产物呈指数性增长，但这种反应产物呈指数性增长，但这种反应产物呈指数性增长，但这种反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增增长形式在扩增增长形式在扩增增长形式在扩增25-2525-25个循环以后便放慢直至停个循环以后便放慢直至停个循环以后便放慢直至停个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长环次数的增加而呈指数增长环次数的增加而呈指数增长环次数的增加而呈指数增长25感谢你的观看2109年5月18日3、循环次数 重复次数一般设为2535个循环25感谢你的观n指数增长期n线形增长期n平台期循环数#理论值 实际值Log 产物DNAPCR过程的实时监测26感谢你的观看2109年5月18日指数增长期循环数#理论值 实际值Log 产物DNn n平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。初始量越多，平台出现得越早。n n平台效应产生的因素：平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞片段间的竞争等争等27感谢你的观看2109年5月18日平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置实验室的规范化设置：试剂贮存和准备区试剂贮存和准备区标本制备区标本制备区扩增反应区扩增反应区产物分析区产物分析区 PCRPCR技术的质量保证技术的质量保证：基因扩增检验的全过程的质量保证基因扩增检验的全过程的质量保证室内质量控制和室间质量评价室内质量控制和室间质量评价 PCRPCR实验系统中的污染源及防污染措施实验系统中的污染源及防污染措施 28感谢你的观看2109年5月18日三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置28感谢你的n n防污染体系：防污染体系：n n正确设置实验室、严格规范实验操作、完整正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量29感谢你的观看2109年5月18日防污染体系：29感谢你的观看2109年5月18日（二）（二）PCR技术的质量保证技术的质量保证分析前因素分析前因素分析前因素分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存：标本采集、运送、稳定化处理、贮存：标本采集、运送、稳定化处理、贮存：标本采集、运送、稳定化处理、贮存分析中因素分析中因素分析中因素分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）分析后因素分析后因素分析后因素分析后因素：报告形式、反馈的信息等：报告形式、反馈的信息等：报告形式、反馈的信息等：报告形式、反馈的信息等30感谢你的观看2109年5月18日（二）PCR技术的质量保证30感谢你的观看2109年5月18第二节 以PCR为基础的相关技术31感谢你的观看2109年5月18日第二节 以PCR为基础的相关技术31感谢你的观看2109年5以PCR为基础的相关技术n n逆转录逆转录逆转录逆转录PCRPCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)(reverse transcription PCR,RT-PCR)n n定量定量定量定量PCRPCR(quantitative PCR)(quantitative PCR)n n多重多重多重多重PCRPCR(multiplex PCR)(multiplex PCR)n n免疫免疫免疫免疫PCRPCRn n差异显示差异显示差异显示差异显示PCR(differential display PCR,DD-PCR(differential display PCR,DD-PCR)PCR)n nPCRPCR诱导定点突变诱导定点突变诱导定点突变诱导定点突变n n原位原位原位原位PCR(in situ PCR)PCR(in situ PCR)32感谢你的观看2109年5月18日以PCR为基础的相关技术逆转录PCR(reverse tr一、逆转录PCR（RT-PCR）n n以以细细胞胞内内总总RNA或或mRNA为为材材料料进进行行体体外外扩扩增增的的技技术术。n n主主要要用用于于克克隆隆 cDNA、合合成成cDNA探探针针，检检测测RNA病病毒毒、分分析析基基因因表表达达等等33感谢你的观看2109年5月18日一、逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为逆转录生成逆转录生成cDNA方式：方式：n n以随机进行的以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物逆转录反应的引物n n以以oligo(dT)作为引物，作为引物，mRNA3末端末端polyA尾与之互补尾与之互补n n以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增引物，进行扩增34感谢你的观看2109年5月18日逆转录生成cDNA方式：34感谢你的观看2109年5月18日35感谢你的观看2109年5月18日35感谢你的观看2109年5月18日二、定量PCRn n对对DNA或或RNA样本的靶序列进行定量分析。样本的靶序列进行定量分析。n n主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等n n在定量在定量PCR反应体系中，除了常规反应体系中，除了常规PCR反应所需反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。n n内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是常用的内参照基因是-肌球蛋白基因肌球蛋白基因36感谢你的观看2109年5月18日二、定量PCR对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。36绝对定量绝对定量 PCR1.外参照系统的设置2.内参照系统的设置 实时定量 PCR 对核酸扩增反应进行直接和动态的监测，实现对靶基因的实时定量分析37感谢你的观看2109年5月18日绝对定量 PCR 实时定量 PCR37感谢你的观看2109年n n荧光定量荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），），又称实时又称实时PCR，是目前较精是目前较精确的进行定量检测确的进行定量检测PCR的方法的方法n nFQ-PCR通过荧光信号对通过荧光信号对PCR过程中产物量进过程中产物量进行实时监测，行实时监测，精确计算出精确计算出PCR的初始模板量的初始模板量38感谢你的观看2109年5月18日荧光定量PCR（fluorescence quantitat荧光信号的检测方法：荧光信号的检测方法：n n1 1、DNA结合染料技术结合染料技术n n2 2、水解探针技术（、水解探针技术（TaqMan probe）技术技术n n3 3、杂交探针技术、杂交探针技术39感谢你的观看2109年5月18日荧光信号的检测方法：39感谢你的观看2109年5月18日40感谢你的观看2109年5月18日40感谢你的观看2109年5月18日41感谢你的观看2109年5月18日41感谢你的观看2109年5月18日42感谢你的观看2109年5月18日42感谢你的观看2109年5月18日TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ43感谢你的观看2109年5月18日TaqManTM5533d.NTPsThermal 5353TaqManTMExtension Step531.Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52.Cleavage3.PolymerizationComplete53QTaqR354.Detection533QTaqR5l lR53RQ44感谢你的观看2109年5月18日5353TaqManTMExtension Step实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用45感谢你的观看2109年5月18日实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中n n CEA 基因在消化系统上皮腺癌，尤其是直结肠癌和胃癌中高表达，因此在肿瘤细胞内可检测到其转 录本，而在正常成人体内极少表 达。46感谢你的观看2109年5月18日 CEA 基因在消化系统上皮腺癌，46感谢你的观看210正常成人体内CEA基因表达47感谢你的观看2109年5月18日正常成人体内CEA基因表达47感谢你的观看2109年5月18胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达48感谢你的观看2109年5月18日胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达48感谢你的观看2109年5n n 在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、特异的技术检测到这些肿瘤细胞 中CEA基因的转录本，是发现肿 瘤早期转移的关键。49感谢你的观看2109年5月18日 在肿瘤发生血道转移时，外周血 49感谢你的观看2109年胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达50感谢你的观看2109年5月18日胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达50感谢你的观看2109年三、多重PCRn n在同一反应体系中加入多对引物，同时扩在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。样本中多个不同序列的靶片段。DMD基因外显子缺失的检测基因外显子缺失的检测51感谢你的观看2109年5月18日三、多重PCR 在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份四、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR）n n一一种种以以逆逆转转录录PCR为为基基础础的的研研究究基基因因表表达达差差异异的的技技术术。n nDD-PCR主主要要用用于于肿肿瘤瘤和和多多种种疾疾病病的的分分子子遗遗传传学学研研究究，是是目目前前筛筛选选基基因因表表达达差差异异最最有有效效的的方方法法。52感谢你的观看2109年5月18日四、差异显示PCR（differential display 差异显示差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR)RT-PCR(Differential display RT-PCR)53感谢你的观看2109年5月18日 差异显示RT-PCR(Differentia第三节 点突变的检测技术54感谢你的观看2109年5月18日第三节 点突变的检测技术54感谢你的观看2109年5月18n nPCR-PCR-限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（PCR-RFLPPCR-RFLP）n n等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide,ASOallele specific oligonucleotide,ASO）n n单链构象多态性（单链构象多态性（单链构象多态性（单链构象多态性（single strand conformation single strand conformation polymorphism,SSCP polymorphism,SSCP）n n变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE）n n融点曲线分析（融点曲线分析（融点曲线分析（融点曲线分析（melting curve analysismelting curve analysis）n nPCRPCR产物的序列分析产物的序列分析产物的序列分析产物的序列分析 55感谢你的观看2109年5月18日PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）55感谢你点突变点突变一、已知点突变的检测方法1.PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。56感谢你的观看2109年5月18日点突变一、已知点突变的检测方法56感谢你的观看2109年5Bcl I RFLP（血友病（血友病A）57感谢你的观看2109年5月18日Bcl I RFLP（血友病A）57感谢你的观看2109年58感谢你的观看2109年5月18日58感谢你的观看2109年5月18日2.等位基因特异性寡核苷酸杂交等位基因特异性寡核苷酸杂交n n被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为1520bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降57.5，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。59感谢你的观看2109年5月18日2.等位基因特异性寡核苷酸杂交被检基因经PCR扩增后转移到膜3.DNA芯片技术（芯片技术（DNA chip）在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果。60感谢你的观看2109年5月18日3.DNA芯片技术（DNA chip）在固s4.Southern印迹杂交印迹杂交61感谢你的观看2109年5月18日s4.Southern印迹杂交61感谢你的观看2109年5二、未知点突变的检测方法二、未知点突变的检测方法1.1.单链构象多态性（单链构象多态性（单链构象多态性（单链构象多态性（single-strand conformational single-strand conformational polymorphism polymorphism，SSCPSSCP）突变突变DNADNA的的PCRPCR产物经变性后产生两条与正产物经变性后产生两条与正常常DNADNA构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电电泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，从从而能区别正常与突变的而能区别正常与突变的DNADNA。SSCPSSCP只适用于检只适用于检测测150200bp150200bp长度的长度的DNADNA片段。片段。62感谢你的观看2109年5月18日二、未知点突变的检测方法1.单链构象多态性（single-63感谢你的观看2109年5月18日63感谢你的观看2109年5月18日2.变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGE）n n利用不同序列的利用不同序列的DNADNA分子具有不同的融点温度分子具有不同的融点温度(TmTm)的特性。设计引物时使被扩增的目的片段含的特性。设计引物时使被扩增的目的片段含有有2 2个不同的区域，一个个不同的区域，一个TmTm较高，另一个较低，较高，另一个较低，将该将该PCRPCR产物在由变性剂形成的梯度凝胶上进行产物在由变性剂形成的梯度凝胶上进行电泳，由于正常序列的电泳，由于正常序列的PCRPCR产物与突变的产物与突变的 PCR PCR 产物的产物的TmTm不同，在电泳过程中不同，在电泳过程中TmTm较低的区域被较低的区域被部分解链的先后不同，造成电泳迁移率的变化也部分解链的先后不同，造成电泳迁移率的变化也不同，最后在凝胶中所处的电泳位置也不同，据不同，最后在凝胶中所处的电泳位置也不同，据此可以区别正常片段与突变片段。此可以区别正常片段与突变片段。64感谢你的观看2109年5月18日2.变性梯度凝胶电泳（DGGE）利用不同序列的DNA分子具65感谢你的观看2109年5月18日65感谢你的观看2109年5月18日3.异源双链分析异源双链分析（heteroduplex analysis，HA）正常DNA和突变DNA在一起变性后再缓慢复性，可使两者互补形成异源杂合双链，并在错配处形成一个凸起。在非变性凝胶电泳时，异源双链片段会产生与相应的同源双链片段不同的迁移率，从而使二者分开。66感谢你的观看2109年5月18日3.异源双链分析（heteroduplex analysi67感谢你的观看2109年5月18日67感谢你的观看2109年5月18日4.熔点曲线分析熔点曲线分析(melting curve analysis）DNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的Tm较完全配对的同源双链的Tm低，在仪器上显示出不同的曲线从而将突变序列检测出来。所需仪器如高效液相色谱仪(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系统、LightCycler等。68感谢你的观看2109年5月18日4.熔点曲线分析(melting curve analys69感谢你的观看2109年5月18日69感谢你的观看2109年5月18日5.DNA序列分析序列分析（DNA sequencing）Sanger测序技术：以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。70感谢你的观看2109年5月18日5.DNA序列分析（DNA sequencing）S71感谢你的观看2109年5月18日71感谢你的观看2109年5月18日PCR测序演示版测序演示版1272感谢你的观看2109年5月18日PCR测序演示版1272感谢你的观看2109年5月18日第四节 PCR技术在分子诊断中的应用73感谢你的观看2109年5月18日第四节 PCR技术在分子诊断中的应用73感谢你的观看2109PCR技术在分子诊断中的应用技术在分子诊断中的应用n n感染性疾病中病原微生物核酸的检测n n单基因遗传性疾病的基因诊断n n多基因病相关基因的检测n n肿瘤相关基因的检测n n移植配型和法医学上的应用74感谢你的观看2109年5月18日PCR技术在分子诊断中的应用感染性疾病中病原微生物核酸的检测