流式细胞技术基本原理及应用课件

流式细胞技术基本原理及应用流式细胞技术基本原理及应用1 提提 纲纲Beckman Coulter 公司介绍公司介绍流式细胞技术基本原理流式细胞技术基本原理FC500全自动分析型流式细胞仪介绍全自动分析型流式细胞仪介绍 Gallios 十色分析型流式细胞仪十色分析型流式细胞仪流式细胞技术科研应用流式细胞技术科研应用 提 纲Beckman Coulter 公司介绍Dr.Beckman于于1935年创立年创立Beckman公司公司Coulter兄弟于兄弟于1958年创立年创立Coulter公司公司1997年两大公司合并为年两大公司合并为Beckman Coulter一直致力于为生命科学研究提供全套的解决方案，产品涵盖临床诊断和生一直致力于为生命科学研究提供全套的解决方案，产品涵盖临床诊断和生物医学的多个领域，包括临床生化、血凝物医学的多个领域，包括临床生化、血凝/血球、实验室自动化、离心机、血球、实验室自动化、离心机、流式细胞产品、基因组学、蛋白质组学、颗粒特性分析等流式细胞产品、基因组学、蛋白质组学、颗粒特性分析等20多万台仪器设备在全球多万台仪器设备在全球130多个国家地区的医院和科研院所高效运转多个国家地区的医院和科研院所高效运转年销售额超年销售额超40亿美金，被财富杂志评为亿美金，被财富杂志评为“最值得钦佩的公司最值得钦佩的公司”之一之一名列全球福布斯名列全球福布斯500强强Beckman Coulter 公司介绍公司介绍Dr.Beckman于1935年创立Beckman公司BeBeckman Coulter：世界上最主要的高端流式细胞仪技术制造商：世界上最主要的高端流式细胞仪技术制造商Beckman Coulter：世界上最主要的高端流式细胞仪贝克曼库尔特细胞组学产品线贝克曼库尔特细胞组学产品线Z1/Z2细胞分析计数仪细胞分析计数仪Vicell 全自动全自动细胞活力分析系统细胞活力分析系统4 色数字化分析型流式色数字化分析型流式 Epcis XL5色数字化分析型流式色数字化分析型流式 FC500EPICS ALTRA分选分选Gallios科研型科研型MoFlo XDP高端分选高端分选MoFlo Astrios高端分选高端分选Quanta SC（2007）临床型临床型NaviosCyAn ADP（科研型）（科研型）1990200520092009年年12月份上市月份上市贝克曼库尔特细胞组学产品线Z1/Z2细胞分析计数仪Vicel流式细胞技术基本原理流式细胞技术基本原理流式细胞技术基本原理What is Flow Cytometry？流式细胞技术流式细胞技术(Flow Cytometry,FCM)是利用流式细胞仪对处于是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术。分选的技术。它结合了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化它结合了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。学和免疫化学技术。What is Flow Cytometry？流式细胞技术(FCM的技术特点的技术特点测量速度快测量速度快以单一细胞为分析基础以单一细胞为分析基础多参数测量多参数测量统计学意义统计学意义高分辨率高分辨率(CV2%)、高灵敏度、高灵敏度(荧光检测灵敏度荧光检测灵敏度100MESF（Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome），），前向角散射光检测灵敏度前向角散射光检测灵敏度(0.2 0.5m)分选纯度可达分选纯度可达99%以上以上FCM的技术特点测量速度快大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静细胞的相对大小（细胞的相对大小（FSC-Forward Scatter）细胞的相对颗粒度和内部复杂度（细胞的相对颗粒度和内部复杂度（SSC-Side Scatter）细胞的相对荧光强度细胞的相对荧光强度What Can a Flow Cytometer Tell Us About a Cell?细胞的相对大小（FSC-Forward Scatter）WhFC500流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNARNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特异核的特异性抗原性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体FC500流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞功能流式细胞仪是细胞组学的定量工具流式细胞仪是细胞组学的定量工具可以做以下定量：可以做以下定量：细胞相对定量（）细胞相对定量（）细胞绝对定量（细胞细胞绝对定量（细胞/l l）细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞）细胞）可溶性蛋白绝对定量（可溶性蛋白绝对定量（g/mlg/ml）流式细胞仪是细胞组学的定量工具可以做以下定量：n荣获国际工业设计大奖和质量最高奖，得到国际公认荣获国际工业设计大奖和质量最高奖，得到国际公认n获得获得FDA和中国和中国SDA认证，安全性和结果可靠性得到肯定认证，安全性和结果可靠性得到肯定全自动全自动5 5色流式细胞仪色流式细胞仪Cytomics FC500 Flow CytometerCytomics FC500 Flow Cytometer先进的光路设计先进的光路设计高分辨高分辨20Bit数字化电子系统数字化电子系统丰富灵活的进样系统丰富灵活的进样系统基于基于Windows界面的高度人性化软件界面的高度人性化软件荣获国际工业设计大奖和质量最高奖，得到国际公认全自动5色流式FC500 Flow cytometry的基本结构的基本结构流路：流路：流动室流动室 鞘液鞘液 sheath 样本流样本流 sample 光路：光路：光源光源 光学收集系统光学收集系统电路电路：光电倍增管光电倍增管(PMT)、光电二极、光电二极管、管、放大器（线性、对数）放大器（线性、对数）A/D 转换（光信号转换为电信转换（光信号转换为电信号之后的处理分析号之后的处理分析 道数和电信道数和电信号的脉冲转换号的脉冲转换 ）统计：计算机统计：计算机 软件软件FC500 Flow cytometry的基本结构流路：流流 路路流动室流动室侧向及荧光信号侧向及荧光信号前向散射光信号前向散射光信号鞘液鞘液激光激光 样品管、鞘液管和流动室等样品管、鞘液管和流动室等由于鞘液的作用，待测细胞被限制在液流的轴线上流体动力学聚焦流 路流动室侧向及荧光信号前向散射光信号鞘液激光 样品FC500的光源和光路的光源和光路先进的单激光激发先进的单激光激发5 5色系统色系统单激光 就能激发5色荧光20mW 488 nm Blue air-cooled argon(氩离子激光)单激光同时激发5色荧光，确保信号来源于同一个细胞，结果准确可靠其它公司同档机器单激光只能激发4色，第5色需要安装第二根激光激发。由于有两个检测点，在鞘液压力变化、样品浓度、样品大小不均、转换采样速度时不能确保信号来源于同一个细胞而是两个细胞，信号收集发生错误FC500的光源和光路先进的单激光激发5色系统单激光 就能激 双激光排列方式：共线性排列（只有一个检测点）双激光排列方式：共线性排列（只有一个检测点）FC500的光源和光路的光源和光路488nm激光633nm激光双激光共线性：信号来源于一个检测点 双激光排列方式：共线性排列（只有一个检测点）FC500的光散射光测量原理散射光测量原理Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light SourceFSC SensorLaserSSC Sensor散射光测量原理Right Angle Light Detec散射光的性质散射光的性质 波长与入射光一致，为细胞固有的物理及生理特性，可依此对未染色的细胞进行分析 -前向散射光(FSC):与细胞大小有关-侧向散射光(SSC):与细胞内部的结构及颗粒性有关。SCFS外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）（红细胞溶解后）散射光的性质 波长与入射光一致，为细胞固有的物理及生理特性，FC500 FC500 提供两种检测角度的前向角散射光，更好通过大小区分提供两种检测角度的前向角散射光，更好通过大小区分不同细胞不同细胞FC500 提供两种检测角度的前向角散射光，更好通过大小区分荧光信号检测原理荧光信号检测原理520nmFSC SensorLaserFluorescence Sensor PMT(FL)荧光信号检测原理520nmFSC SensorLaserFl ATOM荧光素及荧光发生机理简介荧光素及荧光发生机理简介 ATOM荧光素及荧光发生机理简介FITC荧光素的激发和发射光谱荧光素的激发和发射光谱Ex 488nm Em 520nm异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）每种荧光染料均有特定的激发波长每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发并激发后会有发射波长射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测检测)这些光学这些光学信号信号FITC荧光素的激发和发射光谱Ex 488nm FC500流式常用荧光染料流式常用荧光染料 violet blue greenyellow orange red infra-FITC520PE575ECD 615PC5665LASER 488PI620400-450 l450-500 l500-570 l 570-590 l750 lPC7770荧光素的使用：荧光素的使用：选择正确的激光器选择正确的激光器 确定正确的滤光片确定正确的滤光片 确定所需荧光探测器（确定所需荧光探测器（PMTPMT）FC500流式常用荧光染料 violet LONG(700nm)(550LP)(550SP)SHORT(500nm)Dichroic FiltersTransmitted 550 nmDiflected 90550 nm550 nmLONG(700nm)(500LP)(500SP)SHORT(500nm)Pass Through Filters(500/50)Transmitted 500 nm475-525 nm Wavelengths Blocked500 nm500 nm525 nmShort PassLong PassBand Pass光学系统：滤光片（光学系统：滤光片（Filter）荧光激发波长根据所选的荧光素而异，可通过一组不同的光学滤片传递荧光激发波长根据所选的荧光素而异，可通过一组不同的光学滤片传递到各个到各个PMT(PMT(光电倍增管中光电倍增管中)LONG(700nm)(550LP)(550SP)SHORFC500 FC500 的光路的光路固定光路，互换式滤片固定光路，互换式滤片矩形反射光路，光路短，能量损失小，易于低强度荧光检测，矩形反射光路，光路短，能量损失小，易于低强度荧光检测，并且组合滤片能保证荧光检测的特异性并且组合滤片能保证荧光检测的特异性完全光学线路免校正完全光学线路免校正客户可自由更换的滤片组合，且无须校正光路，可方便新荧光客户可自由更换的滤片组合，且无须校正光路，可方便新荧光染料的使用，扩展机器的功能；染料的使用，扩展机器的功能；FC500 的光路固定光路，互换式滤片矩形反射光路，光路流式细胞仪的电路流式细胞仪的电路进行信号检测和分析进行信号检测和分析荧光信号由光电接收器（荧光信号由光电接收器（PMT）接收，转变为电信号，）接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度可分析电压脉冲的高度、面积和宽度电脉冲信号经电脉冲信号经A/D转换成数字信号转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、数字信号传送到计算机，进行储存、作图、作图、统计分析统计分析流式细胞仪的电路进行信号检测和分析光电管和检测系统：光电管和检测系统：PMT光电管和检测系统：PMT光电管和检测系统：放大器光电管和检测系统：放大器基本原则基本原则 -信号强弱差信号强弱差101010倍倍oror需分析需分析弱荧光弱荧光:使用使用对数对数放大器放大器(如如荧光荧光)光电管和检测系统：放大器基本原则FC500 FC500 采用采用2020比特的信息量数字化信号采集分析数据比特的信息量数字化信号采集分析数据数据信息量和检测精度的对应关系数据信息量和检测精度的对应关系3 Shapiro,H.Practical Flow Cytometry,4th Ed.Page 206.*LSB=least significant bit,voltage difference between channel n and channel n+1.The table shows the attributes of analog to digital converters3.Based on the number of bits,the input signal(or voltage)must increase by this amount in order to affect a change in the channel displayed.FC500FC500 采用20比特的信息量数字化信号采集分析数据数据Sample data On 20bit FC50010MB/sec光纤传输信号，反应迅速光纤传输信号，反应迅速荧光分辨率的解析度更高，细胞分群更好荧光分辨率的解析度更高，细胞分群更好在荧光表达低通道处（在荧光表达低通道处（100-101阴性细胞位置）不阴性细胞位置）不会出现低分辨率数据常见的信号不饱和现象会出现低分辨率数据常见的信号不饱和现象220=1,048,576 channels218=262,144 channelsSample data On other 18bit AnalyzerFC500 优秀的荧光检测灵敏度和分辨率优秀的荧光检测灵敏度和分辨率Sample data On 20bit FC50010MBC Analyzer NONE smooth histogramCD19 FITC NO WASHFC500 NONE smooth histogramCD19 FITC NO WASH同一份样本检测，同一份样本检测，FC500FC500的信噪比更好的信噪比更好C Analyzer NONE smooth histogFC500 Flow cytometr的基本结构的基本结构流路：流路：流动室流动室 鞘液鞘液 sheath 样本流样本流 sample 光路：光路：光源光源 光学收集系统光学收集系统电路电路：光电倍增管光电倍增管(PMT)、光电二极、光电二极管、管、放大器（线性、对数）放大器（线性、对数）A/D 转换（光信号转换为电信转换（光信号转换为电信号之后的处理分析号之后的处理分析 道数和电信道数和电信号的脉冲转换号的脉冲转换 ）统计：计算机统计：计算机 软件软件FC500 Flow cytometr的基本结构流路：FC500 高度自动化人性化的软件系统高度自动化人性化的软件系统 Windows 2000系统平台 多用户操作 可以将每天的应用预先设置和安排 FCS 3.0 文件格式，可以直接打开 多种结果输出形式，完全与OFFICE兼容 多种图形叠加方式 开放式软件，可以在任何电脑上安装使用FC500 高度自动化人性化的软件系统QuicksetQuickset直观的电压调节直观的电压调节Quickset直观的电压调节QuickCompQuickComp直观的补偿调节直观的补偿调节补偿前补偿前补偿后补偿后QuickComp直观的补偿调节补偿前补偿后FC500 丰富的上样系统丰富的上样系统高通量标准化自动化高通量标准化自动化32 支试管自动上样盘（MCL)独立获取样本简单，自动检测和报告，有利于实验的标准化，减少人为误差每支试管检测前单独震动混匀，有利于均匀获取细胞，结果更准确可靠FC500 丰富的上样系统高通量标准化自动化32 支试管FC500 FC500 配套自动化标本处理系统配套自动化标本处理系统全自动标本处理和溶血系统，灵活搭配，减少人为误差，节省人力和试剂-Q-PREP-TQ-PREP-PREPLUS II标本处理系统上样装置与FC 500 完全兼容FC500 配套自动化标本处理系统全自动标本处理和溶血系统，FC500 FC500 全自动无缝连接的流水线系统全自动无缝连接的流水线系统无人值守标准化操作杜绝污染速度快模式一模式一模式二模式二FC500 全自动无缝连接的流水线系统无人值守模式一模式二独家的可升级多平台自动上样系统独家的可升级多平台自动上样系统FC500 MPL 24 孔96 标准孔和深孔反应板40 支试管(12x75mm)可以固定体积上样检测u可以减少高通量工作需要的烦杂的取样过程u将您的注意力从操作中解放出来，而集中于思路的 创新创新FC500是一款单平台既能96孔板又能40管常用试管上样的流式细胞仪独家的可升级多平台自动上样系统FC500 MPL 可以减少高FC500 FC500 智能化的体现智能化的体现FC 500 FC 500 面板面板LEDLED显示屏能随时自动显示显示屏能随时自动显示 各色荧光的强弱，各色荧光的强弱，激光开启状态，激光开启状态，上样速度，上样速度，鞘液、废液水平鞘液、废液水平FC500 智能化的体现FC 500 面板LED显示屏能随时FC500 FC500 特点特点 1 1 根激光根激光5 5色荧光分析，获取高可信度多色数据色荧光分析，获取高可信度多色数据 2 2 种角度前向散射光检测功能，更准确定位目的细胞种角度前向散射光检测功能，更准确定位目的细胞,20Bit,20Bit高分辨电子高分辨电子系统，更精确解读荧光信号系统，更精确解读荧光信号 3 3 种图形显示及更强大的分析工具：各种种图形显示及更强大的分析工具：各种2 2维平面图，三维平面图，三 维立体图，维立体图，独特的独特的PRISM PRISM 浓缩柱形图，无限制的直方浓缩柱形图，无限制的直方 图叠加功能图叠加功能 4 4 种进样方式：单一试管，种进样方式：单一试管，3232管自动上样，管自动上样，24/96 24/96 微孔板，微孔板，4040管自动上样，具有目前最丰富的进样模式管自动上样，具有目前最丰富的进样模式 5 5X5 ADC5 5X5 ADC正反全矩阵高精度补偿及离线补偿系统，自正反全矩阵高精度补偿及离线补偿系统，自 动化的电压补偿调节功能，强大的批量处理分析功能动化的电压补偿调节功能，强大的批量处理分析功能FC500 特点 1 根激光5色荧光分析，获取高可信度多色数检测的一般步骤检测的一般步骤1.1.设置检测方案（设置检测方案（PROTOCOL)PROTOCOL)2.2.染色标本（同型对照，补偿管，待测样本）染色标本（同型对照，补偿管，待测样本）3.3.同型对照管调电压同型对照管调电压4.4.电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿管调补偿5.5.电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果果检测的一般步骤设置检测方案（PROTOCOL)电压调节利用同型对照：设置背景电压调节利用同型对照：设置背景 电压 volts 增益 Gain设定阴性和阳性信号强度的设定阴性和阳性信号强度的临界点临界点电压调节利用同型对照：设置背景设定阴性和阳性信号强度的临界荧光补偿荧光补偿FITCPE受激光照射后受激光照射后FITC和和PE分子发射光谱相互干扰分子发射光谱相互干扰荧光补偿FITCPE受激光照射后FITC和PE分子发射光谱相荧光补偿的调节荧光补偿的调节FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2荧光补偿的调节FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-QuickCompQuickComp直观的补偿调节直观的补偿调节补偿前补偿前补偿后补偿后QuickComp直观的补偿调节补偿前补偿后补偿调节利用单标样本，来消除荧光交叉原则：单管单色标记交叉调节确认电压单标记管自动计算CROSSOVER验证管补偿调节利用单标样本，来消除荧光交叉原则：确认电压单标记管补偿调节补偿调节-最精确的全矩阵软件最精确的全矩阵软件 利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道之间都可以进行补偿）测通道之间都可以进行补偿）补偿调节-最精确的全矩阵软件数据分析数据分析Dot Plot（双参数点图）Histogram（单参数直方图）Region（门）Statistics（统计结果）参数数据分析Dot Plot（双参数点图）参数51Gallios最新产品最新产品多种专利技术和优化设计多种专利技术和优化设计全球用户的一致认可，全球销售全球用户的一致认可，全球销售逾千台逾千台真正支持当前流式发展趋势真正支持当前流式发展趋势多参数（几十个）多参数（几十个）小颗粒检测小颗粒检测弱荧光表达弱荧光表达稀有细胞稀有细胞自动化高通量上样自动化高通量上样全自动十色全自动十色Gallios流式细胞分析系统流式细胞分析系统51Gallios最新产品全自动十色Gallios流式细胞分激光器的独特设计激光器的独特设计创新的卡槽式设计创新的卡槽式设计 微马达自动固定激光，真正固定光路，无需调整维护，即开即用微马达自动固定激光，真正固定光路，无需调整维护，即开即用 灵活开放的平台，用户可自行升级更换新波长的激光，如灵活开放的平台，用户可自行升级更换新波长的激光，如561nm、375nm，保证未来的应用不受限，保证未来的应用不受限每根激光有单独开关，延长激光使用寿命每根激光有单独开关，延长激光使用寿命52激光器的独特设计创新的卡槽式设计 52多色的灵活配置多色的灵活配置405nm638nm488nm 2 Lasers 6 colors(5+1)2 Lasers 8 colors(5+3)3 Lasers 10 colors(5+3+2)多色的灵活配置405nm638nm488nm 2 Laser多色检测优势多色检测优势观察混合样本中不同细胞亚群之间的数量变化和功能联系观察混合样本中不同细胞亚群之间的数量变化和功能联系减少批次操作的变异误差减少批次操作的变异误差准确识别细胞亚群以及评价细胞功能准确识别细胞亚群以及评价细胞功能提高检测效率提高检测效率节约珍贵稀有样本节约珍贵稀有样本增加灵敏度和分辨率增加灵敏度和分辨率多色检测优势观察混合样本中不同细胞亚群之间的数量变化和功能联光胶耦合石英杯提高光胶耦合石英杯提高光收集效率光收集效率77%利用光纤高效传输利用光纤高效传输荧光到荧光到PMT 18o 全反射收集光路减少光损失全反射收集光路减少光损失The Boulevard高效的光收集系统高效的光收集系统 保证多色分析的荧光灵敏度保证多色分析的荧光灵敏度 紧凑式设计缩短光信号传输距离紧凑式设计缩短光信号传输距离光损失最小的反射角度光损失最小的反射角度用户自由插拔式光学滤片，更换后无需调节光路，保证新染料和应用不受限用户自由插拔式光学滤片，更换后无需调节光路，保证新染料和应用不受限光胶耦合石英杯提高光收集效率77%利用光纤高效传输荧光到PM独家提供仪器内部温控独家提供仪器内部温控确保仪器始终处于工程师安装调试时的最佳状态确保仪器始终处于工程师安装调试时的最佳状态保证实验准确性和重复性保证实验准确性和重复性平均荧光强度变化在平均荧光强度变化在2%2%以内以内Gallios Gallios 平均荧光强度变化超过平均荧光强度变化超过25%25%没有温控的仪器没有温控的仪器独家提供仪器内部温控确保仪器始终处于工程师安装调试时的最佳状FSC W2SSCFSC W2W2 可应用于血小板微颗粒，内皮微颗粒，红细胞微泡，以及细菌的检测可应用于血小板微颗粒，内皮微颗粒，红细胞微泡，以及细菌的检测独有的独有的多角度前向角散射光多角度前向角散射光检测功能检测功能FSC对于流式检测至关重要，对于流式检测至关重要，影响圈门和统计影响圈门和统计针对不同类型样本，独家提针对不同类型样本，独家提供三种前向角散射光检测角供三种前向角散射光检测角度度1-8低角度：适用于分辨低角度：适用于分辨8-40um的颗粒的颗粒1-19宽角度：适用于分辨宽角度：适用于分辨0.5-10um的颗粒的颗粒W2 增宽型大角度：相差增宽型大角度：相差0.1um的细胞颗粒以及背景的细胞颗粒以及背景噪音区分开噪音区分开 FSC W2SSCFSC W2W2 可应用于血小板微颗粒，内微颗粒（微颗粒（microparticles，MPs）近年研究热点之一近年研究热点之一微颗粒是细胞激活或凋亡时从质膜脱落的一些膜性小囊泡，有促凝、微颗粒是细胞激活或凋亡时从质膜脱落的一些膜性小囊泡，有促凝、促炎症和调节内皮功能的作用促炎症和调节内皮功能的作用研究表明，微颗粒与血管生成的关系密切，在高血压、糖尿病、缺血研究表明，微颗粒与血管生成的关系密切，在高血压、糖尿病、缺血性疾病以及肿瘤的发展中发挥了重要作用性疾病以及肿瘤的发展中发挥了重要作用微颗粒水平增加见于多种疾病，如血栓症（血小板微颗粒）、充血性微颗粒水平增加见于多种疾病，如血栓症（血小板微颗粒）、充血性心力衰竭（内皮微颗粒）、妇女先兆子痫（合胞体滋养层细胞微颗粒）心力衰竭（内皮微颗粒）、妇女先兆子痫（合胞体滋养层细胞微颗粒）微颗粒（microparticles，MPs）近年研究热点之微颗粒（微颗粒（microparticles，MPs）微颗粒（microparticles，MPs）真实有效的分析速度和信号处理能力真实有效的分析速度和信号处理能力40MHz 数字化采样频率数字化采样频率 最大上样速度最大上样速度25000个细胞个细胞/秒（秒（90%产率），产率），大大节省检测时间和宝贵样本大大节省检测时间和宝贵样本可检测高度、面积、宽度、时间、比率参数可检测高度、面积、宽度、时间、比率参数GalliosGalliosOther CytometerOther CytometerData Rate%Yield真实有效的分析速度和信号处理能力40MHz 数字化采样频率 Sample data On 20bit Gallios10MB/sec光纤传输信号，反应迅速光纤传输信号，反应迅速荧光分辨率的解析度更高：荧光分辨率的解析度更高：20比特比特细胞分群更好，细胞分群更好，检测、圈门和统计更准确，尤其适于分析分检测、圈门和统计更准确，尤其适于分析分选含量稀有、微弱荧光表达差异或荧光连续表达的细胞群体选含量稀有、微弱荧光表达差异或荧光连续表达的细胞群体220=1,048,576 channels218=262,144 channels数据分辨率和信号精度最高数据分辨率和信号精度最高Sample data On other 18bit AnalyzerSample data On 20bit Gallios10 Queen Mary,University of London 2005 R：阳性细胞数：阳性细胞数N：需要获取的细胞：需要获取的细胞总数总数P：阳性率：阳性率CV：变异系数：变异系数单个样本处理和储存信息量：单个样本处理和储存信息量：2400万细胞万细胞科学试验要求良好的准确性和重复性，统计上一般要求平行试验的数据结科学试验要求良好的准确性和重复性，统计上一般要求平行试验的数据结果的变异系数果的变异系数CV5，流式细胞仪单次上样处理和保存数据信息量要求，流式细胞仪单次上样处理和保存数据信息量要求更高，以便精确圈定分析分选区域更高，以便精确圈定分析分选区域尤其适合低含量稀有细胞群体（树突细胞、抗原特异性尤其适合低含量稀有细胞群体（树突细胞、抗原特异性T细胞、细胞、Treg、各、各种干细胞、各种实体组织来源细胞等），种干细胞、各种实体组织来源细胞等），轻松实现万分之一以下含量的细轻松实现万分之一以下含量的细胞检测胞检测不同含量目的细胞需要获取的细胞总数不同含量目的细胞需要获取的细胞总数 Queen Mary,University of Lo自动或手动模式，无需机械式安装自动或手动模式，无需机械式安装调试调试单管进样或单管进样或32管连续进样（管连续进样（88管管/小小时），真正实现时），真正实现Walkaway 每支试管检测前单管震动混匀功能，每支试管检测前单管震动混匀功能，避免整盘振荡多次混匀对细胞形态、避免整盘振荡多次混匀对细胞形态、完整性和活性的影响完整性和活性的影响全方位的条码扫描识别功能（转盘全方位的条码扫描识别功能（转盘号、管号、单管条形码），方便高号、管号、单管条形码），方便高通量大样本信息录入通量大样本信息录入可随时暂停可随时暂停/旋转以方便添加刺激旋转以方便添加刺激剂等剂等样本间自动清洗，交叉污染样本间自动清洗，交叉污染0.1%最小死体积最小死体积20ul减少操作者和样本接触减少操作者和样本接触(生物安全生物安全)轮盘式高通量标准化自动化上样系统轮盘式高通量标准化自动化上样系统自动或手动模式，无需机械式安装调试轮盘式高通量标准化自动化上长效稳定供液设计支持长时间样本分析长效稳定供液设计支持长时间样本分析 液流车系统液流车系统外接大容量鞘液桶不间断补液，外接大容量鞘液桶不间断补液，保证内置鞘液盒液面恒定，消除保证内置鞘液盒液面恒定，消除液面下降引起系统压力变化对检液面下降引起系统压力变化对检测的影响测的影响外接大容量废液桶外接大容量废液桶内置清洗液桶内置清洗液桶长效稳定供液设计支持长时间样本分析 液流车系统定时自动开关机、清洗维护及远程诊断功能定时自动开关机、清洗维护及远程诊断功能定时自动开关机、清洗维护及远程诊断功能简单直观的应用方式简单直观的应用方式实时补偿实时补偿/脱机补偿脱机补偿/自动补偿自动补偿简单直观的应用方式实时补偿/脱机补偿/自动补偿PRISM 浓缩柱形图真正支持多色分析浓缩柱形图真正支持多色分析 一张图上显示多达一张图上显示多达1024个表型组合结果（十色分析，个表型组合结果（十色分析，210分析组合）分析组合）将实验所分析的所有细胞数据结果简单地浓缩在一张直方图上将实验所分析的所有细胞数据结果简单地浓缩在一张直方图上 能直接读出各种阴性或阳性组合的结果能直接读出各种阴性或阳性组合的结果 清晰直观且便于数据的保存清晰直观且便于数据的保存PRISM 浓缩柱形图真正支持多色分析 一张图上显示多达10支持最全面的生命科学研究内容支持最全面的生命科学研究内容细胞生理功能研究（死活鉴定、细胞内细胞生理功能研究（死活鉴定、细胞内pH值、细胞内钙流、膜电位、酶活性）值、细胞内钙流、膜电位、酶活性）免疫功能研究（包括淋巴细胞亚群分析、细胞绝对计数、细胞活化、细胞因子、免疫功能研究（包括淋巴细胞亚群分析、细胞绝对计数、细胞活化、细胞因子、调节性调节性T细胞、树突细胞、抗原特异性细胞、树突细胞、抗原特异性T细胞、细胞、Th17细胞等）细胞等）造血干细胞计数造血干细胞计数血小板疾病及活化血小板检测血小板疾病及活化血小板检测HLA-B27强制性脊柱炎筛查强制性脊柱炎筛查白血病及淋巴瘤免疫分型、残留白血病检测白血病及淋巴瘤免疫分型、残留白血病检测器官移植的配型及免疫状态监控器官移植的配型及免疫状态监控AIDS诊断及治疗监控诊断及治疗监控肿瘤相关研究（肿瘤相关基因表达、抗肿瘤药物作用机制及多药耐药、放化疗以肿瘤相关研究（肿瘤相关基因表达、抗肿瘤药物作用机制及多药耐药、放化疗以及生物治疗疗效的研究、循环中肿瘤细胞等）及生物治疗疗效的研究、循环中肿瘤细胞等）药物筛选，抗体研发，疫苗评估药物筛选，抗体研发，疫苗评估干细胞研究（干细胞的分离、鉴定、功能分析等）干细胞研究（干细胞的分离、鉴定、功能分析等）细胞周期和细胞周期和DNA倍体分析、倍体分析、DNA含量测定、细胞周期蛋白含量测定、细胞周期蛋白细胞凋亡及凋亡相关蛋白细胞凋亡及凋亡相关蛋白磷酸化蛋白的检测及信号传导通路的研究磷酸化蛋白的检测及信号传导通路的研究细胞治疗细胞治疗支持最全面的生命科学研究内容细胞生理功能研究（死活鉴定、细胞流式细胞仪应用举例流式细胞仪应用举例流式细胞仪应用举例一、稳定细胞株的筛选一、稳定细胞株的筛选GFP转染后转染细胞（蓝色）与空载体转染细胞（红色）的对比，转染效率731、靶基因转染至目的细胞、靶基因转染至目的细胞2、检测报告基因、检测报告基因-荧光蛋白荧光蛋白（GFP,YFP,Dsred）转染效率）转染效率3、阳性细胞的无菌分选、阳性细胞的无菌分选一、稳定细胞株的筛选GFP转染后转染细胞（蓝色）与1、靶基因二、细胞周期二、细胞周期/DNA含量的分析含量的分析常用染料：常用染料：PI 7-AAD Hochest33342G0/G1SG2/M肿瘤细胞判断标准：DNA指数 大于1.1或小于0.9S期比例大于15%S+G2期比例大于20%对抗肿瘤药物机制及疗效评价二、细胞周期/DNA含量的分析常用染料：G0/G1SG2/M分析单细胞群体，去除粘连细胞分析单细胞群体，去除粘连细胞FSSSAWAHu利用脉冲高度，面积，宽度三参数去除粘连细胞利用脉冲高度，面积，宽度三参数去除粘连细胞分析单细胞群体，去除粘连细胞FSSSAWAH利用脉冲高度，面细胞周期分析细胞周期分析/DNA含量分析含量分析第三方软件分析周期 Multicycle，ModFit等等决定决定cell cyclescell cycles数数排除细胞碎片（排除细胞碎片（debrisdebris）执行分析执行分析分析数据分析数据信赖度分析信赖度分析（Confidence analysisConfidence analysis）可信区间可信区间六种信赖度模式总结六种信赖度模式总结细胞周期分析/DNA含量分析第三方软件分析周期 MultDNA与蛋白同时检测与蛋白同时检测Anti-Cyclin A2-FITC7-AAD对照对照ThapsigarginPaclitaxelG0 39%M 1.5%G0 5.3%M 62%G0 28%M 1.2%DNA与蛋白同时检测Anti-Cyclin A2-FITC7Cell proliferationCFSE在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。Brdu是5-溴脱氧尿嘧啶核苷代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，同时结合PI/7AAD双重染色.Cell proliferation凋亡启动凋亡启动细胞内细胞内Ca2+动动员员 Caspase激活激活脱水致细胞皱缩脱水致细胞皱缩核染色质凝缩核染色质凝缩 线粒体膜电位线粒体膜电位丧失丧失 细胞膜细胞膜PS外外翻翻 核碎片形成核碎片形成DNA被切割成低分子被切割成低分子量片段量片段细胞内酸化细胞内酸化凋亡小体形成凋亡小体形成三、细胞凋亡实验三、细胞凋亡实验凋亡启动细胞内Ca2+动员 Caspase激活脱水致细胞Caspase-3 activation（早早期凋亡检测）（早早期凋亡检测）Jurkat T-cells treated with VP16Caspase-3 activation（早早期凋亡检测）ANNEXIN V/PI凋亡分析凋亡分析DNA链断裂膜PS外翻Annexin V FITCPIANNEXIN V/PI凋亡分析DNA链断裂膜PS外翻AnnJC-1对线粒体膜电位的检测对线粒体膜电位的检测ControlCCCP treatedJC-1 GreenJC-1 OrangeJC-1对线粒体膜电位的检测ControlCCCP treaDNA含量含量-凋亡凋亡 亚二倍体亚二倍体 Jurkat T-cells treated with DexamethasoneDNA含量-凋亡 亚二倍体 Jurkat T-cells四、蛋白质相互作用四、蛋白质相互作用FRET（Fluorescence resonance energy transfer）四、蛋白质相互作用FRET（Fluorescence res五、芯片技术五、芯片技术-高通量同时检测高通量同时检测1010种细胞因子种细胞因子*Human Th1/Th2 Cytokine I KitFL2(Reporter Parameter)FL4(Differentiator Parameter)五、芯片技术-高通量同时检测10种细胞因子*Human Th六、与心血管疾病相关六、与心血管疾病相关 血小板测定血小板测定流式细胞仪是血小板计数的最准确平台，国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际实验血液学协会(ISLH)在2001就向全世界推荐灵敏度高(1-400 x109/L)，重复性好，室内/室外变异系数均很小尤其应用于血小板预输注病人的检测六、与心血管疾病相关 血小板测定流式细胞仪是血小板计数的最准出凝血疾病检测出凝血疾病检测正常血小板 CD41,CD42,CD42b,CD6195%CD62P,CD633%凝血酶活化血小板(糖尿病伴微血管病变、冠心病、高血压病、高脂蛋白血症、脑血栓形成短暂性脑缺血发作、脑动脉硬化）CD42a,CD42b CD62p,CD63 血小板自身抗体引起的血小板减少血小板黏附检测（粒细胞，单核细胞)出凝血疾病检测正常血小板循环血中活化血小板（CD62P、CD63）：糖尿病伴微血管病变、冠心病、高血压病、高脂血症、脑血栓形成、短暂性脑缺血发作、脑动脉硬化患者活化血小板百分率和绝对值显著高于正常人。而糖尿病无微血管病变、周围血管病变以及深静脉血栓形成患者活化血小板水平与正常人无显著差异。PTCA后24小时发展成急性血管闭塞或高度再狭窄的患者活化血小板CD62p、CD63增多，可以用于预测PTCA后急性缺血再发作的危险性循环血中活化血小板（CD62P、CD63）：