酶蛋白的稳定性和稳定化课件

酶蛋白的稳定性和稳定化酶蛋白的稳定性和稳定化酶蛋白的稳定性和稳定化1 1第一节第一节 前前 言言o 酶蛋白的稳定性酶蛋白的稳定性 是指酶蛋白抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的是指酶蛋白抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力。酶特定的空间结构决定其生物活性，因此稳定化的能力。酶特定的空间结构决定其生物活性，因此稳定化的结果就是保持其空间结构。结果就是保持其空间结构。o 研究酶蛋白的稳定性不仅对齐基础理论的研究具有重研究酶蛋白的稳定性不仅对齐基础理论的研究具有重要意义，对提高其操作和贮存稳定性，扩大酶的使用范围要意义，对提高其操作和贮存稳定性，扩大酶的使用范围具有重大的实用价值。具有重大的实用价值。第一节前言酶蛋白的稳定性2酶蛋白的稳定性和稳定化课件3酶蛋白的稳定性和稳定化课件4酶蛋白的稳定性和稳定化课件5酶蛋白的稳定性和稳定化课件6酶蛋白的稳定性和稳定化课件7酶蛋白的稳定性和稳定化课件8Disulfide bondDisulfidebond95.5.敏感氨基酸含量低敏感氨基酸含量低 酶蛋白的变性等反应容易发生在敏感的氨基酶蛋白的变性等反应容易发生在敏感的氨基酸残基上，如活性部位的氨基酸被氧化是酶蛋白酸残基上，如活性部位的氨基酸被氧化是酶蛋白失活最常见的现象。在稳定的嗜热酶中不稳定氨失活最常见的现象。在稳定的嗜热酶中不稳定氨基酸的数目明显比相应的嗜温酶蛋白中低。基酸的数目明显比相应的嗜温酶蛋白中低。5.敏感氨基酸含量低106.6.氨基酸残基的坚实装配氨基酸残基的坚实装配 酶蛋白的分子结构中有孔隙，通常这些孔隙酶蛋白的分子结构中有孔隙，通常这些孔隙被水分子所充满。极性的水分子通过布朗运动与被水分子所充满。极性的水分子通过布朗运动与蛋白质的疏水键接触会导致蛋白质不稳定。若酶蛋白质的疏水键接触会导致蛋白质不稳定。若酶蛋白的结构坚实，则水分子从孔隙中被除去，蛋蛋白的结构坚实，则水分子从孔隙中被除去，蛋白的稳定性也相应增加。白的稳定性也相应增加。6.氨基酸残基的坚实装配11 酶蛋白中非极性侧链约占其总体积的一半，从热力学上酶蛋白中非极性侧链约占其总体积的一半，从热力学上来说它们与水的接触是不利的，因为围绕非极性基团的水分子，来说它们与水的接触是不利的，因为围绕非极性基团的水分子，相对溶液中其他地方的水分子来说更有序，形成一个封闭结构，相对溶液中其他地方的水分子来说更有序，形成一个封闭结构，或称为或称为“笼形笼形”结构。水分子彼此之间形成氢键，而且只是很脆结构。水分子彼此之间形成氢键，而且只是很脆弱地结合在封闭结构内的基团上。当发生疏水相互作用时，水弱地结合在封闭结构内的基团上。当发生疏水相互作用时，水分子排列有序形成的分子排列有序形成的“笼形笼形”结构被破坏，这部分水进入自由水结构被破坏，这部分水进入自由水中，使水分子熵增加。中，使水分子熵增加。7.7.疏水相互作用疏水相互作用酶蛋白中非极性侧链约占其总体积的一半，从12 但最近但最近X射线结晶学方法证实，蛋白质非极性表面射线结晶学方法证实，蛋白质非极性表面上水分子的结构重排，能引起系统的熵值降低和蛋白上水分子的结构重排，能引起系统的熵值降低和蛋白质折叠状态的改变：质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总是倾向于蛋白质的非极性部分总是倾向于使其不与水接触，并尽可能的隐藏在蛋白质球体内部，使其不与水接触，并尽可能的隐藏在蛋白质球体内部，从而增加蛋白质的稳定性。从而增加蛋白质的稳定性。酶蛋白的稳定性和稳定化课件13二、测定蛋白质稳定性的方法二、测定蛋白质稳定性的方法o熔化温度（熔化温度（TmTm，酶蛋白变性伸展过程中的温度），酶蛋白变性伸展过程中的温度）o变性剂浓度（变性剂浓度（50%50%伸展所需要的变性剂浓度）伸展所需要的变性剂浓度）o自由能变化（自由能变化（GG）o最大稳定性温度（最大稳定性温度（TsTs）o相对活力相对活力/%/%（时间（时间t t时保留的活力）时保留的活力）o加速降解试验（在较高温度下加速酶失活速度）加速降解试验（在较高温度下加速酶失活速度）二、测定蛋白质稳定性的方法熔化温度（Tm，酶蛋白变性伸展过程14（1 1）蛋白水解酶和自溶作用）蛋白水解酶和自溶作用（2 2）聚合作用（构象改变、分子间二硫键的交换反应）聚合作用（构象改变、分子间二硫键的交换反应）（3 3）极端）极端pHpH（远离等电点时，酶分子内相同电荷间的静电斥力导致蛋白质伸展）（远离等电点时，酶分子内相同电荷间的静电斥力导致蛋白质伸展）（4 4）氧化作用（部分氨基酸侧链易氧化）氧化作用（部分氨基酸侧链易氧化）（5 5）表面活性剂和去污剂（与酶蛋白结合，导致疏水氨基酸残基暴露）表面活性剂和去污剂（与酶蛋白结合，导致疏水氨基酸残基暴露）（6 6）变性剂：）变性剂：高浓度盐（结合酶蛋白的带电基团与降低酶蛋白周围的水簇数目）高浓度盐（结合酶蛋白的带电基团与降低酶蛋白周围的水簇数目）有机溶剂（改变介电常数、夺水及使疏水基团暴露）有机溶剂（改变介电常数、夺水及使疏水基团暴露）金属离子（螯合）金属离子（螯合）脲和盐酸胍（消除疏水相互作用及与酶蛋白分子直接作用）脲和盐酸胍（消除疏水相互作用及与酶蛋白分子直接作用）三、蛋白质不可逆失活的原因和机理三、蛋白质不可逆失活的原因和机理（1）蛋白水解酶和自溶作用三、蛋白质不可逆失活的原因和机理15（7 7）重金属离子和巯基试剂（与酶蛋白的某些基团反应）重金属离子和巯基试剂（与酶蛋白的某些基团反应）（8 8）热（构象改变使其反应基团和疏水区域暴露，并互相作用）热（构象改变使其反应基团和疏水区域暴露，并互相作用）（9 9）机械力：）机械力：振动（增加气振动（增加气-液界面的面积，酶蛋白分子在此界面上伸展导致疏水残基液界面的面积，酶蛋白分子在此界面上伸展导致疏水残基暴露而引起聚合）暴露而引起聚合）剪切（剪切力导致疏水残基暴露而引起聚合）剪切（剪切力导致疏水残基暴露而引起聚合）超声波（产生气泡，气泡产生机械力与热）超声波（产生气泡，气泡产生机械力与热）压力（变性后聚合）压力（变性后聚合）（1010）冷冻和脱水（酶分子浓缩过程中微环境中）冷冻和脱水（酶分子浓缩过程中微环境中pHpH和离子强度的剧烈改变、某和离子强度的剧烈改变、某些键发生反应）些键发生反应）（1111）辐射作用（形成自由基引起酶蛋白一级结构的共价改变、与水辐射分解）辐射作用（形成自由基引起酶蛋白一级结构的共价改变、与水辐射分解副产物反应）副产物反应）（7）重金属离子和巯基试剂（与酶蛋白的某些基团反应）16第三节第三节 酶蛋白的稳定化酶蛋白的稳定化一、固定化一、固定化二、非共价修饰二、非共价修饰三、化学修饰三、化学修饰四、蛋白质工程四、蛋白质工程第三节酶蛋白的稳定化一、固定化二、非共价修饰三、化学修饰四17结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！18结束语谢谢大家聆听！18