蛋白质常规层析技术

蛋白质常规层析技术 纯化组赵波 2010.3v一、层析概述一、层析概述v二、常用层析技术二、常用层析技术v三、纯化策略三、纯化策略一、层析概述一、层析概述v 层析法也称色谱法层析法也称色谱法(chromatography)是是1906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Tswett发发现并命名的。他将植物叶子的色素通过现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为由此得名为“色谱法色谱法”。1.层析的原理层析的原理v 层析技术是一组相关分离方法的总称。层析技术是一组相关分离方法的总称。v 当待分离的混合物随流动相通过固定相时，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的由于各组份的理化性质存在差异理化性质存在差异，与两相发，与两相发生相互作用（生相互作用（吸附、溶解、结合吸附、溶解、结合等）的能力等）的能力不同，在不同，在两相中的分配（含量对比）不同两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。目的。2.层析的分类层析的分类v 按固定相基质的形式：按固定相基质的形式：柱层析、纸层析和薄层层析柱层析、纸层析和薄层层析 v根据流动相的形式：根据流动相的形式：液相层析、气相层析液相层析、气相层析2.层析的分类层析的分类2.层析的分类层析的分类二、常用层析技术二、常用层析技术v亲和层析亲和层析v离子交换层析离子交换层析v疏水层析疏水层析v凝胶过滤层析凝胶过滤层析亲和层析亲和层析原理：原理：亲和层析是利用生物高分子与配基可逆结合的原理，将亲和层析是利用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键结合于载体上而制得的层析系统。配基通过共价键结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。别。常用的生物亲和关系有酶常用的生物亲和关系有酶-底物、抗体底物、抗体-抗原、外源凝集抗原、外源凝集素素-糖蛋白等。糖蛋白等。Affinity.swf填料选择：填料选择：v重点：选择合适的配基重点：选择合适的配基v应用：应用：原理：原理：以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。行分离。通过静电相互作用而使带正电荷的样品结合到阳离子交通过静电相互作用而使带正电荷的样品结合到阳离子交换介质上，而带负电荷的介质则可结合到阴离子交换介质上，换介质上，而带负电荷的介质则可结合到阴离子交换介质上，再采用改变盐浓度或者缓冲液的再采用改变盐浓度或者缓冲液的pHpH值的方法进行洗脱。值的方法进行洗脱。Ion Ion Exchange.swfExchange.swf离子交换层析离子交换层析 影响因素：影响因素：v缓冲液的盐浓度和缓冲液的盐浓度和pH pH 值。值。v在进行在进行pHpH梯度洗脱时，尽量避免跨越蛋白质的梯度洗脱时，尽量避免跨越蛋白质的等电点。等电点。洗脱策略：洗脱策略：v洗脱模式：流穿模式、结合模式。洗脱模式：流穿模式、结合模式。v洗脱方法：分步洗脱法、梯度洗脱法。洗脱方法：分步洗脱法、梯度洗脱法。v分步洗脱一般应用于在其中某一种盐浓度收集一种分步洗脱一般应用于在其中某一种盐浓度收集一种目标蛋白质，因此也一般应用于已知样品。目标蛋白质，因此也一般应用于已知样品。v梯度洗脱是按一定的浓度梯度连续改变盐浓度进行梯度洗脱是按一定的浓度梯度连续改变盐浓度进行洗脱，梯度越平缓，分辨率越高，但同时样品越稀。洗脱，梯度越平缓，分辨率越高，但同时样品越稀。去除内毒素和去除内毒素和DNA：v核酸带强负电荷，在纯化样品时可以利用阳离子交核酸带强负电荷，在纯化样品时可以利用阳离子交换介质（如换介质（如SP SFFSP SFF）结合目的蛋白而使核酸流穿；）结合目的蛋白而使核酸流穿；或者采用阴离子交换介质（或者采用阴离子交换介质（Q SFFQ SFF），使样品流穿而），使样品流穿而结合核酸。结合核酸。v内毒素是也带负电荷的复合大分子，能与阴离子交内毒素是也带负电荷的复合大分子，能与阴离子交换介质较强结合而在阳离子交换介质上流穿。换介质较强结合而在阳离子交换介质上流穿。填料选择：填料选择：v重点：在于选择合适的分辨率重点：在于选择合适的分辨率 原理：原理：根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种方法。等生物大分子的一种方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏些疏水性基团，称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。Hydrophobic Interaction.swf疏水层析疏水层析影响因素：影响因素：v盐类，盐可增加水相的极性，提高界面的表面张力，同时可盐类，盐可增加水相的极性，提高界面的表面张力，同时可使蛋白质暴露出临近界面的非极性基团，容易形成疏水作用。使蛋白质暴露出临近界面的非极性基团，容易形成疏水作用。所以盐浓度越高，促疏水作用越强。所以盐浓度越高，促疏水作用越强。v有机溶剂，同盐作用相反，减少疏水作用。有机溶剂，同盐作用相反，减少疏水作用。v表面活性剂也能减少疏水作用。表面活性剂也能减少疏水作用。v不同盐增强疏水配基和蛋白质之间的相互作用不同盐增强疏水配基和蛋白质之间的相互作用洗脱策略：洗脱策略：v在吸附时应适当增强盐浓度以增强蛋白质与层析剂在吸附时应适当增强盐浓度以增强蛋白质与层析剂之间的疏水作用力，洗脱可采用低浓度的盐溶液洗之间的疏水作用力，洗脱可采用低浓度的盐溶液洗脱。脱。v对于结合较强的蛋白质可以在洗脱剂中添加一些温对于结合较强的蛋白质可以在洗脱剂中添加一些温和的有机溶剂如多元醇或表面活性剂来洗脱。和的有机溶剂如多元醇或表面活性剂来洗脱。去除内毒素和去除内毒素和DNA：v核酸在高盐条件下会和蛋白解离核酸在高盐条件下会和蛋白解离,利用疏水层析介质利用疏水层析介质结合目标蛋白结合目标蛋白,去除核酸。去除核酸。v热原含脂肪热原含脂肪A A、糖类和蛋白，其脂肪、糖类和蛋白，其脂肪A A部份有很强的部份有很强的疏水性，但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。因疏水性，但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。因此可利用疏水层析结合目标蛋白而去除热原。此可利用疏水层析结合目标蛋白而去除热原。填料选择：填料选择：v重点：选择填料的疏水性强弱重点：选择填料的疏水性强弱v配基的类型：配基的类型：原理：原理：凝胶过滤层析是根据被分离物分子大小和形状的凝胶过滤层析是根据被分离物分子大小和形状的差异进行分离。差异进行分离。填料含有许多不同大小的孔，体积大的分子不填料含有许多不同大小的孔，体积大的分子不能进入体积小的孔，而体积小的物质可进入大孔，能进入体积小的孔，而体积小的物质可进入大孔，也可进入小孔，因此在柱中保留的时间比体积大的也可进入小孔，因此在柱中保留的时间比体积大的物质长。整个样品按分子量的大小顺序分开，体积物质长。整个样品按分子量的大小顺序分开，体积最大的物质最先出峰，体积最小的物质最后出峰。最大的物质最先出峰，体积最小的物质最后出峰。因此，凝胶过滤层析又被形象地称为分子筛层析。因此，凝胶过滤层析又被形象地称为分子筛层析。Gel Gel Filtration.swfFiltration.swf凝胶过滤层析凝胶过滤层析影响因素与洗脱策略：影响因素与洗脱策略：v对于凝胶过滤层析，其主要影响因素有上样体积和流动相的对于凝胶过滤层析，其主要影响因素有上样体积和流动相的盐浓度。盐浓度过低，会引起生物分子和介质之间的产生非盐浓度。盐浓度过低，会引起生物分子和介质之间的产生非特异性结合，可以适量的提高流动相的盐浓度，一般大于特异性结合，可以适量的提高流动相的盐浓度，一般大于0.05mol/L0.05mol/L。v脱盐脱盐/换液常用换液常用SephadexSephadex G-25 G-25，其最大上样量为，其最大上样量为30%30%。上样。上样体积太大，会导致样品脱盐体积太大，会导致样品脱盐/换液不彻底；换液不彻底；v除多聚体或降解产物，根据分子量不同常选择除多聚体或降解产物，根据分子量不同常选择SuperdexSuperdex 200 200或其他介质，其最大上样量仅为或其他介质，其最大上样量仅为2%2%。超过上样量会降低分辨。超过上样量会降低分辨率，导致目的蛋白和聚体等不能彻底分开。率，导致目的蛋白和聚体等不能彻底分开。填料选择：填料选择：v重点：选择分离范围重点：选择分离范围v精度：分子量差别一倍以上精度：分子量差别一倍以上v类型：类型：SephadexSephadex、SuperdexSuperdex、SephacrylSephacryl、SepharoseSepharose、SuperoseSuperose介质介质优点优点缺点缺点小颗小颗粒粒分离效果好分离效果好流速慢流速慢 分离时间长分离时间长大颗大颗粒粒流速快流速快区带扩散区带扩散 洗脱峰平而宽洗脱峰平而宽三、纯化策略三、纯化策略v基因工程制药的特点基因工程制药的特点v策略策略v应用应用基因工程药物制备的特点基因工程药物制备的特点v表达产物在培养液中含量较低；表达产物在培养液中含量较低；v含有大量细胞及代谢产物；含有大量细胞及代谢产物；v表达产物稳定性差，易失活变性；表达产物稳定性差，易失活变性；v表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；v对其质量要求纯度高、无菌、无热原。对其质量要求纯度高、无菌、无热原。策略策略1:纯化三步法纯化三步法(粗、中、精粗、中、精)纯化工艺的基本结构纯化工艺的基本结构v1、粗纯：浓、粗纯：浓缩，稳定蛋缩，稳定蛋白（去除蛋白（去除蛋白酶）白酶）v关注点：纯关注点：纯化速度和胶化速度和胶载量关系载量关系v2、中度纯、中度纯化：去除主化：去除主要杂质要杂质v关注点：载关注点：载量与分辨率量与分辨率的关系的关系v3、精纯：、精纯：最终去除痕最终去除痕量杂质（结量杂质（结构变体）构变体）v关注点：分关注点：分辨率与收率辨率与收率关系关系纯化技术在三步纯化策略中的应用纯化技术在三步纯化策略中的应用技术技术特点特点粗纯粗纯中度中度精纯精纯离子交换离子交换高分辨率、高高分辨率、高流速、高速度流速、高速度 疏水疏水分辨率好、容分辨率好、容量好、高速度量好、高速度 亲和亲和高分辨率、高高分辨率、高容量、高速度容量、高速度 凝胶过滤凝胶过滤高分辨率高分辨率（SurpedexSurpedex）策略策略2：步骤越少，收率越高：步骤越少，收率越高总收率总收率每步收率每步收率()第一步第一步第二步第二步第三步第三步 第四步第四步 第五步第五步99999999989897979696959595959595909085.585.581.581.577.477.490909090818172.972.965.565.5595980808080646451.251.240.140.132.832.870707070494934.334.324.024.016.816.8策略策略3：交替运用互补技术，合理串联：交替运用互补技术，合理串联v将分离机制互补的技术进行组合，交替运用将分离机制互补的技术进行组合，交替运用不同的层析方法不同的层析方法v综合考虑起始和结束条件串联，减少不同层综合考虑起始和结束条件串联，减少不同层析技术间的样品处理（浓缩；置换缓冲液）析技术间的样品处理（浓缩；置换缓冲液）v设计合理纯化路线，尽量简单设计合理纯化路线，尽量简单策略策略4：线性放大：线性放大需固定条件：需固定条件：v相同填料相同填料v相同缓冲液相同缓冲液v相同线速度、相同柱高相同线速度、相同柱高v相同样品浓度与缓冲条件相同样品浓度与缓冲条件v相同样品体积与柱床体积比例相同样品体积与柱床体积比例v相同梯度体积与柱床体积比例相同梯度体积与柱床体积比例Thank you!特特 性性作作 用用等电点等电点决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件相对分子量相对分子量选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质疏水性疏水性 与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度生物特异性生物特异性决定亲和配基决定亲和配基溶解性溶解性决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度稳定性稳定性决定工艺采用温度及流程时间决定工艺采用温度及流程时间蛋白质特性在分离纯化中的作用：蛋白质特性在分离纯化中的作用：