高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用全解课件

高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用汇报人：汇报人：高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用汇报人：Company Logo 目录目录背景介绍1测序的流程2对肿瘤研究的方法3总结4Company Logo 目录背景介绍1测序的流程2对肿瘤Company Logo 一、背景介绍一、背景介绍?高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation”sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。?高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。什么是高通量测序什么是高通量测序?Company Logo 一、背景介绍?高通量测序技术（HCompany Logo 第二代测序第三代测序第一代测序传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的测序技术统称为第一代测序。它在分子生物学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划主要包括罗氏454公司的454测序技术、Illumina公司的Solexa测序技术和ABI公司的SOLiD测序技术。第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序第三代DNA测序技术是以单分子测序为特点，如生物科学公司的单分子测序仪，以及正在研制的太平洋生物科学公司的单分子实时DNA测序技术和牛津纳米孔技术公司的纳米孔单分子测序技术等20052005年开始20世纪80年代中期正在研发测序的发展历程测序的发展历程Company Logo 第二代测序第三代测序第一代测序传Company Logo 目前常说的高通量测序是指用第二代测序技术来进行测序，第三代测序技术还不是很成熟，有的刚刚出现，有的则正在研制公司平台名称测序方法检测方法大约读长优点相对局限性Roche/454 基因组测序仪FLX系统焦磷酸测序法光学230-400 在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵Illumina HiSeq2000,HiSeq2500/MiSeq 可逆链终止物和合成测序法荧光/光学2x150 很高测序通量仪器昂贵；用于数据删节和分析的费用较高ABI/Solid 5500 xlSolid系统连接测序法荧光/光学25-35 很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，试剂成本最低测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵第二代主要的测序平台第二代主要的测序平台主要的测序平台主要的测序平台Company Logo 目前常说的高通量测序是指用第二代Company Logo 数据分析样品的制备文库的构建二、测序流程二、测序流程测序的流程测序的流程上机测序1.Description of the companys products2.Description of the companys business3.Description of the companys technology4.Description of the companys contents1.对测序后生成的数据进行分析2.普通的分析：去除低质量数据，进行序列组装，评估测序质量等3.高级分析：对基因进行注释，分析表达情况、构建互做网络等1.在第二代测序仪上进行测序，设定程序1.DNA序列打断、RNA序列要反转录为DNA序列再打断（超声破碎）200-300bp2.加接头，电泳选择片段大小3.PCR扩增，转到Flowcell上4.文库质检（QPCR)1.组织样品的培养或病理样品的收集2.样品总DAN、RNA的提取3.质检（总量、纯度、完整性、有没有降解等）Company Logo 数据分析样品的制备文库的构建二、Company Logo 三、对肿瘤研究的方法DNA1.实体肿瘤基因组学研究2.血液肿瘤基因组学研究3.表观遗传学研究4.免疫组学研究高通量测序在肿瘤研究的应用研究的应用RNA1.实体肿瘤转录组学研究2.血液肿瘤转录组学研究3.Exosome 研究肿瘤细胞通讯、扩散机制Company Logo 三、对肿瘤研究的方法DNA1.实Company Logo DNADNA方向方向1.实体肿瘤基因组学研究一.研究目的和意义寻找适用于肿瘤早期诊断、肿瘤分型、病程发展（恶化和转移）和预后的基因组分子标记，筛选药物的靶标。二.研究对象实体肿瘤的鉴别，按照临床病理分类，例如：肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、膀胱癌、食道癌、肾癌等。三.测序方案Exome capture seq（外显组捕获测序）描绘基因组外显子区域的SNV（单核苷酸变异），Indel（插入缺失）、CNV（拷贝数变异），分析基因变异和癌症的相关性。Target capture seq（目标捕获测序）对一些功能富集的基因或研究人员感兴趣的基因组的部分区域进行捕获，分析基因变异对癌症的影响。例如：癌症相关基因（508个）、免疫（883个）、凋亡（1536个）、细胞周期（1005个）、p53通路（162个）等。Whole genome seq（全基因组测序）对基因组上所有的基因进行测序分析，找到大量的SNV、CNV、Indel、SV（结构变异）等基因变异信息，更为全面的解析癌症发生发展的分子机制。四.案例解析1.外显组测序鉴定体细胞突变2.外显组测序分析拷贝数和基因融合3.全基因组重测序展示人类首个癌基因组图谱4.全基因组测序解析基因组拷贝数变异Company Logo DNA方向1.实体肿瘤基因组学研Company Logo DNADNA方向方向2.血液肿瘤基因组学研究一.研究目的和意义寻找适用于白血病早期诊断、疾病分期或分级、预后的分子标记，药物筛选的靶标，指导个体化用药的分子依据。二.研究对象血液病类型：骨髓增生异常综合症（MDS），多发性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病（急性粒细胞白血病）。三.测序方案Exome capture seq（外显组捕获测序）描绘基因组外显子区域的SNV（单核苷酸变异），Indel（插入缺失）、CNV（拷贝数变异），分析基因变异和癌症的相关性。Target capture seq（目标捕获测序）对一些功能富集的基因或研究人员感兴趣的基因组的部分区域进行捕获，分析基因变异对癌症的影响。例如：癌症相关基因（508个）、免疫（883个）、凋亡（1536个）、细胞周期（1005个）、p53通路（162个）等。Whole genome seq（全基因组测序）对基因组上所有的基因进行测序分析，找到大量的SNV、CNV、Indel、SV（结构变异）等基因变异信息，更为全面的解析癌症发生发展的分子机制。四.案例解析1.对4个慢性淋巴细胞性白血病（CLL）进行全基因组测序分析，在染色体13q14上有3位患者出现了基因组大片段的缺失。2.研究者选取22个FLT3-ITD突变阳性患者及29个FLT3-ITD 阴性患者进行目标区域捕获测序研究，能够检测到FLT3不同位臵的ITD，并在FLT3-ITD阴性患者基因组上发现了比较低频的ITD，为白血病的分子诊断提供了更为准确的信息。Company Logo DNA方向2.血液肿瘤基因组学研Company Logo DNADNA方向方向3.表观遗传学研究一.研究目的和意义DNA甲基化是表观遗传学研究的重点，是基因调控的手段之一，在维持细胞正常功能、传递基因组印记、胚胎发育和肿瘤发生等方面起着至关重要的作用。检测表观遗传学变异尤其是基因组的甲基化，探讨甲基化对于生物学功能的影响，并筛选可应用作为疾病早期诊断、分级和分型的分子标记。二.研究对象研究对象：各类肿瘤、发育、干细胞分化的不同阶段。三.测序方案RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）基于Msp|酶切消化和bisulfite处理的高性价比方法，可对基因组promoter区及CpG岛区域的DNA甲基化状态进行样品之间的比较分析。MBD-Seq（Methylated DNA Binding Domain Sequencing）由于在哺乳动物中甲基化一般发生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上，所以可通过特异性结合甲基化DNA的蛋白MBD2b富集高甲基化的DNA片段，并结合第二代高通量测序，对富集到的DNA片段进行测序，从而检测全基因组范围内的甲基化位点。MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）通过使用5-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA片段，然后将富集后的DNA进行高通量测序。BS（Bisulfite Sequsencing）Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化的C碱基与甲基化的C碱基区分开来，因此成为表观遗传学研究的经典实验方法。将Bisulfite处理与高通量测序技术的结合的Bisulfite Sequencing能够绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，可用于研究特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联。Company Logo DNA方向3.表观遗传学研究一.Company Logo DNADNA方向方向4.免疫组学研究一.研究的背景T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子，是人类基因组中多态性最高的区域之一，决定着人的免疫系统如何适应环境的变化。T细胞受体库的多样性（包括基因重组以及选择性表达）直接反映了机体免疫应答的状态。二.适用范围肿瘤免疫、自身免疫性疾病、器官移植免疫监测、疫苗注射免监测三.案例解析目的：目的：干细胞移植（HSCT）后，通过对TCR（T细胞受体）的CDR3（VDJ基因重组区域）区域进行重组分析获得移植后病人的CD4+和CD8+T细胞的多样性，从而检测移植受体免疫重建的结果。通过比较不同来源的干细胞（造血干细胞、去除T细胞的造血干细胞、脐血干细胞）移植后的TCR的多样性进行移植效果的判断，并阐述TCR多样性与细菌感染的关系。方法：选取干细胞移植的病人作为研究对象，时间点为移植后6个月和12个月，以健康人作为对照。从8ml外周血中分理CD4+和CD8+T细胞处利用高通量测序技术结合生物信息学分析检测TCR的CDR3区域重组的多样性。结果：1.对去除T细胞（TCD）的干细胞移植病人的测序结果分析发现移植病人的TCR的多样性比健康人要低。2.对不同来源的干细胞进行TCR多样性分析，发现脐血干细胞移植后，TCR的多样性最高，且CD4+来源的TCR比CD8+来源的TCR多样性高。3.年龄和供体对干细胞移植后TCR的多样性影响不大，但是出现急性移植物抗宿主病及全身类固醇治疗的病人有着较高的TCR多样性，相反，出现巨细胞病毒（CMV）疱疹病毒（EBV）感染的病人TCR多样性比较低。Company Logo DNA方向4.免疫组学研究一.研Company Logo RNARNA方向方向1.实体肿瘤转录组学研究一.研究目的和意义寻找适用于肿瘤早期诊断、肿瘤分型（在分子水平对疾病能够准确分型）、病程发展（恶化和转移）和预后的转录组分子标记，筛选药物的靶标，用药的分子依据。二.研究对象实体肿瘤的鉴别，按照临床病理分类，例如：肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌、肾癌、淋巴瘤等。三.测序方案RNA-seq（PolyA法mRNA测序）发现癌症发生或转移相关的mRNA的变异（几乎所有基因的表达量差异、基因融合和选择性剪切等事件）。SmallRNA-seq（小RNA测序）分析miRNA的表达量差异，预测miRNA作用的靶基因，筛选可用于疾病诊断和预后的分子标记。lncRNA-seq（长链非编码RNA测序）通过PolyA尾抓取或核糖体RNA去除的方法，富集mRNA和lncRNA，可以发现样品中的新lncRNA，并同时检测样本中的mRNA和lncRNA，进行共表达分析，以mRNA的功能富集分析挖掘lncRNA的功能和潜在作用机制，探讨lncRNA和疾病的关系。四.案例解析Company Logo RNA方向1.实体肿瘤转录组学研Company Logo RNARNA方向方向2.血液肿瘤转录组学研究一.研究目的和意义寻找适用于白血病早期诊断、疾病分期或分级、预后的分子标记，药物筛选的靶标，指导个体化用药的分子依据。二.研究对象血液病类型：骨髓增生异常综合症（MDS），多发性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病（急性粒细胞白血病）。三.测序方案RNA-seq（PolyA法mRNA测序）发现癌症发生或转移相关的mRNA的变异（几乎所有基因的表达量差异、基因融合和选择性剪切等事件）。SmallRNA-seq（小RNA测序）分析miRNA的表达量差异，预测miRNA作用的靶基因，筛选可用于疾病诊断和预后的分子标记。lncRNA-seq（长链非编码RNA测序）通过PolyA尾抓取或核糖体RNA去除的方法，富集mRNA和lncRNA，可以发现样品中的新lncRNA，并同时检测样本中的mRNA和lncRNA，进行共表达分析，以mRNA的功能富集分析挖掘lncRNA的功能和潜在作用机制，探讨lncRNA和疾病的关系。四.案例解析Company Logo RNA方向2.血液肿瘤转录组学研Company Logo RNARNA方向方向3.Exosome研究肿瘤细胞通讯、扩散机制一.研究背景Exosome来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的囊泡，是由活细胞分泌的而来，是一类大小介于30-100nm的含有RNA和蛋白质的微囊，几乎所有类型的细胞都能分泌，广泛存在于各种体液中。Exosome参与调控重要的细胞生理活动，在免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、凝结过程中的作用均有报道，可以成为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。2013年10月7号，兰迪.谢克曼等三位科学家获得2013年诺贝尔医学奖，他们发现细胞中囊泡像船队一样运送货物至精准目的地的作用方式，这对大脑沟通方式、激素释放和免疫系统至关重要。二.Exosome成分蛋白质：如微管蛋白、肌动蛋白、肌动蛋白结合蛋白、热休克蛋白、三聚体蛋白、膜蛋白如：四跨膜蛋白（CD9，CD63，CD81，CD82）、整合素、膜联蛋白等。RNA：大量的rRNA,miRNA，极微量lncRNA,mRNA,snRNA,piRNA等。脂质：磷脂酰胆碱、胆固醇、神经鞘磷脂、神经节苷脂、磷脂酰乙醇胺等。三Exosome small RNA研究思路差异miRNA筛选(新一代测序：Small RNA测序)-生物信息分析-体外实验功能验证-体内实验验证四.案例解析1.通过qPCR检测肝癌细胞分泌的exosome的miRNA(Kogure T,et al.Hepatology.2011）Company Logo RNA方向3.Exosome研究Company Logo 四、总结四、总结Company Logo 四、总结高通量测序技术及其在肿瘤研究中的应用全解课件