免疫组化基本技术

免疫组化基本技术免疫组化基本技术 主要内容主要内容一、实验的设计一、实验的设计二、石蜡切片的脱蜡至水二、石蜡切片的脱蜡至水三、内源性酶的消除方法三、内源性酶的消除方法四、四、IHC的非特异性染色的非特异性染色五、抗原的暴露和修复五、抗原的暴露和修复六、抗体的购置及注意事项六、抗体的购置及注意事项七、抗体最佳稀释度的测定和保存七、抗体最佳稀释度的测定和保存 八、显示系统及衬染剂的选择和配制八、显示系统及衬染剂的选择和配制 九、九、IHC常用缓冲液常用缓冲液一、实验的设计一、实验的设计 1.查阅相关文献，列出要做的查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。关公司购置特异性抗体和检测试剂。2.2.列出列出IHCIHC实验操作流程，选择何种实验操作流程，选择何种IHCIHC前前 处理方式。处理方式。3.3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，应设置何种对照。应设置何种对照。4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育 时间和温度，同一的显色时间。时间和温度，同一的显色时间。5.列出阳性判定的标准列出阳性判定的标准6.预期达到的目标预期达到的目标组织与细胞材料的制备组织与细胞材料的制备1.1.手术切除标本的取材：手术切除标本的取材：抗原在组织中的分布常不均一，取材时抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。远离病灶的正常组织。组织大小：组织大小：长长1cm宽宽1cm厚厚0.20.3cm。2.2.各种小组织的活检取材：各种小组织的活检取材：它不仅体积小，取材困难，不易取到它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。及时固定，包埋时要平整。一、组织取材注意事项一、组织取材注意事项 1.组织要求离体后组织要求离体后30min内浸入固定液，内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。尤其是开展分子生物学工作。2.注意防止人为因素的影响注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。刀和剪要快，刀要足够长。3.组织块的大小组织块的大小 厚为厚为0.10.10.3cm0.3cm，大小可根据需要而定，大小可根据需要而定4.动物和人体组织的取材位置动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定要视研究目的，观察部位而定5.取材时间取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。后取材。6.注意包埋方向注意包埋方向 7.边缘标记边缘标记 8.保持材料的清洁保持材料的清洁 9.切除不需要的部分切除不需要的部分10.明确编号，登记明确编号，登记11.骨组织还需脱钙骨组织还需脱钙二、组织标本的固定二、组织标本的固定 1.目的目的 (1)(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。和腐败，以保持组织细胞的固有形态。(2)(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。原有的结构与生活时相仿。（3 3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起）使组织中的各种物质沉淀和凝固起 来而产生不同的折射率，造成光学来而产生不同的折射率，造成光学 上的差异，以便染色后易于鉴别和上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。观察。（4 4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。增加组织硬度、便于制片。（5 5）防止细胞过度收缩或膨胀而失）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。去其原有形态结构。（6 6）经过固定的组织能对染料产生）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。于辨认。2.2.固定方法的选择及注意事项固定方法的选择及注意事项 (1)(1)大小大小 2cm2cm2cm2cm0.3cm0.3cm (2)(2)及时固定及时固定(3)(3)固定时间固定时间 固定时间要视组织块的厚固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。(4)(4)组织固定后必须彻底冲洗。组织固定后必须彻底冲洗。三、组织脱水、浸蜡及包埋三、组织脱水、浸蜡及包埋 1.1.目的目的 组织经固定和水洗后含大量水分组织经固定和水洗后含大量水分,需需用乙醇类试剂进行脱水用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后水脱完后,组织内含有大组织内含有大量的乙醇量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称组织细胞内被大量石蜡支称,才使组才使组织能用于石蜡切片。织能用于石蜡切片。2.2.脱水剂的种类：脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。常用的脱水剂常用的脱水剂:(1):(1)乙醇；乙醇；(2)(2)丙酮；丙酮；(3)(3)正丁醇；正丁醇；(4)(4)淑丁醇；淑丁醇；(5)(5)环乙酮；环乙酮；(6)(6)松脂醇；松脂醇；(7)(7)二氧陆环。二氧陆环。3.3.常用的透明剂：常用的透明剂：(1)(1)二甲苯；二甲苯；(2)(2)甲苯；甲苯；(3)(3)苯；苯；(4)(4)香柏油；香柏油；(5)(5)苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；(6)(6)氯仿；氯仿；(7)(7)冬青油冬青油;(8);(8)苯胺油苯胺油4.4.原则原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。形。在脱水完全的前提下，组织的透明必在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。片困难。5.5.常规石蜡包埋过程常规石蜡包埋过程(1)(1)脱水：脱水：7575、8585乙醇，乙醇，9595、乙醇，无水乙醇乙醇，无水乙醇、。(2)(2)透明：二甲苯透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯(3)(3)浸蜡：石蜡浸蜡：石蜡、石蜡、石蜡、石蜡、石蜡(4)(4)石蜡包埋：修蜡块，标号石蜡包埋：修蜡块，标号四、组织切片四、组织切片 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，棉胶切片，IHCIHC切片要求不同与常规切切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。1.1.切片前的准备工作切片前的准备工作(1)(1)载玻片的清洁：载玻片的清洁：市售载玻片需经清市售载玻片需经清洁液泡洁液泡24h24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶凉干涂胶。(2)(2)切片粘合剂的种类切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量多聚赖氨酸（分子量300KD300KD）：）：0.5%0.5%浓度。浓度。APESAPES试剂（试剂（3-3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片净载玻片丙酮丙酮5min APES5min APES（1ml+50ml1ml+50ml丙酮）：丙酮）：用镊子夹住浸入用镊子夹住浸入APESAPES试剂试剂1 13 3次次纯丙酮洗二次纯丙酮洗二次干燥玻片干燥玻片用铝箔包好，室温或用铝箔包好，室温或44保存备用。保存备用。铬矾明胶液：铬矾明胶液：铬矾铬矾0.5g 0.5g 明胶明胶5g H5g H2 2O O2 2 1000ml 1000ml甲醛明胶液：甲醛明胶液：4040甲醛甲醛2.5ml 2.5ml 明胶明胶0.5g H0.5g H2 2O O2 2 100ml 100ml2.2.切片要求及注意事项：切片要求及注意事项：(1)(1)连续切片按序贴在玻片的下连续切片按序贴在玻片的下1/31/3。(2)52(2)526060烤片烤片18h18h。(3)(3)切片厚切片厚2 24 4m m。(4)(4)切片刀要快切片刀要快 (5)(5)编上号编上号 (6)(6)切片可在切片可在44保存数年（石蜡切片）保存数年（石蜡切片）石蜡切片脱蜡至水石蜡切片脱蜡至水 冰冻切片从冰冻切片从-80-80取出，凉干或电吹风取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做需经如下脱蜡才能做IHCIHC。二甲苯二甲苯10min10min，二甲苯，二甲苯10min10min，二甲苯二甲苯10min10min，无水乙醇，无水乙醇2min2min，9595乙乙醇醇2min2min，8585乙醇乙醇2min2min，7575乙醇乙醇2min2min，流水冲洗。，流水冲洗。五、内源性酶的消除方法五、内源性酶的消除方法(一一)内源性过氧化物酶的消除方法：内源性过氧化物酶的消除方法：1.0.3%3%H2O2甲醇液甲醇液20min 2.1 H2O2 20min 3.3苯肼溶液苯肼溶液 37 1h 4.0.075%盐酸甲醇液盐酸甲醇液 30min5.DAB-H5.DAB-H2 2O O2 2溶液中加溶液中加0.005M NaN30.005M NaN36.6.过碘酸过碘酸-硼酸钠：硼酸钠：0.5%0.5%过碘酸过碘酸10min10min，经洗后经洗后1 1硼酸钠处理硼酸钠处理10min10min。7.20mol/L-100mol/L7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸抗坏血酸303060min60min。(二二)内源性碱性磷酸酶的消除方法内源性碱性磷酸酶的消除方法 1.101.10醋酸醋酸 10min10min 2.0.5mol/L 2.0.5mol/L碳酸氢钠（碳酸氢钠（pH9.0pH9.0）20min20min 3.1mol/L 3.1mol/L左旋咪唑左旋咪唑 20min20min(三三)内源性生物素的消除方法内源性生物素的消除方法 1.1.用用2-2-甲基甲基-D-D苷露糖饱和生物素苷露糖饱和生物素 2.2.先用先用2525g/mlg/ml卵白素孵育卵白素孵育15min15min，PBSPBS洗洗10min10min，移至生物素饱和液中处理，移至生物素饱和液中处理15min15min，PBSPBS洗洗15min15min。六六、酶消化和抗原修复、酶消化和抗原修复 1.1.为什么要进行酶消化和抗原修复？为什么要进行酶消化和抗原修复？(1)(1)固定液的影响固定液的影响 自自18931893年年Ferdinand Ferdinand BlumBlum创立组织固定以来，为了避免组织固创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。态结构。目前无一种固定液适用于所有的抗原，从目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。综合评估上，甲醛最优。甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。变，而影响检测。(2)(2)抗体制备的影响抗体制备的影响2.2.酶消化酶消化 (1)(1)原理：原理：1)1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白蛋白 2)2)断交联断交联(2)(2)蛋白酶的种类蛋白酶的种类 胰蛋白酶胰蛋白酶0.05%0.05%0.10.1胰蛋白酶加入胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用等量的氯化钙，用0.1N 0.1N NaoHNaoH调调pHpH至至7.87.8。消化时间消化时间37 30min37 30min。胃蛋白酶胃蛋白酶 0.4%0.4%胃蛋白酶，用胃蛋白酶，用0.1N HCI0.1N HCI稀稀释，消化时间释，消化时间37 3037 30180min180min。蛋白酶蛋白酶K K 20 20g/mlg/ml，用，用pH8.0 0.5M pH8.0 0.5M TrisTris-HCI-HCI配制，消化时间配制，消化时间37 2037 2040min40min。链酶蛋白酶链酶蛋白酶 0.1%0.1%，用，用pH 7.4,0.5M pH 7.4,0.5M TrisTris-HclHcl稀释，消化时间稀释，消化时间37 137 14h4h。无花果蛋白酶无花果蛋白酶 0.1%0.1%浓度，用浓度，用0.2M 0.2M pH7.4 PBSpH7.4 PBS稀释，消化时间稀释，消化时间37 3037 3060min60min。(3)(3)原则及注意事项原则及注意事项 胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为细胞内抗原的显示消化。细胞内抗原的显示消化。在配制和使用时应考虑到酶激活的最在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳佳pHpH值，消化温度、浓度和孵育时间。值，消化温度、浓度和孵育时间。3.3.热诱导的抗原修复：热诱导的抗原修复：抗原修复抗原修复(Antigen(Antigen Retrieval;AR)Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。法和技术手段。(1)(1)依据：依据：4040年代美国学者年代美国学者FraenkelFraenkel-conratconrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定抗原决定簇簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120120高温或强碱处理后，可使交联打开。高温或强碱处理后，可使交联打开。(2)(2)修复方式：修复方式：微波微波969610min10min2 2；直接加温直接加温100100，15min15min；水浴锅水浴锅100100，15min15min；高压锅高压锅/消毒锅消毒锅120120，5min5min；真空加热真空加热10min10min；直接烤片法。直接烤片法。(3)(3)修复介质：修复介质：0.01M pH6.00.01M pH6.0柠檬酸缓柠檬酸缓冲液冲液(CB)(CB)；0.05mTris-HCL(pH1-120.05mTris-HCL(pH1-12系列系列);0.01M pH7.0 PBS;2%);0.01M pH7.0 PBS;2%硫酸铝；硫酸铝；2 2硝酸铝；硝酸铝；生理盐水；生理盐水；蒸馏水。认为蒸馏水。认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而果影响较小，而pHpH值则影响较大。缓冲液值则影响较大。缓冲液以以CBCB和和TrisTris-HCL-HCL较常见。较常见。(4)(4)温度与修复时间的关系：许多的实验结温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。果表明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，例如，KiKi-67-67、P-P-gpgp的检测，利用同一切片，的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：达到相同的染色结果如下步骤：100 100 20min20min；90 40min90 40min；80 60min80 60min；70 20h70 20h。(5)(5)选择最佳的修复方法选择最佳的修复方法(6)AR(6)AR应注意的问题：高温应注意的问题：高温ARAR因其机理尚因其机理尚不清楚，对某些存在的问题或现象不可能不清楚，对某些存在的问题或现象不可能用设计对照的方法加以解决或解释清楚，用设计对照的方法加以解决或解释清楚，例如，有些抗体在冰冻切片上不表达，或例如，有些抗体在冰冻切片上不表达，或表达率很低，但石蜡切片用表达率很低，但石蜡切片用ARAR后，却能很后，却能很好地表达；好地表达；某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内；某些应表修复后，绝大部分表达在核内；某些应表达在核内的抗原，经过量修复后出现在细达在核内的抗原，经过量修复后出现在细胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的分析。在操作过程中还应注意如下问题：分析。在操作过程中还应注意如下问题：热处理后应注意自然冷却；热处理后应注意自然冷却；热处理液不要让其煮干；热处理液不要让其煮干；不要任何抗原的检测都使用该方法；不要任何抗原的检测都使用该方法；一批抗原的检测其温度和时间一定保一批抗原的检测其温度和时间一定保 持一致；持一致；形态学结构的改变：一般经高温修复后形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。如果在常用的修复液无法得到阳性结果，如果在常用的修复液无法得到阳性结果，或经修复后抗原定位发生改变，可改用某或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如EDTAEDTA和和EGTAEGTA等可改善某些抗原的修复。等可改善某些抗原的修复。七七、抗体的购置及注意事项、抗体的购置及注意事项 1.1.抗体的购置抗体的购置 目前商品化抗体已有目前商品化抗体已有上千种，一种抗体可以有数家公司生产，上千种，一种抗体可以有数家公司生产，其质量的好坏也存在很大差异，首先应选其质量的好坏也存在很大差异，首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号。息，选择所需试剂的型号。2.2.购置抗体的注意事项购置抗体的注意事项 (1)(1)种属：单克隆抗体，多克隆抗体种属：单克隆抗体，多克隆抗体 (2)(2)能否用于石蜡切片能否用于石蜡切片 (3)(3)稀释度稀释度 (4)(4)特异性，交叉反应特异性，交叉反应 (5)(5)用何种组织前处理形式用何种组织前处理形式 (6)(6)包装单位，价格包装单位，价格3.3.抗体的大致分类抗体的大致分类 (1)(1)癌基因与抗癌基因标记物；癌基因与抗癌基因标记物；(2)(2)细胞凋亡标记物；细胞凋亡标记物；(3)(3)各种信号传导标记物各种信号传导标记物 (4)(4)各种正负调控基因标记物各种正负调控基因标记物 (5)(5)细胞增殖及调控标记物；细胞增殖及调控标记物；(6)(6)凝集素类标记物凝集素类标记物 (7)(7)激素受体标记物激素受体标记物 (8)(8)病毒性标记物病毒性标记物 (9)(9)各类肿瘤标记物各类肿瘤标记物 (10)(10)耐药基因标记物耐药基因标记物八八、抗体最佳稀释度的测定和保存、抗体最佳稀释度的测定和保存 1.1.直接测定法直接测定法一抗稀释度一抗稀释度 特异性染色特异性染色 非特异性染色非特异性染色 1:50 +1:100 +1:200 +1:400 +1:500 +()阴性对照阴性对照 ()()2.2.棋盘法棋盘法3.3.抗体稀释液抗体稀释液 抗体稀释液是从事抗体稀释液是从事IHCIHC工作实验室必备，其制备方法如下：工作实验室必备，其制备方法如下：1 1克克明胶明胶(红、绿红、绿)溶在溶在300ml 0.2M pH7.6 TBS300ml 0.2M pH7.6 TBS中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后，中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后，加入加入1 1克牛血清白蛋白和克牛血清白蛋白和100mg NaN3100mg NaN3，44保存。保存。4.4.抗体的保存抗体的保存 商品化一抗或自制一抗均商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂，在需加入防腐剂，在44中保存一年其质量不中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可会有太多的改变，如一次购置量大，可10l/10l/支分装，标上号，支分装，标上号，-40-40保存备用。保存备用。用抗体稀释液稀释一抗可在用抗体稀释液稀释一抗可在44中保存一年。中保存一年。十十、显示系统及衬染剂的选择和配制、显示系统及衬染剂的选择和配制 (一一)显示系统显示系统 目前用于目前用于IHC的标记酶主要有的标记酶主要有HRP，AKP，其显示系统分别为：，其显示系统分别为：1.HRP1.HRP常用的发色基因：常用的发色基因：(1)3(1)3、3 3-二氨基联苯胺盐酸盐二氨基联苯胺盐酸盐(3(3、3 3-diaminbezidinediaminbezidine;DAB);DAB);(2)3-(2)3-氨基氨基-9-9-乙基卡吧唑乙基卡吧唑(3-amino-9-(3-amino-9-ethlylcarbazdeethlylcarbazde;AEC);AEC);(3)(3)四甲基联苯胺；四甲基联苯胺；(4)(4)盐酸对苯二胺；盐酸对苯二胺；(5)4-(5)4-氯氯-1-1-萘酚；萘酚；(6)(6)高香草酸高香草酸(7)(7)萘酚派若宁萘酚派若宁2.AKP2.AKP常用的发色基团：常用的发色基团：(1)BCIP(1)BCIP（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基磷酸吲哚基磷酸)NBT(NBT(硝基四氮唑蓝硝基四氮唑蓝)；(2)(2)萘酚萘酚AS-BIAS-BI磷酸盐快红或快磷酸盐快红或快蓝。蓝。3.3.配制方法配制方法 (1)DAB:50mg DAB(1)DAB:50mg DAB溶在溶在0.01M pH7.6 0.01M pH7.6 100ml 100ml TrisTris-HclHcl中，加入中，加入0.03%H0.03%H2 2O O2 2，显，显色色8 812min12min，终产物为不溶性棕褐色颗粒，终产物为不溶性棕褐色颗粒状。状。(2)AEC:(2)AEC:取取40mg AEC40mg AEC溶在溶在5ml5ml二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，加入中，待完全溶解后，加入0.05mol/L 0.05mol/L pH5.5pH5.5醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液50ml50ml，最后加入，最后加入0.03%0.03%H H2 2O,O,终产物为红色可溶性。终产物为红色可溶性。(3)4-(3)4-氯氯-萘酚：取萘酚：取100mg 4cl-1-100mg 4cl-1-萘酚溶于萘酚溶于10ml10ml无水乙醇中，待完全溶解后加入无水乙醇中，待完全溶解后加入0.05M pH7.6 TB 190ml,0.05M pH7.6 TB 190ml,过滤后加入过滤后加入0.03%0.03%H H2 2O O2 2。(二二)衬染剂的选择和配制衬染剂的选择和配制 IHCIHC染色后必须进行衬染，以衬托出染色后必须进行衬染，以衬托出组织形态结构，使形态与机能密切相关，组织形态结构，使形态与机能密切相关，以利于结果的分析。以利于结果的分析。1.1.苏木素衬染色剂苏木素衬染色剂 (1)Mayer(1)Mayer氏苏木素：取氏苏木素：取1g Mayer1g Mayer氏苏氏苏木素加温溶于木素加温溶于100ml100ml蒸馏水中，再加入蒸馏水中，再加入50g50g碘酸钠和碘酸钠和50g50g钾明矾，溶解后加入枸橼酸钾明矾，溶解后加入枸橼酸和水合氯醛，溶解后过滤。和水合氯醛，溶解后过滤。(2)Harris(2)Harris氏苏木素：取氏苏木素：取2.5g Harris2.5g Harris氏苏氏苏木素溶于木素溶于25ml25ml无水乙醇中，另将钾明矾加无水乙醇中，另将钾明矾加温溶于温溶于500ml500ml蒸馏水中，待钾明矾全部溶蒸馏水中，待钾明矾全部溶解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，溶解溶解30min30min，冷却后过滤，使用时加醋酸，冷却后过滤，使用时加醋酸4ml4ml，可增加染色强度。，可增加染色强度。2.2.甲基绿：甲基绿：取取2 2甲基绿水溶液甲基绿水溶液20ml20ml倾入倾入洁净的分液漏斗，加入三氯甲烷充分摇荡洁净的分液漏斗，加入三氯甲烷充分摇荡混合，使甲基绿中的甲基紫溶于氯仿中而混合，使甲基绿中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，移呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，移去紫红色的三氯甲烷，如此反复更换氯仿，去紫红色的三氯甲烷，如此反复更换氯仿，直到氯仿为无色。直到氯仿为无色。3.3.核固红：核固红：取取0.1g0.1g核固红溶于核固红溶于100ml 15100ml 15硫酸铝水溶液，加热溶解，冷却后过滤。硫酸铝水溶液，加热溶解，冷却后过滤。九、九、IHCIHC常用缓冲液：常用缓冲液：1.0.01M pH7.4 PBS1.0.01M pH7.4 PBS 2.0.02M pH7.6 TBS 2.0.02M pH7.6 TBS