乳酸发酵工艺学

第三章第三章 乳酸发酵乳酸发酵第一节第一节 绪论绪论 重要的一元羧基酸（重要的一元羧基酸（-羟基丙酸）存在于酸羟基丙酸）存在于酸牛奶而得名，产、消量仅次于柠檬酸牛奶而得名，产、消量仅次于柠檬酸,发酵法生发酵法生产乳酸始于产乳酸始于1919世纪世纪8080年代年代,1942,1942年我国从牛奶中年我国从牛奶中分离到乳酸菌分离到乳酸菌,1944,1944年进行了工业化发酵生产。年进行了工业化发酵生产。一、乳酸工业发展历程一、乳酸工业发展历程l1878年李斯特成功分离乳酸细菌，为纯种培养乳年李斯特成功分离乳酸细菌，为纯种培养乳酸菌、进行工业化生产奠定基础。酸菌、进行工业化生产奠定基础。l1894年年EijKman发现鲁氏毛霉产少量乳酸发现鲁氏毛霉产少量乳酸l19171918年赤木采用德氏乳杆菌以甘薯淀粉为原年赤木采用德氏乳杆菌以甘薯淀粉为原料进行工业化生产乳酸料进行工业化生产乳酸l1936年年Ward分离获得优良的分离获得优良的L-乳酸菌产生菌米根乳酸菌产生菌米根霉，并进行表面发酵生产霉，并进行表面发酵生产L-乳酸。乳酸。l1938年年Ward采用米根霉在旋转发酵罐中通风液态采用米根霉在旋转发酵罐中通风液态培养生产培养生产L-乳酸。乳酸。l1982年年Stenroon等采用海子酸钙固定化德氏乳杆等采用海子酸钙固定化德氏乳杆菌，发酵生产菌，发酵生产D-乳酸，转化率达乳酸，转化率达80%。二、乳酸工业概况二、乳酸工业概况l近年来，世界各国在研究白色污染的塑料近年来，世界各国在研究白色污染的塑料制品中发现，制品中发现，L-乳酸聚合物制成的塑料可乳酸聚合物制成的塑料可以在自然的条件下以在自然的条件下100%的降解。世界卫生的降解。世界卫生组织鉴于组织鉴于D-乳酸对人体有危害作用，提倡乳酸对人体有危害作用，提倡在食品、医药领域使用在食品、医药领域使用L-乳酸，从而乳酸，从而L-乳乳酸得到较快的发展。酸得到较快的发展。三、乳酸工业科技进展三、乳酸工业科技进展1、生产菌种方面、生产菌种方面l国内外纷纷开展米根霉国内外纷纷开展米根霉L-乳酸发酵的研究，乳酸发酵的研究，主攻方向是选育主攻方向是选育L-乳酸占总酸乳酸占总酸95%以上的以上的高产菌种，进一步提高转化率，缩短发酵高产菌种，进一步提高转化率，缩短发酵周期，同时开发嗜热芽孢杆菌等乳酸细菌周期，同时开发嗜热芽孢杆菌等乳酸细菌的的L-乳酸发酵研究，其优点是发酵温度高，乳酸发酵研究，其优点是发酵温度高，无须供给无菌空气。无须供给无菌空气。2、工艺方面、工艺方面l（1）原料上采用廉价的来源广泛）原料上采用廉价的来源广泛l（2）采用固定化细胞技术，提高产酸速率，将生）采用固定化细胞技术，提高产酸速率，将生长的乳酸细菌和根霉固定于化，进行发酵长的乳酸细菌和根霉固定于化，进行发酵L-乳酸，乳酸，产酸速率明显提高。产酸速率明显提高。l（3）采用原位分离发酵技术，在乳酸发酵过程中，）采用原位分离发酵技术，在乳酸发酵过程中，组合电渗析、离子交换、膜分离技术，减少乳酸组合电渗析、离子交换、膜分离技术，减少乳酸对发酵的抑制作用。对发酵的抑制作用。l（4）开发新的分离、精制乳酸技术，不断提高）开发新的分离、精制乳酸技术，不断提高L-乳酸的纯度和提取率。乳酸的纯度和提取率。3、设备方面、设备方面l（1）开展节能、低耗的反应器研究，例如）开展节能、低耗的反应器研究，例如采用米根霉发酵采用米根霉发酵L-乳酸中，开发无搅拌的乳酸中，开发无搅拌的气升式发酵罐替代目前的标准式发酵罐，气升式发酵罐替代目前的标准式发酵罐，降低动力消耗。降低动力消耗。l（2）乳酸采用流化床干燥器，稳定了产品）乳酸采用流化床干燥器，稳定了产品质量，避免杂菌污染，实现生产连续。质量，避免杂菌污染，实现生产连续。第二节第二节 乳酸发酵工艺学乳酸发酵工艺学 一一.乳酸的理化性质乳酸的理化性质 分子结构中含有不对称碳原子，具有旋光性分子结构中含有不对称碳原子，具有旋光性 分子量为分子量为90.08，粘稠状液体，无色，澄明，粘稠状液体，无色，澄明，微具黄色，无嗅，味微酸，有较强吸湿性微具黄色，无嗅，味微酸，有较强吸湿性 可可以与水、酒精和乙醚以任意比例混合以与水、酒精和乙醚以任意比例混合 由于其分子内含有一个不对称碳原子，因此具有由于其分子内含有一个不对称碳原子，因此具有旋光性，旋光性，L一乳酸为右旋，当一乳酸为右旋，当L一乳酸和一乳酸和D一乳酸一乳酸等比例混合时，即成为外消旋的等比例混合时，即成为外消旋的DL一乳酸。一乳酸。L一一乳酸能与水完全相容，但不结晶。乳酸能与水完全相容，但不结晶。60%以上浓度以上浓度的乳酸具有很强的吸湿性。纯净的无水乳酸是白的乳酸具有很强的吸湿性。纯净的无水乳酸是白色结晶体，熔点为色结晶体，熔点为168 ，沸点为，沸点为122(2kPa),相对密度为相对密度为1.240。L一乳酸分子内含有羟基和羧一乳酸分子内含有羟基和羧基基.因此有自动醋化能力，脱水能聚合成聚因此有自动醋化能力，脱水能聚合成聚L一乳一乳酸。酸。一般工业用一般工业用L一乳酸含量为一乳酸含量为50%-80%，食品及医药工业用，食品及医药工业用L一乳酸的含量为一乳酸的含量为80%一一90%。L一乳酸及一乳酸及L一乳酸盐在食一乳酸盐在食品、医药、农业、化工等领域有广泛的应用。此外，品、医药、农业、化工等领域有广泛的应用。此外，L一一乳酸还有正在大力开拓的应用领域，即生产聚乳酸还有正在大力开拓的应用领域，即生产聚L一乳酸。一乳酸。聚聚L一乳酸作为无毒，可降解的生物相容性高分子材料，一乳酸作为无毒，可降解的生物相容性高分子材料，可用来制造生物可降解塑料、绿色包装材料和药用修复材可用来制造生物可降解塑料、绿色包装材料和药用修复材料等，以解决日益严重的料等，以解决日益严重的“白色污染白色污染”问题，引起了世界问题，引起了世界的广泛关注，应用前景非常广阔，具有较好的社会效益和的广泛关注，应用前景非常广阔，具有较好的社会效益和经济效益。随着经济效益。随着L一乳酸用途越来越广泛，市场的需求量一乳酸用途越来越广泛，市场的需求量也越来越大。国内外都已经展开了对其生产的深入研究，也越来越大。国内外都已经展开了对其生产的深入研究，并取得了可喜的成果。并取得了可喜的成果。二二.乳酸的用途乳酸的用途食用食用：果子露、水果罐头、果酱和清凉饮料的：果子露、水果罐头、果酱和清凉饮料的 酸味剂酸味剂医药：医药：乳酸亚铁是最近国外广泛使用的铁质食乳酸亚铁是最近国外广泛使用的铁质食 品添加剂，容易被人体吸收，治疗缺铁性贫血品添加剂，容易被人体吸收，治疗缺铁性贫血在染料工业中乳酸也有广泛的应用在染料工业中乳酸也有广泛的应用日化行业日化行业:乳酸在配制清洁霜、嫩肤霜、浴液时，乳酸在配制清洁霜、嫩肤霜、浴液时，可用于调节可用于调节pH 值，并对改善皮肤组织结构，消值，并对改善皮肤组织结构，消除皱纹、色斑，治疗皮肤干燥、痤疮等具有明除皱纹、色斑，治疗皮肤干燥、痤疮等具有明显效果显效果生产生物降解材料：l为了解决令人头疼的“白色污染”问题,许多国家着手研究生产和使用可降解塑料。乳酸通过高分子合成技术可制成能生物降解的高分子材料，这种材料遭生物或化学破坏后，失去物理强度脆化，再经自然界剥蚀、破碎，最后变成粉末进入土壤，在微生物作用下重新进入生物循环。生物降解材料，具有极大的市场发展潜力，有望取代传统塑料消除“白色污染”问题，目前已成为开发的热点项目。另外，聚乳酸还可作医用材料，用作医院手术缝合线及骨折手术中起固定作用的骨钉等。三、三、L L一乳酸生产方法一乳酸生产方法 L一乳酸的工业化生产主要有化学合成法、一乳酸的工业化生产主要有化学合成法、酶法和微生物发酵法。国外三种方法都有酶法和微生物发酵法。国外三种方法都有报道，我国多采用发酵法为主。报道，我国多采用发酵法为主。微生物发酵法采用玉米、小麦等淀粉为原料，经过淀粉酶和微生物发酵法采用玉米、小麦等淀粉为原料，经过淀粉酶和糖化酶将淀粉被糖化，再有微生物发酵将糖转化为糖化酶将淀粉被糖化，再有微生物发酵将糖转化为I一乳一乳酸。不同的乳酸菌所含的酶系不同，代谢途径及形成的最终酸。不同的乳酸菌所含的酶系不同，代谢途径及形成的最终产物也不同。从代谢产物而言，乳酸菌对糖的发酵可以分为产物也不同。从代谢产物而言，乳酸菌对糖的发酵可以分为同型乳酸发酵和异型乳酸发酵两类。细菌发酵为厌氧或微好同型乳酸发酵和异型乳酸发酵两类。细菌发酵为厌氧或微好氧，细菌的同型发酵一般是通过糖酵解途径，异型发酵有氧，细菌的同型发酵一般是通过糖酵解途径，异型发酵有6一磷酸葡萄糖酸途径和双歧途径两种一磷酸葡萄糖酸途径和双歧途径两种.根霉发酵属好氧异型根霉发酵属好氧异型发发酵，但其途径与细菌异型发酵不同，是通过糖酵解途径，发酵，但其途径与细菌异型发酵不同，是通过糖酵解途径，发酵产生乳酸。一般同型发酵所产生的最终代谢产物是乳酸，酵产生乳酸。一般同型发酵所产生的最终代谢产物是乳酸，副产物很少，转化率高，一般副产物很少，转化率高，一般8O%以上，而异型发酵所产生以上，而异型发酵所产生的最终产物是乳酸外，还有乙醇、乙酸、二氧化碳等，副产的最终产物是乳酸外，还有乙醇、乙酸、二氧化碳等，副产物较多，转化率低，一般物较多，转化率低，一般50%;乳酸的发酵法生产乳酸的发酵法生产 四、乳酸细菌发酵的机理四、乳酸细菌发酵的机理 一些能大量产生乳酸的细菌称为乳酸细菌，同型一些能大量产生乳酸的细菌称为乳酸细菌，同型乳酸发酵葡萄糖经乳酸发酵葡萄糖经EMPEMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。1 1、同型乳酸发酵同型乳酸发酵 乳杆菌属（乳杆菌属（Lactobacillus）链球菌属（链球菌属（Streptococcus）等）等 异型乳酸发酵是某些乳酸细菌利用异型乳酸发酵是某些乳酸细菌利用HMP途途径，分解葡萄糖为径，分解葡萄糖为5-磷酸核酮糖，经差向异磷酸核酮糖，经差向异构酶作用变成构酶作用变成5-磷酸木酮糖，然后经磷酸酮磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解反应，生成解酶催化裂解反应，生成3-磷酸甘油醛和乙磷酸甘油醛和乙酸磷酸。磷酸酮解酶是异型乳酸发酵的关酸磷酸。磷酸酮解酶是异型乳酸发酵的关键酶，乙酰磷酸进一步还原为乙醇，同时键酶，乙酰磷酸进一步还原为乙醇，同时放出磷酸。而放出磷酸。而3-磷酸甘油醛经磷酸甘油醛经EMP途径后途径后半部分转化为乳酸，同时产生两分子半部分转化为乳酸，同时产生两分子ATP。2、异型乳酸发酵、异型乳酸发酵3、双歧发酵途径、双歧发酵途径l双歧途径是两岐双歧杆菌发酵葡萄糖产生双歧途径是两岐双歧杆菌发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。此途径中有两条酮解酶乳酸的一条途径。此途径中有两条酮解酶参与反应，即参与反应，即6-磷酸果糖磷酸酮解酶和磷酸果糖磷酸酮解酶和5-磷磷酸木酮糖磷酸酮解酶，分别催化酸木酮糖磷酸酮解酶，分别催化6-磷酸果糖磷酸果糖和和5-磷酸木酮糖的裂解反应，生成乙酰磷酸、磷酸木酮糖的裂解反应，生成乙酰磷酸、4-磷酸赤藓糖和磷酸赤藓糖和3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。磷酸甘油醛和乙酰磷酸。4、米根霉发酵机制、米根霉发酵机制 五、五、乳酸发酵微生物乳酸发酵微生物 l 从各文献报道来看，产从各文献报道来看，产L一乳酸的菌种很多，一乳酸的菌种很多，但产酸能力强，具有生产价值的目前主要但产酸能力强，具有生产价值的目前主要是霉菌中的根霉菌属及细菌中的乳杆菌属是霉菌中的根霉菌属及细菌中的乳杆菌属(Lactobacillus),链球菌属链球菌属(Streptococcus)，及芽孢杆菌属，及芽孢杆菌属(Bacillus)等。等。根霉菌属：根霉菌属：l黑根霉、小麦曲根霉、华根霉、甘薯黑根霉、小麦曲根霉、华根霉、甘薯根霉、米根霉、结节根霉、日本根霉、根霉、米根霉、结节根霉、日本根霉、少根根霉、美丽根霉等。少根根霉、美丽根霉等。1、乳酸产生菌的生理特性l德氏乳杆菌l细胞杆状、革兰氏阳性菌，不运动，发酵生产D-乳酸，少数生产DL-乳酸，最适生长温度45，在50仍能生长、发育，最高能耐55。在琼脂平板上菌落小，扁平，呈锯齿状，再明胶平板上菌落灰色、环状。在琼脂斜面上呈半透明灰色状。米根霉米根霉l菌落疏松或稠密，最初为白色，后变灰褐菌落疏松或稠密，最初为白色，后变灰褐色、匍匐枝爬行，物色，假根发生，指状色、匍匐枝爬行，物色，假根发生，指状或根状分枝，褐色。孢子囊梗直立或弯曲，或根状分枝，褐色。孢子囊梗直立或弯曲，2-42-4根群生，与假根对生。最适发育温度根群生，与假根对生。最适发育温度3737，4141也能生长，有淀粉糖化能力，也能生长，有淀粉糖化能力，发酵生产最适温度在发酵生产最适温度在3030。2 2、常用、常用 乳酸细菌的分离与培养乳酸细菌的分离与培养（1 1）德氏乳杆菌的分离）德氏乳杆菌的分离（2 2）其它乳酸菌的分离）其它乳酸菌的分离（a a）采用碳酸钙的）采用碳酸钙的GYPGYP培养基，其组分参考培养基，其组分参考P350P350，配，配置含有碳酸钙的置含有碳酸钙的GYPGYP培养基的顺序是先配组分培养基的顺序是先配组分1 1，再将，再将组分组分2 2配制好，加到组分配制好，加到组分1 1中，灭菌。中，灭菌。通常乳酸菌在含有碳酸钙的通常乳酸菌在含有碳酸钙的GYPGYP培养基是能充分形培养基是能充分形成菌落，但也有一部分乳酸菌在上述培养基上不能生成菌落，但也有一部分乳酸菌在上述培养基上不能生长，若知道样品中乳酸菌的存在，而在平板上却不能长，若知道样品中乳酸菌的存在，而在平板上却不能形成菌落，可以通过下列改良培养基或条件再进行分形成菌落，可以通过下列改良培养基或条件再进行分离：离：上述培养基若出现酵母、霉菌和好气细菌，则应在上述培上述培养基若出现酵母、霉菌和好气细菌，则应在上述培养基中添加养基中添加10mg/L10mg/L代谢抑制物（叠氮化钠）和代谢抑制物（叠氮化钠）和10mg/L10mg/L抗菌抗菌物质（纺线菌铜）。物质（纺线菌铜）。有些乳酸菌不能发酵葡萄糖，而这些乳酸菌可利用葡萄糖有些乳酸菌不能发酵葡萄糖，而这些乳酸菌可利用葡萄糖以外的糖类，如果糖、木糖、麦芽糖等。因此将分离培养以外的糖类，如果糖、木糖、麦芽糖等。因此将分离培养基中的碳源更换为其他碳源。基中的碳源更换为其他碳源。有些乳酸菌嗜酸，有些乳酸菌嗜酸，PH6 PH6 就不能生长，因此分离用培养基就不能生长，因此分离用培养基的的PHPH可调至可调至5 5。0505。5 5，但这种酸性培养基中添加碳酸钙，高压灭菌时容易引起但这种酸性培养基中添加碳酸钙，高压灭菌时容易引起PHPH的上升。因此配制酸性培养基时不加入碳酸钙。由于培养的上升。因此配制酸性培养基时不加入碳酸钙。由于培养基不含有碳酸钙菌落指示物，所以要求乳酸菌形成菌落时基不含有碳酸钙菌落指示物，所以要求乳酸菌形成菌落时必须向培养基中加入叠氮化钠和纺线菌铜。必须向培养基中加入叠氮化钠和纺线菌铜。有的是嗜盐耐高渗透压的乳酸菌，可在含有碳酸钙的有的是嗜盐耐高渗透压的乳酸菌，可在含有碳酸钙的GYPGYP培养基中加入培养基中加入7%-10%NaCl,7%-10%NaCl,并将并将PHPH调至调至8 8。这是因为一般好。这是因为一般好盐乳酸菌在较高盐乳酸菌在较高PHPH环境中呈现良好生长。环境中呈现良好生长。有的乳酸菌是需要生长因子吡哆素，吡哆醇，分离这些菌有的乳酸菌是需要生长因子吡哆素，吡哆醇，分离这些菌珠时添加番茄汁。将番茄汁稀释，代替加入培养基中的水，珠时添加番茄汁。将番茄汁稀释，代替加入培养基中的水，用稀释番茄汁制成的分离培养基用稀释番茄汁制成的分离培养基PHPH为为4 4。5-55-5。因此不能添。因此不能添加碳酸钙，而是加入叠氮化钠和纺线菌铜。加碳酸钙，而是加入叠氮化钠和纺线菌铜。有的乳酸菌的生长要求未知因子，不添加就不能生长，而有的乳酸菌的生长要求未知因子，不添加就不能生长，而且不知道所需的因子是什么物质，一般添加从分离源相同且不知道所需的因子是什么物质，一般添加从分离源相同材料所得的提取液来保证它的生长。材料所得的提取液来保证它的生长。（b）分离与乳酸相关的发酵物中的乳酸菌时通常采用的分离培养基P3512培养方法 对乳汁和乳制品可直接装入无菌带塞的三角瓶中，根据菌种特性，在不同温度下静止培养（集菌培养）。对于植物样品，先导碎，然后装入三角瓶中，用少量食盐水淹没，并实压赶走空气，以泡菜形式集菌培养。绝对的生长优势，从而抑制其他杂菌的生长。（c）鉴定 乳酸菌分类鉴定心形态和生理生化实验和化学分类方法进乳酸菌分类鉴定心形态和生理生化实验和化学分类方法进行。行。形态和生理生化实验包括：培养基、培养条件、生长形态和生理生化实验包括：培养基、培养条件、生长形态的观察、菌落形态的观察、革兰氏染色、细胞形态观察、形态的观察、菌落形态的观察、革兰氏染色、细胞形态观察、过氧化氢酶、硝酸盐还原、石蕊、牛乳、明胶液化、运动性、过氧化氢酶、硝酸盐还原、石蕊、牛乳、明胶液化、运动性、葡萄糖发酵、初始葡萄糖发酵、初始PHPH，生长温度、糖类发酵、从蔗糖生成葡，生长温度、糖类发酵、从蔗糖生成葡萄糖、发酵方式、从精氨酸生成胺、萄糖、发酵方式、从精氨酸生成胺、乳酸旋光性、耐盐性乳酸旋光性、耐盐性等。等。对于形态和生理生化实验不能确定的种，采用化学分类对于形态和生理生化实验不能确定的种，采用化学分类的方法，包括肽聚糖分析、（的方法，包括肽聚糖分析、（G+CG+C）%的测定、菌体脂肪酸分的测定、菌体脂肪酸分析、乳酸脱氢酶（析、乳酸脱氢酶（LDHLDH）电泳分析方法。工业生产一般采用）电泳分析方法。工业生产一般采用乳酸旋光性的测定来初步鉴定，其操作方式如下乳酸旋光性的测定来初步鉴定，其操作方式如下P352P352。3、米根霉乳酸产生菌的分离选育（1）分离样品 米根霉乳酸产生菌可以从菜园、果园、花盆的土壤中和各种谷物上分离。（2）培养基（a）斜面培养基PDA（b）分离培养基 茶氏培养基(c)纯化培养基Martin氏培养基（3）分离筛选六、六、乳酸生产原料乳酸生产原料（一（一 ）生产原料生产原料1 1 蔗糖蔗糖适合蔗糖发酵的菌种是德氏乳杆菌、赖氏乳杆菌。适合蔗糖发酵的菌种是德氏乳杆菌、赖氏乳杆菌。2 2 糖蜜糖蜜糖蜜中含有较多德糖蜜中含有较多德B B族维生素，尤其是生物素，含量在族维生素，尤其是生物素，含量在1g/L1g/L以上，以上，还含有总量为还含有总量为0.3%0.5%0.3%0.5%的氨基酸。氨基酸可与糖的分解物糖的氨基酸。氨基酸可与糖的分解物糖醛等形成类黑素有色物质，使成品呈深红色。醛等形成类黑素有色物质，使成品呈深红色。3 3 淀粉质原料淀粉质原料目前国内普遍采用乳酸生产的淀粉质原料常用的有大米、小麦、目前国内普遍采用乳酸生产的淀粉质原料常用的有大米、小麦、玉米、马铃薯、红薯、木薯等。采用淀粉质原料进行发酵大玉米、马铃薯、红薯、木薯等。采用淀粉质原料进行发酵大致有两种工致有两种工（1 1）将淀粉质原料粉碎，加酶液化、糖化，制得糖液后接入乳）将淀粉质原料粉碎，加酶液化、糖化，制得糖液后接入乳酸菌进行发酵，单行发酵工艺。酸菌进行发酵，单行发酵工艺。（2 2）将糖化酶和乳酸菌同时接入糊化液中，糖化和发酵是同时）将糖化酶和乳酸菌同时接入糊化液中，糖化和发酵是同时进行，称进行，称“并行并行”发酵工艺。发酵工艺。4 4 淀粉水解糖淀粉水解糖 目前工业生产中采用双酶法制得水解糖，即采用耐高温目前工业生产中采用双酶法制得水解糖，即采用耐高温的具有高活力的淀粉酶和糖化酶联合制得水解糖。由淀粉的具有高活力的淀粉酶和糖化酶联合制得水解糖。由淀粉制取水解糖成份较单纯，需要补加一些辅助原料以满足乳制取水解糖成份较单纯，需要补加一些辅助原料以满足乳酸菌的营养要求。酸菌的营养要求。5 5 芦栗汁芦栗汁 芦栗汁是芦栗的秸秆榨出的原汁，含有可发酵性的糖，芦栗汁是芦栗的秸秆榨出的原汁，含有可发酵性的糖，芦栗汁中含氮量很低，使用上可以配以巢菜汁以补充营养芦栗汁中含氮量很低，使用上可以配以巢菜汁以补充营养6 6 造纸工业废料造纸工业废料 亚硫酸盐纸浆废液是造纸工业的副产品，采用木材造纸亚硫酸盐纸浆废液是造纸工业的副产品，采用木材造纸的废液中含糖的废液中含糖20-30 g/L 20-30 g/L。（二（二 ）辅助原料原料 乳酸菌缺乏合成某些氨基酸，维生素的能力，乳酸菌缺乏合成某些氨基酸，维生素的能力，故在合成培养基上不容易生产。除了需要碳源外，故在合成培养基上不容易生产。除了需要碳源外，还需要氮源、部分氨基酸和一些维生素生长促进因还需要氮源、部分氨基酸和一些维生素生长促进因子和微量元素。例如：德氏乳杆菌需要精氨酸、半子和微量元素。例如：德氏乳杆菌需要精氨酸、半胱氨酸、固氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等外，并需要胱氨酸、固氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等外，并需要维生素维生素B2B2、烟酸、叶酸等维生素，还需要钠、钾、烟酸、叶酸等维生素，还需要钠、钾、铜、铁、镁、磷等。工业生长上采取添加含由所需铜、铁、镁、磷等。工业生长上采取添加含由所需要营养成分的天然廉价辅助原料如，麸皮、米糠、要营养成分的天然廉价辅助原料如，麸皮、米糠、玉米浆、毛发水解物、酵母自溶物等辅助原料。玉米浆、毛发水解物、酵母自溶物等辅助原料。七、发酵操作技术七、发酵操作技术1、水解糖发酵技术、水解糖发酵技术 培养基无需灭菌，直接接入种子液，接种量为培养基无需灭菌，直接接入种子液，接种量为5-10%，发酵，发酵温度控制在温度控制在50。如果采用分批添加碳酸钙的工艺，应注意。如果采用分批添加碳酸钙的工艺，应注意不要不要pH降低到降低到5以下，否则会影响发酵速度。发酵控制在以下，否则会影响发酵速度。发酵控制在50，以远远高于一般微生物的生长发育温度，所以一般不，以远远高于一般微生物的生长发育温度，所以一般不会发生污染，发酵罐口敞开，以利于二氧化碳自由溢出。当会发生污染，发酵罐口敞开，以利于二氧化碳自由溢出。当残糖浓度降至残糖浓度降至1 g/L 时，发酵完成。发酵快结束时，乳酸菌活时，发酵完成。发酵快结束时，乳酸菌活力降低，发酵液的温度开始下降，发酵液带有一定粘性，有力降低，发酵液的温度开始下降，发酵液带有一定粘性，有时病酸菌可能开始活动，从而影响产品的纯度。因此应及时时病酸菌可能开始活动，从而影响产品的纯度。因此应及时加入石灰乳，将加入石灰乳，将pH提高到提高到10左右，同时升高温度左右，同时升高温度90，使菌，使菌体和其他悬浮物下沉，澄清后将上清液和沉淀物分别放出，体和其他悬浮物下沉，澄清后将上清液和沉淀物分别放出，进入提取工艺。进入提取工艺。2 2、蔗糖和糖蜜发酵、蔗糖和糖蜜发酵 加入加入2/3工作容积的自来水至发酵罐，再流入糖蜜升温至工作容积的自来水至发酵罐，再流入糖蜜升温至70，同时加入甘蔗粗糖，溶解后加入碳酸钙。培养基中各成，同时加入甘蔗粗糖，溶解后加入碳酸钙。培养基中各成分浓度为：总糖分浓度为：总糖6g/dL(以蔗糖计，其中糖蜜约提供以蔗糖计，其中糖蜜约提供36g/dL；蔗；蔗糖约提供糖约提供36g/dL)，碳酸钙，碳酸钙126g/dL。70维持维持20min后冷却后冷却至至50，加入麦根，加入麦根1.8g/dL,接入接入20%的种子培养物，的种子培养物，或其他发或其他发酵罐中发酵旺盛的发酵液进行发酵，因接种量大，延迟期很短，酵罐中发酵旺盛的发酵液进行发酵，因接种量大，延迟期很短，可以迅速进入旺盛发酵期。可以迅速进入旺盛发酵期。接种发酵接种发酵6h扣定期间歇通空气鼓泡搅拌。发酵过程中流加蔗扣定期间歇通空气鼓泡搅拌。发酵过程中流加蔗糖液和补充碳酸钙粉浆，补充量依糖液和补充碳酸钙粉浆，补充量依PH情况而定，使情况而定，使PH维持在维持在5以上，当糖浓度降至以上，当糖浓度降至3g/dL时流加时流加50%的浓粗糖溶液，维持发的浓粗糖溶液，维持发酵培养基中糖浓度为酵培养基中糖浓度为34g/dL水平。水平。3 3、大米原料发酵、大米原料发酵 大米粉碎，在糊化罐内放一定时量的底水，开支搅拌，将大米粉碎，在糊化罐内放一定时量的底水，开支搅拌，将大米粉于米糠按大米粉于米糠按10：1的比例送入罐内，按淀粉计加入的比例送入罐内，按淀粉计加入510u/g耐高温淀粉酶。加水调成米：糠：水耐高温淀粉酶。加水调成米：糠：水=10:1:12.5,搅拌均搅拌均匀，通往蒸汽，持有异议空气，温度匀，通往蒸汽，持有异议空气，温度120，维持，维持1520min.糊糊化结束后冷却至化结束后冷却至60以下，放入发酵罐中。发酵罐中先放入以下，放入发酵罐中。发酵罐中先放入一定量的底水，水温一定量的底水，水温50-55，放入糊化液并加水至规定容量。，放入糊化液并加水至规定容量。发酵培养基总糖浓度为发酵培养基总糖浓度为10g/dL左右，往发酵罐通往压缩空气，左右，往发酵罐通往压缩空气，使发酵培养基混合均匀，同时加入乳酸调酸使发酵培养基混合均匀，同时加入乳酸调酸PH至至4.85。温度。温度在在50，按淀粉计加入糖化酶，按淀粉计加入糖化酶120U/g,再再10接入接入%合格的种子。合格的种子。由于乳酸细菌不能耐很高的酸度，因此在发酵过由于乳酸细菌不能耐很高的酸度，因此在发酵过程中不能程中不能pHpH降至降至4 4以下，发酵后约以下，发酵后约6h6h就开始加碳酸钙就开始加碳酸钙进行中和，必须压缩进行均匀。发酵过程中温度维进行中和，必须压缩进行均匀。发酵过程中温度维持在持在5050，每隔，每隔2h2h测测PHPH。当残糖降至。当残糖降至0.1g/dL0.1g/dL以下叶，以下叶，表明发酵已经结束。表明发酵已经结束。4 4、薯干粉原料发酵、薯干粉原料发酵 将薯干粉在糖化罐中调浆，将薯干粉在糖化罐中调浆，其比例为薯干粉：麸其比例为薯干粉：麸皮：水皮：水1 1：0.050.05：1010，其总糖浓度为，其总糖浓度为78g/dL.78g/dL.加入加入液化至常规典法试验达到合格，再升温至液化至常规典法试验达到合格，再升温至100100灭菌灭菌灭酶灭酶20min20min。将加入糖化酶将加入糖化酶100u/g100u/g。同时接入乳酸菌种子。同时接入乳酸菌种子10%10%，勇气搅拌均匀。再，勇气搅拌均匀。再50-5250-52温度下发酵。再发酵温度下发酵。再发酵过程中分批加入碳酸钙中和，维持过程中分批加入碳酸钙中和，维持PHPH在在5 5左右，当残左右，当残糖降至糖降至0.1g/dL0.1g/dL以下时，表明发酵已经结束。以下时，表明发酵已经结束。5 5、玉米原料发酵、玉米原料发酵 经高压喷射液化及糖化所得的糖化液，泵入板筐压虑机过经高压喷射液化及糖化所得的糖化液，泵入板筐压虑机过滤，清液打入发酵罐，调整糖度为滤，清液打入发酵罐，调整糖度为810g/dL,810g/dL,添加玉米量的添加玉米量的10%10%的麦盆腔或米糠，冷却降至的麦盆腔或米糠，冷却降至5050，接入，接入10%10%种子液，进行种子液，进行发酵。将脱脂乳发酵。将脱脂乳10%10%加自来水加自来水9090于于100100灭菌灭菌30min,30min,冷却，冷却，接入保加利亚乳杆菌，维持温度接入保加利亚乳杆菌，维持温度4444，培养，培养1824H1824H，制成，制成接种物。接种物。加乳清至发酵罐至操作液位，同时升温，使之达到发酵温加乳清至发酵罐至操作液位，同时升温，使之达到发酵温度度43-4443-44。接入上述制成的乳酸世界各地的同间歇开动搅。接入上述制成的乳酸世界各地的同间歇开动搅拌，于拌，于43-4543-45进行发酵。进行发酵。八、乳酸发酵生产新技术八、乳酸发酵生产新技术1 1、固定化细胞和固定化酶技术、固定化细胞和固定化酶技术（1 1）海藻酸钙包埋法）海藻酸钙包埋法（2 2）中空纤维固定法）中空纤维固定法2 2、原位产物分离（、原位产物分离（ISPRISPR）发酵）发酵 原位产物是指将细胞的代谢产物快速移动的方法，它和发酵原位产物是指将细胞的代谢产物快速移动的方法，它和发酵有面结合（耦合）则为原位产物分离发酵。有面结合（耦合）则为原位产物分离发酵。连续发酵生产效率高于分批发酵，以代谢产物作为目的分批发酵，连续发酵生产效率高于分批发酵，以代谢产物作为目的分批发酵，几乎都受到最终产物的抑制，因此在分批发酵罐中维持长时间、几乎都受到最终产物的抑制，因此在分批发酵罐中维持长时间、高速度生产是不可能的，如：乳酸发酵是高速度生产是不可能的，如：乳酸发酵是pH为为5左右，小于左右，小于5时时发酵则被抑制，乳酸产率仅为发酵则被抑制，乳酸产率仅为1.6%左右，为提高乳酸产率，必须左右，为提高乳酸产率，必须减轻发酵产物的抑制，传统的发酵是通过添加碳酸钙中和乳酸，减轻发酵产物的抑制，传统的发酵是通过添加碳酸钙中和乳酸，维持最适维持最适pH。但是乳酸钙使萃取过程复杂，乳酸盐对细胞代谢。但是乳酸钙使萃取过程复杂，乳酸盐对细胞代谢也有一定的抑制作用。为了降低抑制，在发酵过程耦合溶剂萃取也有一定的抑制作用。为了降低抑制，在发酵过程耦合溶剂萃取（油酸叔胺等萃取溶剂）、吸附（离子交换树枝、活性碳、高分（油酸叔胺等萃取溶剂）、吸附（离子交换树枝、活性碳、高分子树脂曾等）、膜（渗析膜、电渗析膜、中空纤维膜）等分离操子树脂曾等）、膜（渗析膜、电渗析膜、中空纤维膜）等分离操作系统，形成原位产物分离发酵技术。作系统，形成原位产物分离发酵技术。九、发酵控制九、发酵控制1 1、营养物质的控制、营养物质的控制 乳酸细菌大多数缺乏合成代谢途径，他们的生乳酸细菌大多数缺乏合成代谢途径，他们的生长和发酵都需要复杂的外源营养物，如氨基酸，维长和发酵都需要复杂的外源营养物，如氨基酸，维生素核酸等，具体所需营养万分因菌种和菌株不同生素核酸等，具体所需营养万分因菌种和菌株不同而异。而异。2 2、杂菌污染的控制、杂菌污染的控制 控制乳酸细菌的乳酸发酵温度控制乳酸细菌的乳酸发酵温度5050左右，一般杂菌难以生存，左右，一般杂菌难以生存，而使乳酸发酵安全进行。但乳酸发酵兼性发酵，发酵罐是敞下而使乳酸发酵安全进行。但乳酸发酵兼性发酵，发酵罐是敞下或半密封的，或半密封的，发酵过程中需要分批添加碳酸并通气搅拌，难免发酵过程中需要分批添加碳酸并通气搅拌，难免混入大量杂菌。使乳酸的产量下降，工业上常常采用以下措施混入大量杂菌。使乳酸的产量下降，工业上常常采用以下措施工：工：（1 1）加强发酵罐的清洁与灭菌，投料彰先检查罐内情况，清除杂）加强发酵罐的清洁与灭菌，投料彰先检查罐内情况，清除杂物后，用高锰酸钾物后，用高锰酸钾+甲醛蒸，灭菌甲醛蒸，灭菌2h2h，再用清水冲洗干净。活用，再用清水冲洗干净。活用蒸汽灭菌。蒸汽灭菌。（2 2）严格控制发酵，每个菌种的最适发酵温度是特定的，）严格控制发酵，每个菌种的最适发酵温度是特定的，必须必须控制好该菌的秘本，以保证该菌的正常发酵而抑制其他杂菌的控制好该菌的秘本，以保证该菌的正常发酵而抑制其他杂菌的生长。生长。（3 3）加大接种量。在发酵时加大接种量以使生产菌株生长，占据）加大接种量。在发酵时加大接种量以使生产菌株生长，占据绝对优势，从而抑制其它杂菌生长。绝对优势，从而抑制其它杂菌生长。第三节第三节 乳酸提取和精制工艺乳酸提取和精制工艺1 1、发酵液的预处理、发酵液的预处理 乳酸菌一般不耐酸，乳酸菌一般不耐酸，通常乳酸发酵是在过剩碳酸钙存在的通常乳酸发酵是在过剩碳酸钙存在的条件下进行，和碳酸钙反应，生成条件下进行，和碳酸钙反应，生成5 5个结晶水的乳酸钙，由于杂个结晶水的乳酸钙，由于杂质的存在终了时，发酵醪为难粘稠。尤其当初糖浓度高时，质的存在终了时，发酵醪为难粘稠。尤其当初糖浓度高时，甚甚至使整年发酵醪固化，给后续的操作带来困难。因此，当乳酸至使整年发酵醪固化，给后续的操作带来困难。因此，当乳酸菌活动减弱，发酵醪温度开始下降时，及时升高温度菌活动减弱，发酵醪温度开始下降时，及时升高温度90-10090-100并同时加入石灰乳，将并同时加入石灰乳，将PHPH调至调至9.5-109.5-10，搅拌均匀，静止，搅拌均匀，静止4-6H,4-6H,使使菌体等悬浮物下沉，为了避免乳酸钙的结晶析出，澄清过程中菌体等悬浮物下沉，为了避免乳酸钙的结晶析出，澄清过程中需要保温在需要保温在5555。l 在上述沉渣部分加入等量的硫酸钙作助虑剂，在在上述沉渣部分加入等量的硫酸钙作助虑剂，在70-8070-80温温度下经过板筐过滤机压虑，将上述清液混合，加入度下经过板筐过滤机压虑，将上述清液混合，加入1.5%-2%1.5%-2%的活的活性炭于性炭于60-7060-70进行脱色。进行脱色。2 乳酸提取 （1）工艺流程（2 2）浓缩）浓缩 将乳酸钙溶解浓缩到过饱和，使结晶析出。将将乳酸钙溶解浓缩到过饱和，使结晶析出。将沉降罐中的上清液打入双效蒸发罐，剩余的含有沉沉降罐中的上清液打入双效蒸发罐，剩余的含有沉降物的料液返回降物的料液返回 板筐过滤机过滤。浓缩采用减压板筐过滤机过滤。浓缩采用减压蒸发浓缩，温度控制丰蒸发浓缩，温度控制丰7070左右。当浓缩至乳酸钙左右。当浓缩至乳酸钙含量达含量达26%-28%26%-28%时，在常温下可自然形成结晶。时，在常温下可自然形成结晶。（3 3）结晶）结晶 趁热将上述浓缩液打入结晶罐中冷却结晶。结趁热将上述浓缩液打入结晶罐中冷却结晶。结果起始温度控制在果起始温度控制在3030，用，用1h1h将乳酸钙溶液从将乳酸钙溶液从3030降至降至2323，再用，再用1.5h1.5h使之降至使之降至1818，当达到这个温，当达到这个温度时，度时，开始有大量结晶体析出，开始有大量结晶体析出，此后冷却速度控此后冷却速度控制在每制在每1h1h降降22，达到最终温度，达到最终温度1010，保持，保持3-5H3-5H。为了缩短结晶时间，可在结晶前即用为了缩短结晶时间，可在结晶前即用3030时投入时投入6%-7%6%-7%的晶种。的晶种。（4 4）洗晶）洗晶 将珊瑚状的结晶块通过搅碎成小颗粒状结晶，搅将珊瑚状的结晶块通过搅碎成小颗粒状结晶，搅碎机的速度不能过高，避免将乳酸钙结晶打成碎状。碎机的速度不能过高，避免将乳酸钙结晶打成碎状。将打碎的乳酸钙结晶装入离心机，甩出母液，在在将打碎的乳酸钙结晶装入离心机，甩出母液，在在离心机开动的情况下，用水洗涤结晶是，使水迅速离心机开动的情况下，用水洗涤结晶是，使水迅速穿过结晶层，既可洗净结晶表面的母液杂质，又可穿过结晶层，既可洗净结晶表面的母液杂质，又可避免洗水与结晶长时间接触，使晶体溶解。避免洗水与结晶长时间接触，使晶体溶解。（5 5）溶晶）溶晶 将洗净过后的乳酸钙结晶打入溶解槽，通入蒸汽，使之溶将洗净过后的乳酸钙结晶打入溶解槽，通入蒸汽，使之溶解。解。（6 6）酸解）酸解 将上述溶晶的溶液打入酸解槽，添加将上述溶晶的溶液打入酸解槽，添加50%50%浓硫酸进行酸浓硫酸进行酸解，酸解时产生大量的热量，但不能使料温超过解，酸解时产生大量的热量，但不能使料温超过8080，以，以防乳酸钙分解。用防乳酸钙分解。用0.1%0.1%甲基紫溶液检验，酸解适当时呈菊甲基紫溶液检验，酸解适当时呈菊黄色，硫酸过量时呈绿色，乳酸钙过量时呈紫色，中和完黄色，硫酸过量时呈绿色，乳酸钙过量时呈紫色，中和完全后静止全后静止1-2h1-2h使硫酸钙充分析出。使硫酸钙充分析出。（7 7）过滤过滤 石膏渣经过板筐过滤机过滤或减压抽虑，石膏渣经过板筐过滤机过滤或减压抽虑，使之使之与乳酸分离与乳酸分离（8 8）脱色）脱色加入加入0.5%-3%0.5%-3%粉状活性炭脱色，粉状活性炭脱色，在在70-8070-80脱色脱色30min30min，过滤出去活性炭。，过滤出去活性炭。2 2、一步法提取工艺、一步法提取工艺预处理的过滤澄清液预处理的过滤澄清液-双效蒸发浓缩双效蒸发浓缩-酸解酸解-真空抽虑真空抽虑-粗乳酸粗乳酸3 3、乳酸提取新工艺、乳酸提取新工艺（1 1）乳酸锌结晶工艺）乳酸锌结晶工艺 由于乳酸钙结晶损失较大，且乳酸钙结晶颗粒较小，结由于乳酸钙结晶损失较大，且乳酸钙结晶颗粒较小，结晶过程中不容易控制，容易包埋母液甚至形成固化现象，晶过程中不容易控制，容易包埋母液甚至形成固化现象，给后续纯化带来困难。因此可以用乳酸盐中更容易结晶的给后续纯化带来困难。因此可以用乳酸盐中更容易结晶的锌和镁盐。乳酸锌呈片状结晶，得纯化。锌盐法提取是在锌和镁盐。乳酸锌呈片状结晶，得纯化。锌盐法提取是在发酵液中（粗乳酸钙溶液中）加入计算量的硫酸锌，发酵液中（粗乳酸钙溶液中）加入计算量的硫酸锌，维持维持8080心目反应。生成乳酸锌和硫酸钙，趁热过滤除去石膏，心目反应。生成乳酸锌和硫酸钙，趁热过滤除去石膏，然后冷却结晶。乳酸晶体经过熔化、脱色后通入硫化氢置然后冷却结晶。乳酸晶体经过熔化、脱色后通入硫化氢置换乳酸。生成硫化锌沉淀可以加硫酸再生呈硫化氢和硫酸换乳酸。生成硫化锌沉淀可以加硫酸再生呈硫化氢和硫酸锌。锌。（2 2）溶剂萃取法提取乳酸）溶剂萃取法提取乳酸（3 3）离子交换法提取乳酸）离子交换法提取乳酸（4 4）电渗析提取法）电渗析提取法2 乳酸提取 （1）工艺流程葡萄糖葡萄糖2ATP 2ADPLactococcus lactisLactobacillus plantarum磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮 异型乳酸发酵异型乳酸发酵 肠膜明串株菌（肠膜明串株菌（LeuconostocLeuconostoc mesenteroidesmesenteroides）磷酸戊糖途径（磷酸戊糖途径（HMP HMP）进行）进行异型乳酸发酵异型乳酸发酵 1 1葡萄糖葡萄糖 1 1乳酸乳酸+1+1乙醇乙醇+1ATP+1ATP 不同微生物异型乳酸发酵产物有些不同不同微生物异型乳酸发酵产物有些不同 异型乳酸发酵的途径异型乳酸发酵的途径异型乳酸发酵：异型乳酸发酵：葡萄糖葡萄糖6-磷酸磷酸葡萄糖葡萄糖6-磷酸葡磷酸葡萄糖酸萄糖酸5-磷酸磷酸木酮糖木酮糖3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛乳酸乳酸乙酰磷酸乙酰磷酸NAD+NADHNAD+NADHATP ADP乙醇乙醇 乙醛乙醛 乙酰乙酰CoA2ADP 2ATP-2H-CO2类型类型途径途径产物产物产能葡萄糖产能葡萄糖菌种代表同型同型EMP乳酸乳酸2ATPLactobacillus debruckii异型HMP1乳酸1乙醇1CO21ATPLeuconostoc mesenteroidesl米根霉发酵机制米根霉发酵机制l米根霉能产生淀粉酶和糖化酶，它能利用米根霉能产生淀粉酶和糖化酶，它能利用糖，也可以利用淀粉或淀粉质原料直接发糖，也可以利用淀粉或淀粉质原料直接发酵生成酵生成L-L-乳酸，但同时伴随着产生乙醇、乳酸，但同时伴随着产生乙醇、富马酸、琥珀酸、苹果酸等其他产物。富马酸、琥珀酸、苹果酸等其他产物。l米根霉在好气或厌氧发酵条件下由葡萄糖米根霉在好气或厌氧发酵条件下由葡萄糖生成生成L-L-乳酸和乙醇，其发酵机制如下：乳酸和乙醇，其发酵机制如下：