愈伤组织的培养

植物组织培养学Plant tissue culture2017年春学期阜阳师范学院生物与食品工程学院QQ群110953973第三第三章章 愈伤组织培养愈伤组织培养第3章 愈伤组织培养本章主要内容：本章主要内容：v愈伤组织的诱导与分化愈伤组织的诱导与分化v愈伤组织的继代培养愈伤组织的继代培养v愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生 不定芽和根的发生不定芽和根的发生 体细胞胚的发生体细胞胚的发生v愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用1、了解愈伤组织细胞分化的各时期的特点、了解愈伤组织细胞分化的各时期的特点2、掌握植物激素控制理论、掌握植物激素控制理论3、掌握愈伤组织的形态发生、掌握愈伤组织的形态发生4、区别胚状体发生途径与器官发生途径形成植、区别胚状体发生途径与器官发生途径形成植株株5、愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用、愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用本章教学目的与要求本章教学目的与要求定义定义:是指将外植体接种到人工培养基是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。生长和分化的培养过程。愈伤组织培养愈伤组织培养(callus culture)第一节 愈伤组织的诱导和分化 一一 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导诱导愈伤组织的关键主要是诱导愈伤组织的关键主要是培养条件培养条件，其中，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。激素的成分和浓度是最重要的因素。Callus arising from leaf tissueCallus arising from vascular tissue From rootFrom embryo culturePhoto indicating where the callus(c)arises from Wound callus on the stemof an Erythrina tree 刺桐树第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化二愈伤组织的分化从从外外植植体体脱脱分分化化形形成成典典型型的的愈愈伤伤组组织织大大致致可分为三个时期：可分为三个时期：愈伤组织分化愈伤组织分化诱导期诱导期分裂期分裂期分化期分化期Stage 1.Induction（诱导期）（诱导期）:细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成起点。细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成起点。诱导期细胞内发生的变化气体交换增加，如氧气的吸收增加气体交换增加，如氧气的吸收增加RNA含量增加（增加到含量增加（增加到300%）蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%）酶活性增强酶活性增强Stage 2.Cell division 分裂期 指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。增生子细胞的过程。1.1.细胞的细胞的数目迅速增加数目迅速增加。2.2.每个细胞每个细胞平均鲜重下降平均鲜重下降。3.3.细胞体积小，内无液泡细胞体积小，内无液泡。4 4细胞的核和核仁增大到最大。细胞的核和核仁增大到最大。5.5.细胞中细胞中RNARNA含量减少，而含量减少，而DNADNA含量保持不变含量保持不变。6.6.随随着着细细胞胞不不断断分分裂裂和和生生长长，细细胞胞总总干干重重、蛋蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。分裂期细胞的主要表现分裂期细胞的主要表现:细细胞胞分分裂裂快快，结结构构疏疏松松，缺缺少少有有组组织织的的结结构构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。维持其不分化的状态，颜色浅而透明。1mg/l 2,4-D10mg/l 2,4-D分裂期愈伤组织的共同特征：分裂期愈伤组织的共同特征：Stage 3.Differentiation 分化期 指愈伤组织细胞停止分裂，细指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形态和生理上的胞内发生一系列形态和生理上的变化变化,形成一些不同形态和功能的形成一些不同形态和功能的细胞的时期。细胞的时期。第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化A A 细胞分裂部位和方向发生改变细胞分裂部位和方向发生改变：B B 形成瘤状或片状形成瘤状或片状的的分生组织结节分生组织结节。或。或维管组织结节。维管组织结节。C C 细胞的体积相对稳定，不再减少。细胞的体积相对稳定，不再减少。D D 出出现现了了各各种种类类型型的的细细胞胞：如如管管胞胞、纤纤维维细细胞胞、薄薄壁壁细细胞胞、分生细胞、色素细胞分生细胞、色素细胞等。等。E E 生生长长旺旺盛盛的的愈愈伤伤组组织织呈呈乳乳白白色色、白白色色或或浅浅绿绿色色，老老化化的的多转化为黄色或褐色多转化为黄色或褐色。第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化分化期细胞特点：分化期细胞特点：Callus types：Friable易碎易碎 Hard/lignified callus Rhizogenic callus生根的愈伤生根的愈伤 Callus exuding sticky poly-saccharides渗出粘性多糖的愈伤渗出粘性多糖的愈伤 根据愈伤质地划分为：根据愈伤质地划分为：第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化Callus may have a yellow,white,green or red(anthocyanin 花青苷)appearance.不同颜色的愈伤不同颜色的愈伤第二节 愈伤组织的继代培养1 1、定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，、定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这这个过程叫做个过程叫做继代培养继代培养。2、愈伤组织培养的调控因素：外植体外植体培养基培养基培养环境培养环境第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养（一）材料本身第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养年龄年龄器官和部位器官和部位遗传型遗传型外植体外植体 1 1无机营养无机营养 培培养养基基中中的的N N，大大多多数数都都用用硝硝态态氮氮，对对细胞分化起重要作用。细胞分化起重要作用。2 2植物生长调节物质植物生长调节物质一般使用的浓度为一般使用的浓度为0.1-10mg0.1-10mgL L。使使用用植植物物生生长长调调节节剂剂时时，要要注注意意种种类类和和浓浓度度，特别是生长素和细胞分裂素的比值。特别是生长素和细胞分裂素的比值。第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养（二）培养基（二）培养基器官分化的植物激素控制理论(激素配比模式)生生长长素素与与细细胞胞分分裂裂素素的的比比值值是是根根和和芽芽形形成成的的控控制制条条件件，决决定定着着发发育育的的方方向向:是是愈愈伤伤组织、长根还是长芽。组织、长根还是长芽。高高 利于根的形成利于根的形成生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素 适中适中 利于愈伤组织的形成利于愈伤组织的形成 低低 利于芽的形成利于芽的形成第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养愈伤组织分化愈伤组织分化第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养培培养养基基中中加加入入糖糖、各各类类B B族族维维生生素素、肌肌醇醇和和甘甘氨氨酸等，可满足愈伤组织生长和分化的要求。酸等，可满足愈伤组织生长和分化的要求。各各种种氨氨基基酸酸和和嘌嘌呤呤、嘧嘧啶啶类类物物质质，可可促促进进器器官官分化。分化。水解酪蛋白中含有多种氨基酸，助于器官分化水解酪蛋白中含有多种氨基酸，助于器官分化酰胺类往往有促进器官形成的作用。酰胺类往往有促进器官形成的作用。第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养3有机成分有机成分第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养4.培养方式：培养方式：固体培养固体培养液体培养液体培养（三）培养条件第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养光照光照温度温度24-28光强、光照时间、光质光强、光照时间、光质第三节 愈伤组织的形态发生形态建成形态建成：外植体细胞在适宜的培养条件下发：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。状体，发育成苗或完整植株。魔芋胚状体魔芋胚状体小麦愈伤组织小麦愈伤组织第第2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养愈伤组织的形态发生方式:不定芽方式不定芽方式胚状体方式胚状体方式第三节愈伤组织的形态发生第三节愈伤组织的形态发生外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽芽根根再生植株再生植株脱分化脱分化再分化再分化高生长素高生长素(1,2-D)高高(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)低低(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)一、不定芽方式（一、不定芽方式（adventitious bud）第三节愈伤组织的形态发生第三节愈伤组织的形态发生愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：（1）愈愈伤伤组组织织仅仅有有根根或或芽芽器器官官的的分分别别形形成成，即即无根的芽或无芽的根；无根的芽或无芽的根；（2）先长芽，后长根，多数情况；）先长芽，后长根，多数情况；（3）先先长长根根，再再从从根根的的基基部部长长芽芽。这这种种情情况况较较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（4）先先在在愈愈伤伤组组织织的的邻邻近近不不同同部部位位分分别别形形成成芽芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。和根，然后两者结合起来形成一株植株。第三节愈伤组织的形态发生第三节愈伤组织的形态发生愈伤组织愈伤组织芽分化芽分化再生苗再生苗第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生小麦的形态发生小麦的形态发生试管苗试管苗胚状体胚状体（embryoid）：）：指在组织培指在组织培养中，由一个非合子细胞养中，由一个非合子细胞(体细胞体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚和子叶胚5 5个时期），形成具有双个时期），形成具有双极性的胚状结构。极性的胚状结构。第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生二、胚状体方式（二、胚状体方式（somatic embryo）注意：体细胞胚1、不同于合子胚不同于合子胚2、不同于孤雌不同于孤雌/雄胚雄胚3、不同于器官发生方式形成的幼苗不同于器官发生方式形成的幼苗第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生胚状体与合子胚的比较:合子胚合子胚胚状体胚状体质量质量萌发率高，质量好萌发率高，质量好 萌发率低，质量差萌发率低，质量差来源来源受精卵受精卵体细胞体细胞胚柄胚柄有，明显有，明显即使有也不明显即使有也不明显形态形态固定，体积相对较固定，体积相对较小小复杂，常有两个以上的复杂，常有两个以上的子叶，体积较大子叶，体积较大变异率变异率 低低高高第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生由外植体经胚状体形成完整植株的过程：由外植体经胚状体形成完整植株的过程：外植体外植体脱脱分分化化愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体再生植株再生植株第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别:胚状体胚状体具有两极性具有两极性，即有茎端和根端。，即有茎端和根端。胚状体的胚状体的维管组织与外植体的维管组维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系织无解剖结构上的联系。胚状体胚状体维管组织的分布是独立的维管组织的分布是独立的“Y Y”字形字形。第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生体细胞胚发生与器官发生第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生胚状体方式比不定芽方式有更多的优点：胚状体产生的数量比不定芽多；胚状体产生的数量比不定芽多；胚状体可以制成人工种子，便于运输和胚状体可以制成人工种子，便于运输和保保存存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生第四节 愈伤组织培养的应用1 1、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度；、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度；2 2、培育无病毒苗木；、培育无病毒苗木；3 3、获得倍性不同的植株；、获得倍性不同的植株；4 4、克服远缘杂交困难；、克服远缘杂交困难；5 5、利于种质资源长期保存和远距离运输；、利于种质资源长期保存和远距离运输；6 6、提供育种中间材料；、提供育种中间材料；7 7、诱发和离体筛选突变体；、诱发和离体筛选突变体；8 8、制造人工种子。、制造人工种子。第四节第四节 愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用本章小结：本章小结：1、愈伤组织培养含义、愈伤组织培养含义2、愈伤组织形成分三个时期：诱导期、分裂期、分化期。、愈伤组织形成分三个时期：诱导期、分裂期、分化期。3、诱导期、分裂期、分化期细胞的特点、诱导期、分裂期、分化期细胞的特点4、分裂期愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组、分裂期愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。5、继代培养的含义。、继代培养的含义。6、培养方式分为固体和液体培养两大类。、培养方式分为固体和液体培养两大类。7、形态建成含义、形态建成含义。8、器官发生形成小苗的方式、器官发生形成小苗的方式。9、胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别、胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别 第第3章章 愈伤组织培养愈伤组织培养附：附：第五节第五节 组织培养成苗组织培养成苗 指把外植体放在培养室（有光照、温度条件）里，成再生植株的过程。外植体：1、带芽外植体 2、由分化组织构成的外植体 1.1.初代培养初代培养2.2.继代培养继代培养3.3.生根培养生根培养培培养养步步骤骤培养步骤第一种类型：芽再生型微型扦插增值法；丛生芽增值顶芽顶芽腋芽腋芽丛生芽的发育1 桑树茎尖萌发桑树茎尖萌发 杨树顶芽萌发成丛生芽杨树顶芽萌发成丛生芽 月季茎段侧芽萌发（引自谭文澄、戴策刚，1991）丛生芽微繁示意图（引自刘进平，2005）解除顶端优势的抑制作用接种培养：接种培养：MS+BA0.25+NAA0.25MS+BA0.25+NAA0.25White+IAA0.1White+IAA0.122222525，161618h,3000lx18h,3000lx2 23 3个月分化出芽丛个月分化出芽丛草莓脱毒苗组培草莓脱毒苗组培微茎尖培养微茎尖培养（1 1）初代培养）初代培养芽丛芽丛芽丛小块芽丛小块继代培养基（继代培养基（MS+BA0.5+NAA0.3)MS+BA0.5+NAA0.3)芽长芽长1-2单株单株2 2继继代代培培养养 3.3.生根培养生根培养1/2MS+NAA11/2MS+NAA1（IBA1IBA1）第二种类型：器官发生型不定芽的发育不定芽的发育不不定定芽芽的的发发育育外植体：叶片、子房、花药、胚珠、叶柄外植体：叶片、子房、花药、胚珠、叶柄再分化再分化1、如何脱分化？、如何脱分化？2、再分化的类型？、再分化的类型？叶再生植株发生叶再生植株发生1、制备外植体：、制备外植体：幼嫩叶片幼嫩叶片-水洗水洗-消毒消毒-无菌水洗。无菌水洗。叶片的切割方式 极性：叶片极性：叶片腹面向上腹面向上放置利于芽的分化放置利于芽的分化2、影响培养因素：、影响培养因素：1）6-BA和和KT利于利于芽芽的形成；的形成；2,4-D利于利于愈伤组织愈伤组织形成。形成。2）损伤：常从叶柄、叶脉的切口处形成愈伤组织和芽。）损伤：常从叶柄、叶脉的切口处形成愈伤组织和芽。1 1、离体叶、离体叶 愈伤组织愈伤组织 不定芽不定芽2 2、离体叶芽、离体叶芽 愈伤组织愈伤组织 胚状体胚状体 不定芽不定芽3 3、离体叶、离体叶 小鳞茎或球状体小鳞茎或球状体 愈伤组织愈伤组织 百合鳞叶培养百合鳞叶培养驱蚊草叶片驱蚊草叶片培养培养番茄子叶培养番茄子叶培养烟草叶片培养烟草叶片培养石龙芮下胚轴培养石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程产生胚状体过程第三种类型：胚状体发生型胚状体发生型体体细细胞胞胚胚状状体体的的发发育育1外外 植植 体体愈伤组织愈伤组织小孢子小孢子游离单细胞游离单细胞器官器官胚胚 状状 体体试试 管管 苗苗继代培养初代培养种子种子第四种类型：原球茎型原球茎型缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。原原球球茎茎的的发发育育茎尖茎尖腋芽腋芽生根培养将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。月季组织培养诱导MS+BA0.5增值 MS+BA1+NAA0.2生根 1/2MS+NAA0.5附：第六节附：第六节 愈伤组织培养举例愈伤组织培养举例主要内容主要内容:材料的制备材料的制备愈伤诱导与分化愈伤诱导与分化形态发生形态发生愈伤的培养愈伤的培养第第六六节节 例例1 1 植物材料（外植体）的制备植物材料（外植体）的制备1.一般植物组织都能诱发愈伤组织。一般植物组织都能诱发愈伤组织。诱导愈伤组织的诱导愈伤组织的成败关键成败关键主要不是实验材料，而是主要不是实验材料，而是培养培养条条件，其中件，其中激素激素的成分和浓度是最重要的因素。的成分和浓度是最重要的因素。双子叶植物为最多，单子叶植物双子叶植物为最多，单子叶植物(1990s)，此外，裸子植，此外，裸子植物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。2.2.材料必须完全无菌材料必须完全无菌微生物微生物一旦与培养基接触，就迅速繁殖，一旦与培养基接触，就迅速繁殖，抑制抑制愈伤组织的生长。愈伤组织的生长。用用抗菌素抗菌素来抑制微生物的生长，在来抑制微生物的生长，在短时间短时间有效，有效，而且抗菌素只能对而且抗菌素只能对一定谱系一定谱系中的细菌才产生作中的细菌才产生作用，该谱系以外的微生物仍然可以大量繁殖。用，该谱系以外的微生物仍然可以大量繁殖。抗菌素还可能抗菌素还可能抑制植物组织的生长抑制植物组织的生长。得到无菌材料，植物组织必须得到无菌材料，植物组织必须先进行消毒先进行消毒。有好几种有好几种化学试剂化学试剂都能起到都能起到表面消毒表面消毒的作的作用，试剂的选择及处理用，试剂的选择及处理时间的长短时间的长短要根据要根据材料对试剂的敏感性材料对试剂的敏感性来决定。来决定。一般都采用在消毒后能很容易去除的药剂。一般都采用在消毒后能很容易去除的药剂。因为因为消毒剂消毒剂对植物细胞也有对植物细胞也有杀伤作用杀伤作用，若，若不去除就会不去除就会妨碍妨碍愈伤组织的愈伤组织的发生发生。例如用无菌水例如用无菌水反复冲洗反复冲洗后可以把大部分药后可以把大部分药剂都洗掉，或者能剂都洗掉，或者能自动分解变成低毒性自动分解变成低毒性物物质。质。本氯酸钠本氯酸钠能分解成为具有杀菌效能的能分解成为具有杀菌效能的氯气氯气，然，然后就后就散失到空气散失到空气中。中。低浓度的氯化汞低浓度的氯化汞是一种令人满意的消毒剂，只是一种令人满意的消毒剂，只是是难以去除难以去除，故在消毒后必须用大量清水，故在消毒后必须用大量清水冲洗冲洗材料。材料。在材料放入消毒剂之前，先在在材料放入消毒剂之前，先在乙醇中漂洗乙醇中漂洗一下，一下，可以使材料表面弄湿，从而使可以使材料表面弄湿，从而使消毒剂易于渗入消毒剂易于渗入并杀死微生物。并杀死微生物。3.外植体的大小和形态外植体的大小和形态消毒后的植物材料，即可进行培养。消毒后的植物材料，即可进行培养。从从外表均一外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶的外植体长出的愈伤组织，在开始阶段是相当段是相当一致的一致的，而从茎、根等器官切段上长出，而从茎、根等器官切段上长出的则是一个的则是一个混杂的混杂的愈伤组织。愈伤组织。有些外植体有些外植体外表上看来是由同一类细胞外表上看来是由同一类细胞组成，例组成，例如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎等，这些细胞中等，这些细胞中DNA的含量有很大差别。这种差的含量有很大差别。这种差别可能是由于别可能是由于细胞核中染色体数目的差别，即倍细胞核中染色体数目的差别，即倍性不同性不同所造成的。所造成的。接种的外植体的大小和形状并不需要严格限制接种的外植体的大小和形状并不需要严格限制不能太小，小于肉眼能见的限度时，细胞分裂可不能太小，小于肉眼能见的限度时，细胞分裂可能难以发生。故一般要求切块的大小要适当。能难以发生。故一般要求切块的大小要适当。外植体的外植体的细胞数目多细胞数目多，获得愈伤组织的机会也多。，获得愈伤组织的机会也多。如果目的仅在于得到愈伤组织，如果目的仅在于得到愈伤组织，那末将茎的切那末将茎的切段、叶、根、花、果实或种子，或其中的某种段、叶、根、花、果实或种子，或其中的某种组织切成一片片或一块块放到培养基上就可以组织切成一片片或一块块放到培养基上就可以了。了。如果要定量地研究愈伤组织的发生，如果要定量地研究愈伤组织的发生，那么外植体那么外植体的的大小必须一致大小必须一致，形状和组成形状和组成也要也要基本基本相同。进相同。进行这类研究常选用行这类研究常选用组织块较大的材料组织块较大的材料，例如胡萝，例如胡萝卜的贮藏根、马铃薯的块茎、菊芋、荷兰防风草卜的贮藏根、马铃薯的块茎、菊芋、荷兰防风草等。这样才能得到等。这样才能得到足够数量的、无菌的、一致的、足够数量的、无菌的、一致的、适合于培养的外植体适合于培养的外植体。具体的操作过程：具体的操作过程：无菌的块茎或块根，用无菌的块茎或块根，用钻孔器钻孔器钻出一批钻出一批同一类薄同一类薄壁组织圆柱形的组织，平行排列好。壁组织圆柱形的组织，平行排列好。多把刀片等多把刀片等距离地固定在一组金属片之间，一次切下去得到距离地固定在一组金属片之间，一次切下去得到许多个长短一致的圆柱形的外植体。许多个长短一致的圆柱形的外植体。圆柱形圆柱形大量地大量地、准确地准确地得到得到外形相同外形相同的外植体。的外植体。圆柱体的圆柱体的表面积大表面积大，利于组织块和外界，利于组织块和外界气体和营气体和营养物的交换养物的交换。外植体的外植体的损伤表面分泌物损伤表面分泌物，具有，具有促进愈伤组织促进愈伤组织形形成的能力，因此成的能力，因此表面积越大表面积越大，产生，产生分泌物分泌物数量也数量也越多，愈伤组织的得率也越高。越多，愈伤组织的得率也越高。外植体的体积应尽可能小，从而得到较大数量的外植体的体积应尽可能小，从而得到较大数量的外植体。外植体最小的限度由其亲本外植体。外植体最小的限度由其亲本组织细胞的组织细胞的平均大小来决定平均大小来决定。细胞数目。细胞数目。例如菊芋的细胞比胡萝卜根次生韧皮部的细胞例如菊芋的细胞比胡萝卜根次生韧皮部的细胞大三倍，一个大三倍，一个3.8毫克的胡萝卜外植体大约包含毫克的胡萝卜外植体大约包含25，000个细胞，这样一个外植体是能够成活的。个细胞，这样一个外植体是能够成活的。而同样重量的菊芋外植体，由于细胞大而数目而同样重量的菊芋外植体，由于细胞大而数目少，在分离过程中造成损伤往往难以成活。必少，在分离过程中造成损伤往往难以成活。必须重量达到须重量达到8毫克才包含约毫克才包含约20，000个细胞，使个细胞，使之易于成活。之易于成活。五、污染的原因及其预防措施1 1、污染：、污染：植物组织培养过植物组织培养过程中培养基和培养材程中培养基和培养材 料料滋生杂菌，导致培养失滋生杂菌，导致培养失败的现象败的现象2 2、污染的原因、污染的原因一是病原菌污染（细菌、一是病原菌污染（细菌、真菌）真菌）二是外植体、培养基、二是外植体、培养基、培养器皿带菌培养器皿带菌三是操作人员未遵守操三是操作人员未遵守操作规程。作规程。真菌污染污染的预防措施 组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。预防措施有：防止材料带菌-选择取材时间、材料与培养、外植体灭菌等措施；防止用具带菌-器皿与金属器械灭菌；操作室要处于无菌状态-工作室、培养室灭菌等；操作人员要按照操作程序进行。在培养基中加入抗菌素分散接种假设污染率为假设污染率为95%：100块材料，接种于块材料，接种于100支试管，即支试管，即1 1块块/支支。得率为：得率为：P=（1-95%）100=5块无菌材料块无菌材料 200块材料，接种于块材料，接种于100支试管，即支试管，即2 2块块/支支。P1（2污）污）=95%95%=90.25%P2（1污污1得或得或1得得1污）污）=2 95%5%=9.5%P3（2得）得）=5%5%=0.25%若得到若得到1支试管的无菌材料，至少要接种：支试管的无菌材料，至少要接种：1/0.25%=400支，即接种支，即接种800块材料，能得块材料，能得2块无菌材块无菌材料。料。若按若按3 3块块/支支接种，需做接种，需做8000支试管培养基，接入支试管培养基，接入2.4万块万块材料，才能有材料，才能有1支试管的（得支试管的（得3块）无菌材料。块）无菌材料。六、外植体的褐变及其防止措施褐变褐变 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象影响褐变的因素植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变 。基因型：不同种植物、同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变基因型：不同种植物、同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变程度有很大差别。木本植物一般比草本植物容易褐变。程度有很大差别。木本植物一般比草本植物容易褐变。外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器官和组织，春季取外植体，外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻褐变发生较轻 。外植体培养条件：事先对母株或枝条进行遮光处理，之后再切取外植体，外植体培养条件：事先对母株或枝条进行遮光处理，之后再切取外植体，可减少褐变，因为酚类化合物合成和氧化过程中，有一部分酶系统的活可减少褐变，因为酚类化合物合成和氧化过程中，有一部分酶系统的活性是受光诱导的。性是受光诱导的。培养基的成分：培养基中培养基的成分：培养基中6 6BABA或或KTKT能促进褐变发生，而生长素类如能促进褐变发生，而生长素类如IAAIAA可减轻褐变发生。可减轻褐变发生。材料转移时间：一般让材料生长一段时间后再转移，这时酶的活性比较材料转移时间：一般让材料生长一段时间后再转移，这时酶的活性比较低，褐变也会减少。低，褐变也会减少。褐变的防止措施选择适宜的外植体及最佳培养基：适当降低培养基无机盐浓度，降低PH值，降低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养物褐变连续转移加抗氧化剂：如硫代硫酸钠、抗坏血酸；加活性碳加多胺类物质，如精胺、亚精胺培养物的玻璃化现象及其预防措施玻璃化现象及其产生原因 培养物增殖培养时，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，培养基中离子种类，比例不适，琼脂浓度低，不良培养环境如温度过低或过高，光照时间过长及通气不良，易造成组培苗含水量高，茎叶透明，出现畸形，发生玻璃化现象 玻璃化现象的预防措施适当控制培养基中无机盐浓度适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度增加自然光照，控制光照时间控制好温度改善培养皿的气体交换状况在培养基中添加其他物质培养阶段易出现的其他问题白花苗愈伤组织的愈伤组织的 培养培养一、培养基一、培养基培养基培养基一般一般包括包括大量大量元素、元素、微量微量元素和一种元素和一种碳碳水化合物水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。，最常用的碳水化合物是蔗糖。这样简单的培养基这样简单的培养基(基本培养基基本培养基)只有很少几种植只有很少几种植物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各种各样的附加物添加各种各样的附加物（完全培养基）（完全培养基），如维，如维生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、螯合剂如赤霉素、螯合剂如EDTA、各种营养性的提取物、各种营养性的提取物如椰子汁等。如椰子汁等。注意：选用完全已知的注意：选用完全已知的合成化合物合成化合物，不大主张用，不大主张用复杂的复杂的天然产物天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。汁等。必须强调：必须强调：适合于适合于诱发诱发愈伤组织的培养基不一定适合于愈伤组织的培养基不一定适合于维持维持这些愈伤组织；适合于这些愈伤组织；适合于液体液体培养的培养基也不一培养的培养基也不一定适合于定适合于固体固体培养。培养。培养基中的培养基中的N，大多数都用，大多数都用硝态氮硝态氮，只有，只有MS培培养基和养基和B5培养基中才用硝态和铵态的混合物。培养基中才用硝态和铵态的混合物。K的水平在近代的培养基中有逐渐提高的趋势。的水平在近代的培养基中有逐渐提高的趋势。有趣的是，有趣的是，各种离子各种离子浓度大为不同浓度大为不同的培养基往的培养基往往能使往能使相同的组织快速生长相同的组织快速生长。例如。例如Hildebrandt培养基与培养基与MS培养基培养基显著不同显著不同，但二者都能培养，但二者都能培养烟草的愈伤组织。烟草的愈伤组织。注意：激素的种类和用量的添加激素的种类和用量的添加一般诱导愈伤常添加一般诱导愈伤常添加2.4-D二、愈伤的培养方式：二、愈伤的培养方式：培养分为固体和液体培养两大类。培养分为固体和液体培养两大类。液体培养又分液体培养又分静止和振荡培养静止和振荡培养的二类。的二类。l继代培养（传代）：继代培养（传代）：愈伤组织在培养基愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于上生长一段时间后，由于养分养分的枯竭，的枯竭，水分水分的散失，组织的散失，组织代谢产物代谢产物的积累，影的积累，影响愈伤组织生长，因此必须将响愈伤组织生长，因此必须将组织转移组织转移到新的培养基上。到新的培养基上。一般在一般在25-28下进行固体培养时，每隔下进行固体培养时，每隔4-5周周进行一次继代培养。进行一次继代培养。组织块组织块较小时较小时，继代培养时可将，继代培养时可将整块组织整块组织转移转移。组织块较大。组织块较大时时，可先将组织，可先将组织分成分成几小块几小块再接种。继代培养必须再接种。继代培养必须及时进行及时进行，长期不传代常常由于长期不传代常常由于代谢产物代谢产物的累积，的累积，对组织起对组织起毒害毒害作用，某些植物愈伤组织作用，某些植物愈伤组织的的褐化现象褐化现象即往往由此引起的。褐化的即往往由此引起的。褐化的愈伤组织反复地进行继代培养，可使愈愈伤组织反复地进行继代培养，可使愈伤组织恢复活力而迅速生长伤组织恢复活力而迅速生长理论上愈伤组织是可以无限制继代，但理论上愈伤组织是可以无限制继代，但愈伤组织继代次数增加，形态发生能力愈伤组织继代次数增加，形态发生能力逐渐丧失。逐渐丧失。原因：遗传因素即继代培养中通常出现原因：遗传因素即继代培养中通常出现 染色体紊乱。染色体紊乱。REASONSv 遗传上表现不稳定：染色体出现多倍遗传上表现不稳定：染色体出现多倍v 体和非整倍体体和非整倍体四、培养条件四、培养条件1、光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需、光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，分化需光。继代培养一般需光。此光，分化需光。继代培养一般需光。此时光对器官的作用是一种诱导反应。时光对器官的作用是一种诱导反应。2、温度：一般采用、温度：一般采用2428的恒温条件的恒温条件进行。进行。3、湿度：较大，以免引起培养基干缩。、湿度：较大，以免引起培养基干缩。愈伤组织形态的发生愈伤组织形态的发生愈伤组织培养物在某些条件下，可以愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分再分化产生不定芽或根的分生组织化产生不定芽或根的分生组织甚至是甚至是胚状胚状体体，继之，由这些有结构的组织而发育成，继之，由这些有结构的组织而发育成苗或完整小植株苗或完整小植株。一、愈伤组织通过一、愈伤组织通过再分化形成再生植株的再分化形成再生植株的方式：方式：主要有三种主要有三种(1)先产生先产生芽，芽，后在茎的后在茎的基部长基部长根根；2)先长先长根根，再长，再长芽芽；(3)愈伤组愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。织的不同部位分别形成根和芽。二、二、愈伤组织形成愈伤组织形成1、器官的形成、器官的形成一般愈伤组织开始分化时，由一般愈伤组织开始分化时，由大小不等大小不等的细胞开始逐渐的细胞开始逐渐形成形成大小均匀的细胞大小均匀的细胞，保持，保持相对稳定相对稳定状态。状态。在分化时，愈伤组织的在分化时，愈伤组织的表层和内部表层和内部都可形成都可形成分生中心分生中心。芽芽多发生在愈伤组织的多发生在愈伤组织的表层表层，属，属外起外起源。源。根根发生在组织的发生在组织的深处深处，与整体植株发生类似，是，与整体植株发生类似，是内起源内起源。愈伤组织的愈伤组织的外部形态也随分化而改变外部形态也随分化而改变，一般由，一般由疏松转向疏松转向紧密紧密。2、体细胞胚的发生愈伤组织愈伤组织 体细胞胚体细胞胚 植株植株三、激素对愈伤组织分化的影响三、激素对愈伤组织分化的影响植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用中起着重要的作用。如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当6-BA加倍加倍时，茎段的愈伤组织可以时，茎段的愈伤组织可以再分化出仔球再分化出仔球，而，而6-BA浓度浓度过高过高(150倍倍)或或过低过低(10倍倍)则无仔球形成。则无仔球形成。器官分化的植物激素控制理论器官分化的植物激素控制理论大多数植物组织或器官的再生作用符合器官大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。分化的植物激素控制理论。生长素与细胞分裂素的生长素与细胞分裂素的比例小比例小时则产生时则产生苗苗，比例大比例大时则生时则生根根，而两种激素的比例，而两种激素的比例适中适中时，时，则产生无结构的愈伤组织。则产生无结构的愈伤组织。愈伤分化愈伤分化第六节例第六节例2 愈伤组织的诱导与分化愈伤组织的诱导与分化Callus DefinitionInitiationOriginCallus establishment Callus type一一、Definition of callus Callus consists of an amorphous(无无定定形形)mass of loosely arranged thin-walled(parenchyma 薄壁薄壁)cellsWound callus on the stemof an Erythrina tree 刺桐树刺桐树二、二、Initiation of callus 愈伤的愈伤的萌动萌动 Wounding may result in callus formation at the cut/damaged ends of stems or roots.Callus formation has been observed in almost all groups of living plants.The initiation of wound callus is a protective response by the plant;cell division is activated as a result of changes in the endogenous balance of the phytohormones.Mechanical injury,invasion by microbes and insect attack may also result in callus production.三、三、Origin of callus 愈伤的愈伤的起源起源 Callus arises from proliferating cells of the parent tissue.In culture,callus is initiated by placing small pieces of the whole plant(explants)onto a growth-supporting medium under sterile conditions.Hormones change the metabolism(新新陈陈代代谢谢)of the cell from quiescent to metabolically active.愈愈伤伤从从增增殖殖的的组组织织细细胞胞中中产产生生，激激素素改改变变细细胞胞的新陈代谢状态，从生长静止期到代谢旺盛。的新陈代谢状态，从生长静止期到代谢旺盛。Callus arising from leaf tissueCallus arising from vascular tissueFromrootFrom embryo culturePhoto indicating where the callus(c)arises from 四、四、Callus establishment 3 stages从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：起动期个时期：起动期 （诱导期）、分裂期和分（诱导期）、分裂期和分化期。化期。三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明显的差别。胞的平均大小都有明显的差别。Stage 1.Induction（诱导期诱导期）:诱诱导导期期是是细细胞胞准准备备分分裂裂的的时时期期，是是愈愈伤伤组组织织形形成起点。成起点。外外植植体体细细胞胞在在完完整整植植株株中中随随着着细细胞胞的的分分化化过过程程而而逐逐渐渐停停止止分分裂裂，开开始始执执行行它它们们各各自自不不同同的的功功能能。外植体细胞一般处于静止状态，称为外植体细胞一般处于静止状态，称为静止细胞静止细胞。特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内的合成的合成代谢迅速代谢迅速进行，但是细胞进行，但是细胞的的大小大小仍然和外植体时一样，仍然和外植体时一样，没有多大改变没有多大改变。From most kinds of plants callus can be established relatively easy;in dicots,monocots,gymnosperms(裸子植物裸子植物),ferns(蕨类蕨类)and mosses(苔藓苔藓).Tissues from many organs may have the potential to divide and proliferate on appropriate culture media,however,some tissues are more predisposed to rapid cell division than others.大多数植物容易产生愈伤，大多数植物容易产生愈伤，但许多植物趋向于细胞快速分裂但许多植物趋向于细胞快速分裂 诱导期的长短：诱导期的长短：由一系列由一系列内部（植物的种类、生理状况）和外内部（植物的种类、生理状况）和外部（光照、外源激素）因素部（光照、外源激素）因素决定。决定。例如菊芋的诱导期有时还不需要例如菊芋的诱导期有时还不需要1天，胡萝卜则天，胡萝卜则要好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导要好几天，而菊芋块茎贮藏时间的改变，诱导期也发生改变。从期也发生改变。从11月到次年月到次年4月取菊芋块茎进月取菊芋块茎进行培养，则诱导期从行培养，则诱导期从22小时逐渐延长到小时逐渐延长到40小时。小时。故可以从内外因两方面着手，改变诱导期长短故可以从内外因两方面着手，改变诱导期长短主要外因方面是主要外因方面是添加一些生长物质添加一些生长物质Steward等等(1964)用用2,4-D及其及其类似的生长调节类似的生长调节物质处理处于物质处理处于静止状态的组织静止状态的组织，看到，看到RNA的含的含量量很快明显地增加很快明显地增加。并且。并且2、4-D积累在分裂细积累在分裂细胞的核仁中。胞的核仁中。Yeoman 和和 Mitchell(1970)指出了指出了核仁核仁是生长是生长物质的物质的作用部位作用部位。Brown（1972）认为静止细胞是具有分裂能力的，只是被存在的一类抑制物质所阻止，而使其分裂能力不能表现，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能力。若加入抵消抑制物质影响的外源物质（激素），细胞就立即进行DNA复制，全部细胞进入S期，并发生同步分裂。Stage 2.Cell division分裂期分裂期Active cell division,cells revert to a meristematic dedifferentiated state.分裂期分裂期：外植体：外植体(explant)中中已分化的活细胞已分化的活细胞在在外源激素外源激素的作用下，外植体的作用下，外植体外层细胞外层细胞出现了分出现了分裂，由于外层细胞的裂，由于外层细胞的迅速分裂迅速分裂使得这些细胞的使得这些细胞的体积缩小体积缩小，逐渐回复到，逐渐回复到分生组织状态分生组织状态，因此也，因此也称为称为回复变化回复变化。在回复变化时，细胞通过。在回复变化时，细胞通过脱分脱分化化的起动期而进入的起动期而进入分裂，分裂，并开始并开始形成愈伤组织。形成愈伤组织。特征：生理生化上分裂期的一个明显特征是特征：生理生化上分裂期的一个明显特征是外外层细胞进行分裂层细胞进行分裂，而，而中间的细胞不分裂中间的细胞不分裂。另外。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大等增到最大等愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。Stage 3.Differentiation分化期分化期Appearance of cellular differentiation and the expression of secondary metabolic pathways.分化期特点分化期特点：分化结构的形成过程加速，超过分化结构的形成过程加速，超过了回复变化了回复变化。外层细胞的分裂逐渐减慢，甚至。外层细胞的分裂逐渐减慢，甚至停止，为停止，为次生生长所代替次生生长所代替，大量，大量次生结构次生结构出现。出现。在这时期中在这时期中细胞的伸展和分裂处于平衡细胞的伸展和分裂处于平衡，故细，故细胞的胞的平均大小平均大小往往没有变化。往往没有变化。根据形态变化列出三个时期，实际上它们并不根据形态变化列出三个时期，实际上它们并不是严格的，特别是分裂期和分化期。一块培养是严格的，特别是分裂期和分化期。一块培养组织的细胞既有分裂的又有分化的。组织的细胞既有分裂的又有分化的。愈伤组织的特点：生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。五、五、Callus types Callus may be heavily lignified（木木 质质 化化）and hard in texture,whereas others break easily into small fragments(friable).Different types of Gloriosa callus:FriableHard/lignified callus Rhizogenic callusCallus exuding sticky poly-saccharides 根据愈伤质根据愈伤质地划分为：地划分为：愈伤组织的质地和物理性状是有明显差异的愈伤组织的质地和物理性状是有明显差异的有的坚实，有的脆。脆的愈伤组织是悬浮培养生有的坚实，有的脆。脆的愈伤组织是悬浮培养生长的最合适的材料，容易使组织处于分散状态。长的最合适的材料，容易使组织处于分散状态。White(1956)White(1956)用用白云杉白云杉愈伤组织做材料，愈伤组织做材料，发现坚发现坚实的可以产生脆的变异实的可以产生脆的变异，但无相反情形发生，用，但无相反情形发生，用高浓度的酵母提取物能诱导豌豆愈伤组织变脆。高浓度的酵母提取物能诱导豌豆愈伤组织变脆。BlakelyBlakely和和Steward(1961)Steward(1961)指出指出单冠毛菊单冠毛菊脆的和坚脆的和坚实的实的愈伤组织间是可以愈伤组织间是可以相互转变相互转变，只要改变椰子，只要改变椰子汁和萘乙酸的量就能转变类型。汁和萘乙酸的量就能转变类型。GrantGrant和和Fuller(1968)Fuller(1968)在在蚕豆根蚕豆根的愈伤组织中，的愈伤组织中，也见到有脆与坚实的两种类型并可以也见到有脆与坚实的两种类型并可以互变互变。愈伤组织的基本解剖学：愈伤组织的基本解剖学：基本解剖学基本解剖学特征明显差异。特征明显差异。菜豆，凡是菜豆，凡是脆的脆的都有大量的都有大量的分生组织中心分生组织中心或或瘤瘤状状结构，它们被大而结构，它们被大而未分化的细胞所分开未分化的细胞所分开；而；而不脆不脆的类型的类型很少分化很少分化，而且大部分是高度液泡化细胞。，而且大部分是高度液泡化细胞。单冠毛菊，单冠毛菊，脆的脆的愈伤组织由愈伤组织由松散排列松散排列的细胞组成，的细胞组成，坚实的坚实的愈伤组织是由愈伤组织是由堆得很紧堆得很紧的细胞所组成。的细胞所组成。愈伤组织的化学成分：愈伤组织的化学成分：蚕豆蚕豆，不脆的愈伤组织有大量的，不脆的愈伤组织有大量的组成细胞组成细胞壁的多糖壁的多糖，以单位干重计，细胞壁的部分，以单位干重计，细胞壁的部分也多；但与果胶物质及半纤维素相比，纤也多；但与果胶物质及半纤维素相比，纤维素的百分率是低的。无疑，大量的维素的百分率是低的。无疑，大量的纤维纤维素增加素增加了细胞的了细胞的硬度硬度，而，而果胶果胶含量的增加，含量的增加，保证了细胞紧紧地保证了细胞紧紧地粘粘在一起而在一起而不易断碎不易断碎。Callus may have a yellow,white,green or red(anthocyanin 花青苷花青苷)appearance.不同颜色的愈伤不同颜色的愈伤总结：总结：From callus to plant思考题思考题思考题1.名词解释：愈伤组织名词解释：愈伤组织 胚状体胚状体 脱分化脱分化2.愈伤组织培养对外植体有何要求？愈伤组织培养对外植体有何要求？3.愈伤组织形态发生有哪些情况？愈伤组织形态发生有哪些情况？4.简述愈伤组织细胞分化。简述愈伤组织细胞分化。