第六章 胚胎工程()

第六章第六章 胚胎工程胚胎工程一、胚胎发育的基本过程和机制一、胚胎发育的基本过程和机制（一）精卵发生（二）受精（三）卵裂（四）囊胚的形成（五）原肠胚及胚层 的形成和分化（六）动物早期胚胎 发育及其分子机制 二、体外受精二、体外受精（in vitro fertilization，IVF）就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵体外进行精卵结合结合的过程。由于体外受精在实验室进行，所以得到的动物或人称为“试管动物”或“试管婴儿”。（一）体外受精的研究历史（一）体外受精的研究历史 1951年Chang（张明觉）和Austin发现了精子的获能现象，为体外受精的实现打开了通路。1954年，Thibault等获得第一只体外受精的兔子。随着研究深入，试管老鼠、试管猪、试管牛等相继产生。1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“试管婴儿”，至此，体外受精技术逐渐成熟。（二）体外受精技术（二）体外受精技术 主要包括以下几个主要方面：精子的采集主要包括以下几个主要方面：精子的采集与获能、卵母细胞的采集及成熟培养、体外与获能、卵母细胞的采集及成熟培养、体外受精、受精卵的体外发育及试管胚胎的移植受精、受精卵的体外发育及试管胚胎的移植等。等。采集良种母牛的卵母细胞采集良种母牛的卵母细胞卵母细胞的体外培养卵母细胞的体外培养采集良种公牛精子采集良种公牛精子精子体外获能精子体外获能体外受精体外受精良种牛体外受精胚胎良种牛体外受精胚胎胚胎移植胚胎移植受体牛受体牛良种犊牛良种犊牛成熟期牛成熟期牛屠宰加工厂屠宰加工厂市场市场采集卵巢中的采集卵巢中的卵母细胞卵母细胞“试试管管牛牛”工工厂厂化化生生产产的的技技术术流流程程图图1.卵母细胞的采集和成熟培养 体外受精技术体外受精技术（1）卵母细胞的采集 超数排卵 从活体卵巢中采集卵母细胞 从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞（2）卵母细胞的选择（3）卵母细胞的成熟培养（1）卵母细胞的采集 超数排卵:如果一次要获得多个卵，可以利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation）.如在小鼠期涂片相时注射510IU PMSG(血清促性腺激素)，4850小时后，再于皮下或腹腔注射510 IU hCG(人体绒膜促性腺激素)，这种方法可以获得超数排卵。从活体卵巢中采集卵母细胞 以鼠为例：为防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨部，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，从内容物溢出而找到卵。对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞 可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。（2）卵母细胞的选择 采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complesx COC）。无论采用何种方法，采集的COC都要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞：有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；B级卵母细胞：质均匀，卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。在体外受精实践中，一般只培养A级和B级卵母细胞。（3）卵母细胞的成熟培养 超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接与精子受精；对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培养法，微滴体积为50-200微升，每滴中放入的卵母细胞数按每5微升一个计算单位。卵母细胞移入小滴后，放入二氧化碳培养箱中培养，培养条件为39、100%湿度和5%二氧化碳的空气。牛的培养时间为20-24小时；2.精子的获能处理精子的获能处理 张明觉张明觉Austin 1951年发现兔子和大白鼠直接排年发现兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必须在生殖道中停留一段出的精子不能使卵受精，必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能（capacitation）。）。A.精子的获能过程，包括两个阶段，获能的第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子，增强了膜通透性。第二阶段是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应。B.生育意义去除精子表面的覆盖物，暴露出精子膜表面与卵子相识别的位点。增加精子活力，改变膜的通透性。精子头部出现流动性不相等的区域，为精子膜与顶体膜融合做好准备。精子顶体后区膜的流动性加大，以准备与卵膜结合。C.处理方法 （1）培养法：对啮齿动物、家兔和猪等动物，将取自附睾的精子，放入人工配制的获能液中，培养一段时间后，精子就可获能，这种方法称为培养法。（2）化学诱导法：对于牛、羊等家畜，将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导精子获能，称之为化学法。3.体外受精体外受精（1）常规体外受精技术）常规体外受精技术 将获能精子与成熟卵子置于受精液中共同培养，使之完成受精过程。通常情况下，受精液与获能液为同一种液体。（2）与分离精子相结合的体外受精技术）与分离精子相结合的体外受精技术 将精子分离技术与体外受精技术结合起来生产预选性别的优良胚胎,对加速家畜品种改良和畜牧业生产具有重要的应用价值。（3）显微受精技术）显微受精技术 为了提高体外受精的成功率，借助显微操作仪将精子直接注入卵母细胞质或透明带下，完成受精过程。显微受精技术避免了由透明带或卵质膜所形成的受精障碍，使受精率和准确率大大提高。4.受精卵的体外培养受精卵的体外培养 受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑葚胚或囊胚阶段，移植到受体后才能获得较高的妊娠率。但体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此现象称之为“发育阻滞”。不同动物体外发育阻滞出现的时期不同，小鼠为2细胞期，大鼠为8细胞期，牛和绵羊为816细胞，猪为4细胞期。目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：一是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚一是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分；胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分；二是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质二是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件，目前广泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒条件，目前广泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒细胞单层共培养体系。细胞单层共培养体系。5.体外受精的意义体外受精的意义可以用来研究受精机理；治疗人类男性和动物的生殖不育；可以利用体外受精卵的发育状况或染色体核型检测用来检测形态不正常精子其染色体是否正常；可以产生大量的转基因动物；可以简化烦杂的冻精技术，或许只保存核物质，就可以达到受精的目的，这对保护珍贵的动物资源，将起到重要的作用。三、胚胎移植技术三、胚胎移植技术 所谓胚胎移植（所谓胚胎移植（所谓胚胎移植（所谓胚胎移植（embryo transferembryo transfer）也称受精卵）也称受精卵）也称受精卵）也称受精卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术。体技术。体技术。体技术。（一）胚胎移植的研究历史1.初级阶段：初级阶段：1900-1950 主要由英美科学家在家兔、绵羊、主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率山羊小家畜方面研究，成功率35%左右。左右。2.发展阶段：发展阶段：1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达70-80%。3.实用化初始阶段：实用化初始阶段：1970-1980 加美开始成立牛胚胎移植公加美开始成立牛胚胎移植公司，司，1973年牛冻胚移植成功（英）。年牛冻胚移植成功（英）。1982-大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。1供体、受体的选择供体、受体的选择 胚胎移植的供体一般是选择需要加速繁殖的有较大生产应用价值的健康的优良畜种，受体则是繁殖能力较强的健康本地品种。（二）胚胎移植技术2超数排卵超数排卵3同步发情同步发情 同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。中发情。4人工受精人工受精激素注射结束后，观察到发情后小时，激素注射结束后，观察到发情后小时，开始第一次输精，时隔小时进行第二次开始第一次输精，时隔小时进行第二次输精，输精量是常规量的两倍输精，输精量是常规量的两倍。5胚胎采集胚胎采集（1）手术法：）手术法：在配种或输精在配种或输精后第后第7天，用特天，用特制的冲卵装置，制的冲卵装置，把供体母牛子把供体母牛子宫内的胚胎冲宫内的胚胎冲洗出来。洗出来。手术法采胚（2）非手术法）非手术法 6胚胎的检查与鉴定胚胎的检查与鉴定1）检卵：）检卵：37度冲卵液静止观察胚胎质量。度冲卵液静止观察胚胎质量。2）吸卵：注射器或吸卵管。）吸卵：注射器或吸卵管。3）胚胎质量鉴定：卵裂球外形整齐，大小一致，分布均）胚胎质量鉴定：卵裂球外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整，无卵裂及异常卵不用于移植。匀，外膜完整，无卵裂及异常卵不用于移植。7胚胎移植胚胎移植1）手术移植：非排卵侧子宫角，通过注射器或移卵管刺）手术移植：非排卵侧子宫角，通过注射器或移卵管刺入子宫角前端，注入胚胎。入子宫角前端，注入胚胎。2）非手术移植）非手术移植：采用空气隔绝的装有胚胎的吸管，装：采用空气隔绝的装有胚胎的吸管，装入移植枪，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。入移植枪，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。显微镜下的胚胎显微镜下的胚胎 所谓胚胎分割（embryo splitting）即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术，来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此 胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。四、四、胚胎分割技术胚胎分割技术主要仪器设备显微操作仪实体显微仪（一）选择的胚胎（一）选择的胚胎:发育良好的发育良好的,形态正常的形态正常的桑椹胚或囊胚桑椹胚或囊胚.胚胎分割的理论基础：胚胎分割的理论基础：细胞具有全能性细胞具有全能性操作液的培养皿 分割时要注意：分割时要注意：要将要将内细胞团内细胞团均等分割均等分割，若不均等分割会影响分，若不均等分割会影响分割后胚胎的割后胚胎的恢复恢复和进一步和进一步发育发育。（二）胚胎分割的方法（二）胚胎分割的方法（1）显微针分割法）显微针分割法在显微操作仪下将胚胎固定在显微操作仪下将胚胎固定-玻璃针切开透明带玻璃针切开透明带-移出移出卵裂球卵裂球-吹吸卵裂球使之离散吹吸卵裂球使之离散-装入预先备好的空透明带。装入预先备好的空透明带。（2）显微刀分割法）显微刀分割法显微刀均分桑堪胚或早期囊胚显微刀均分桑堪胚或早期囊胚-分别装入透明带分别装入透明带（3）酶软化透明带后显微分割法）酶软化透明带后显微分割法用0.5%链霉蛋白酶软化透明带-玻璃针分割（4）酶消化去透明带后分割法）酶消化去透明带后分割法链霉蛋白酶去掉透明带去掉透明带-分割裸胚分割裸胚（5）徒手分割法）徒手分割法分割体积较大胚胎分割体积较大胚胎 （三）胚胎分割目前存在的问题和发展前景（三）胚胎分割目前存在的问题和发展前景 1）胚胎分割产生的后代初生体重低；摘除透明带处理会降低半胚的发育能力且耗时过多；切割后装带过程很可能使半胚的断面细胞再次受到损伤，移植后可能导致犊牛畸形。2）遗传一致性问题；不同质量的胚胎对分割成功率有较大的影响，而且不同质量胚胎分割后增加的可用胚的比率差异极显著。3）同卵多胎的局限性。4）显微操作器价格昂贵、操作烦琐。5）由于分割操作者的熟练程度不同，导致胚胎分割的成功率差异显著。因此应不断提高操作者的技术水平，确保胚胎分割成功率。6）牛分割胚的冷冻同整胚相比，成功是比较困难的。有很多问题有待于解决。如半胚的包被、半胚装入空透明带；半胚的脱水、半胚的冷冻、解冻方法等。五、胚胎冷冻保存技术五、胚胎冷冻保存技术 将胚胎贮存在将胚胎贮存在196超低温下长期保存的方超低温下长期保存的方法。这是法。这是20世记世记70年代试验成功的一项新技术，年代试验成功的一项新技术，是胚胎移植技术的重大突破。是胚胎移植技术的重大突破。（一）胚胎冷冻保存的意义胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚胎移植技术的效率；胎移植技术的效率；长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施；长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施；便于国际间交流；便于国际间交流；替代种畜引种。替代种畜引种。1.渗透性：甘油、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）和DMSO等，防止溶质效应。2.非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形成。基础液：mPBS（改良）、TCM-199、PBS、HEPES等，最常用mPBS。（二）抗冻剂的种类及作用特点：分子量小于100，易于渗透特点：分子量大，不进入细胞1.结晶变化：温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。2.溶质效应：降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。3.机械效应：降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚胎造成致命的机械损伤。（三）胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤1.常规冷冻法：“植冰”后控制降温速度，避免过快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎过分脱水而产生溶质效应。2.超速冷冻法：非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。3.玻璃化冷冻法：应用高浓度防冻剂，使胚胎内外液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近，控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体，直接投入液氮保存。（四）胚胎冷冻保存方法历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功；1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。操作流程：（1）抗冻液中平衡：室温下（2025），在含有12摩尔升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。1.常 规 冷 冻 法（2）植冰（诱发结冰）：植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上端（棉栓端），使抗冻液迅速通过6左右冰点，强制性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致使胚胎死亡。将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至6左右时，用上述方法诱发结冰。1.常 规 冷 冻 法（3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓慢降温。以0.33分钟降至3035时投入液氮；以1.0分钟的速度降至80时投入液氮；以0.5分钟降至3035时投入液氮。原理：植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。1.常 规 冷 冻 法（4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室温或37水浴中解冻。（5）除去抗冻剂：原因：解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。抗冻液：蔗糖溶液；操作：解冻后胚胎由浓度高的抗冻液中移向浓度低的抗冻液，进行梯度稀释；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培养。1.常 规 冷 冻 法 从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中:1.5M 乙二醇+蔗糖+PBS+AA+FCS 装入细管(编号预先准备好)放入冷冻容器-6.0 Seeding ice 每分钟降低 0.5，一直到-30为止 放入液氮容器1.常 规 冷 冻 程 序玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段，不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能形成，由液态变为透明半固态的现象。玻璃化溶液（VS）：细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜，所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。3.胚胎玻璃化冷冻几种常见的玻璃化冷冻方法：（1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化学毒性，添加了乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和非透过性抗冻剂聚乙二醇(PEG)。PEG具有促进玻璃化形成的作用。胚胎在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（2550100VS1）；平衡温度由高到低（2244）三步完成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。3.胚胎玻璃化冷冻（2）Scheffen等玻璃化冷冻保存法：主体抗冻剂：丙三醇（G）和丙二醇(P)；玻璃化溶液：上述两种抗冻剂各含25混合而成(PG25)，两者混合后可降低溶液的化学毒性，无需添加细胞非透过性抗冻剂。方法：室温下（2025），胚胎于10丙三醇溶液中平衡10分钟，然后在PG25中平衡30秒钟，然后投入液氮中冷冻保存。（3）Kasai等玻璃化冷冻保存法：抗冻剂：乙二醇（EG）为细胞内液抗冻剂（透过性保护剂），其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性强的特点；聚蔗糖（Ficoll）为细胞外液抗冻剂，有利于促进玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)是为了冷冻前胚胎细胞的脱水，细胞内部EG的调整及解冻后的EG的脱出。玻璃化溶液：上述三种抗冻剂经mPBS调整成EFS玻璃化溶液；方法：室温胚胎在EFS玻璃化溶液中25分钟平衡后，即投入液氮。（4）Zhu等玻璃化冷冻保存法：主体抗冻剂：乙二醇、甘油和二甲基亚砜；玻璃化溶液：EFS、GFS和EDFS；方法：室温下，将胚胎在10乙二醇或10甘油或10乙二醇10二甲基亚砜中平衡5分钟，再移入EFS或GFS或EDFS玻璃化溶液中平衡30秒钟，即两步法冷冻保存。此方法重复性较高，对实验动物及各种家畜的胚胎皆可进行冷冻保存。E546-SM 4567891%2223333 M 198 Mar,27胚胎公司冷冻编号胚胎公司冷冻编号配种编号配种编号供体母牛登记供体母牛登记公牛登记公牛登记冷冻日期冷冻日期直接移植胚直接移植胚胎号胎号胚胎发育阶段胚胎发育阶段胚胎质量胚胎质量BetsyDT 1（五）胚 胎 细 管 编 号保护细胞膜免受损害；保护胚胎细胞，免受晶体损害；具有“渗透活性”；解冻后保护剂必须从细胞内去掉；甘油（丙三醇）：普通的冷冻和解冻剂，通过细胞膜慢慢扩散，为避免渗透休克，必须缓慢去掉；乙二醇：直接胚胎移植方法,通过细胞膜快速扩散，因而不需要慢慢去掉。（六）冷冻保存的要点（七）胚 胎 解 冻解冻方法：慢速解冻：以4-25/min的速率使胚胎由冷冻保存温度逐渐升至室温，适用于慢速冷冻的胚胎。当温度由-196 升到-50-15 埋，细胞内仍可能形成大冰晶而致死胚胎。快速解冻：温水浴法，以30-36/min的速率使胚胎在30-40s内从-196 至室温。（七）胚 胎 解 冻脱除保护剂：目的：防止保护剂对胚胎的毒性；防止因细胞内保护剂浓度过高，导致胞内外渗透压差过大，而使胞外水分内流，最终使胚胎过度膨胀受损。经典方法：浓度递减的保护液逐步稀释脱除，繁琐费时，但有效；蔗糖等非渗透性保护液逐步脱除，使用较多；六、动物的性别控制 动物的性别控制技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预,使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术；它能显著提高家畜的繁殖效率，一直是生物科学领域的一项重要课题。（一）动物的性别决定1.性染色体与性别决定（1）雄性异配子 （2）雌性异配子 （3）雄性单倍性型 2.Y染色体性别决定基因SRY 弱组织相容性抗原（H-Y）3.环境对性别的影响 弱组织相容性抗原（H-Y）Y染色体性别决定区基因SRY：雄性性别是由Y染色体决定的，并证明哺乳动物的Y染色体上有一个性别的遗传控制因子，称睾丸决定因子(test is-determining facter,TDF)；人和小鼠的研究中证实睾丸决定基因位于1A1区的60kb区内,人在距短臂末端的35kb处,而小鼠则在14kb内发现了一个单拷贝基因,它是由一个250bp左右,编码主结构由80个氨基酸的单拷贝基因所组成，虽然不同动物的片段位置、结构和长短各不相同,但该基因的DNA 序列在哺乳动物中却具有极高的同源性。（二）X精子和Y精子的差别1）Y精子的F小体：查上Y精子的F小体（荧光亮点）2）精子的重量：X、Y精子头部大小,X、Y精子的重量和比重上的差异。3）精子运动：运动速度的差异；Y精子活动能力强。4）精子的耐酸碱性 Y精子嗜碱性，X精子嗜酸性5）精子表面的H-Y抗原及分布：Y精子能够表达弱组织相容性抗原（H-Y）精子分离法主要是依据X精子和Y精子的理化特性如密度、形态、大小、活力、表面电荷和免疫原性等进行分离。Ke Huiciu 证实X 精子在长度、头部面积、周径、颈部长度、尾长等形态上显著大于Y 精子，为精子分离提供了理论依据。（三）精子的分离方法1.沉淀法：是美国的德纳尔德艾里克森医生研究出来的，方法是在精液中加入黏性较强的蛋白质液，再放入离心分离器。由于Y精子比X精子轻,因此游泳的速度较快,可利用特殊的滤器加以分离。2.密度梯度离心法 根据X精子的DNA含量高于Y精子，导致X精子的密度及重量大于Y精子。在离心时X精子的沉降速度快于Y精子而实现分离的方法。此方法的优点是分离时间比一般沉淀分离短得多,并对精子的活力影响较小。但存在着X精子间沉淀速度的差异并不比X与Y精子间的差异要小的问题。3.电泳法 根据精子表面具有不同的电荷而设计的一种分离方法。原理是以中性缓冲液电泳时向阳离子移动的X精子比Y精子多来对精子进行分离。正极仅有少量的Y精子,而在近负极处有80%的Y精子。4.免疫学方法利用H-Y抗体检测Y精子质膜上存在的H-Y抗原,以此来分离X精子和Y精子5.沉积分离法 此法是利用X精子沉积速率比Y精子快的原理,Kaneko等报道把人的精液放在不同密度的12个Percoll梯度中,经过30min缓慢离心处理,可以收集到90%以上的X精子 6.帕克尔液比重分层法 检查精液时,发现X精子比Y精子重7%。帕克尔液比重分层法就是利用这一点来分离X精子与Y精子,分离时使用帕克尔液,因此命名为帕克法。利用密度分层法,将帕克尔液分为比重分别为1.06、1.07、1.08,1.09,1.10,1.11,1.12,1.13 的7层,从底部往上,比重逐渐减少。试验中,将精子放在离心分离器中,精子会聚集在与自己比重相同处。结果,Y精子聚积在试管上方澄清液体和中间层处,约占73%,X精子则聚集在试管的最下层。利用这个方法能够成功选择X精子,因此对于奶牛生产有较高价值。7.流式细胞分类离法 流式细胞仪由液流系统、光学系统、分选系统和数据处理系统等所组成，能够定量测定精子等多种单个细胞的细胞膜、胞浆以及核内的多种物质,而且具有测定快速、精确、多参数的特点。将与DNA 结合的荧光素染料(Hoechst33342)与稀释的精液共同培养；分离时,精液以极高的速度喷出,形成一个个极微小的液滴,存在于微滴中的单个精子因受到激光照射而产生出相应的光散射信号和某种颜色的荧光信号,前者的强弱反映精子细胞的大小、形态等,后者是由与DNA链定量结合的染料受到某种波长的光的激发而发射出来的,光学系统通过分析测出该精子的DNA 含量,从而识别出其类型并以图表的形式在计算机上直观地显示出来；分选系统依精子的类型分别施加以正负不同的电荷,使它们在电场中继续向前运行时定向偏转于不同的电极,这样,X精子和Y精子就可被分别收集到不同的容器中而予以分离,不含精子的微滴以及类型不能被识别的模糊精子会被仪器弃掉。6.化学药品处理法（四）胚胎性别鉴定1.核型分析法：通过分析部分胚胎细胞的染色体组成判断胚胎性别，有XX染色体的胚胎发育为雌性，有XY染色体的发育为雄性。其主要操作程序是:先从胚胎中取出部分细胞，用秋水仙素处理使细胞处于有丝分裂中期，再制备染色体标本，通过显微摄影分析染色体组成，确定胎胎性别。2.SRY片段的PCR扩增法 它是用雄性特异性DNA探针和PCR扩增技术对哺乳动物早期胚胎进行性别鉴定的一种新方法。原理和主要程序:先从胚胎中取出部分卵裂球，提取DNA，然后用SRY基因的一段碱基作引物，以胚胎细胞DNA为模板进行PCR扩增，再用SRY特异性探针对扩增产物进行检测。如果胚胎是雄性，那么PCR产物与探针结合出现阳性，而雌性胚胎则为阴性。3.免疫学方法：依据是雄性胚胎存在雄性特异性组织相容性抗原(H-Y抗原)，其方法是先分离H-Y抗原，制备抗体，然后可通过三种方法把雌雄胚胎分离开。第一种方法是在胚胎培养液中加人抗体和补体,经一段时间培养，继续发育的为雌性，不能发育而退化的为雄性。第二种方法是先将胚胎与H-Y单克隆抗体处理后，再用荧光素标记的第二抗体处理，然后在荧光显微镜下观察，有荧光的胚胎为雄性，没有荧光的为雌性。第三种方法是在胚胎发育到桑椹胚阶段向培养液中加人H-Y抗体,继续培养一段时间后，出现囊胚的为雌性胚胎，停留在桑椹胚的为雄性。由于H-Y抗原是弱抗原，在操作过程中，观察人员的主观影响因素很大，因而结果的误差大，在实际生产中的运用目前还难以实行。性别控制在畜牧业中具有重要的生产意义。第一，在经济方面，通过充分发挥优势性别作用以大大提高经济效益，如运用此技术提高大量雌性个体如奶牛、母鸡的数量，同时节约雄性个体在繁殖年度的饲料消耗，相反亦可通过此技术控制多产雄性肉牛、肉鸡、绵羊和猪等具有增重快、肉质优等特点的雄性后代。第二，在育种方面，通过性别控制可以增加选择家畜遗传和表型性别的强度,消灭不理想的隐性性状，加快家畜的遗传进展、畜群的更新。此外，随着分子遗传学和发育生物学以及其他相关科学的发展,性别控制技术将成为胚胎工程中的一项配套技术,它对各项生物技术的发展和应用都具有重要的促进作用。