动物繁殖调控技术+

动物繁殖调控技术 l 人为地调控动物的生殖活动，提高动物生产的效益和质量，使之适合于人们经济发展与维持生态平衡的需要，要求人们加速发展经济动物、观赏动物及保护濒危动物，这些促进了畜牧兽医工作者对动物生殖进行有效了调控，充分发挥动物的生殖潜力，提高繁殖效率，使之进一步满足人民生活在社会发展的需求。动物繁殖调控技术l动物繁殖调控技术主要包括：1)人工授精技术人工授精技术（Artificial Insemination,AI)2)MOET技术技术（Multiplovulation and Embryo Transplant,超数排卵与胚胎移植）3)胚胎体外生产技术胚胎体外生产技术（In vitro embryo production,IVP)4)相关延伸技术相关延伸技术（胚胎冷冻、性别鉴定、胚胎分割、胚胎嵌合、细胞核移植和基因导入等）一、人工受精技术（Artificial Insemination,AIArtificial Insemination,AI）l1、历史研究l1780年，意大利Spallanzani首次用犬进行人工受精，获得成功;l1899年，俄国伊万诺夫进行马和牛的AI工作，将犬的假阴道改进成了马、牛、羊用假阴道，并研究精液处理方法，使AI技术进入实际应用阶段;l1951年，英国人Polge等将甘油用于-79超低温冷冻保存牛精液并输精，同年产下世界第一头冷冻精液牛犊;l1952年，Polge又发表了用经液氮在-192保存9个月鸡精液的受精卵孵化出了雏鸡的报告一、人工受精技术l2、人工授精技术（AI）lAI是借助于器械或徒手操作，以人工和方法采集雄性动物精液，经过精液品质检查、稀释、保存和运输等一系列处理后，再送入到发情雌性动物的生殖道内以达到受胎的目的。这种代替自然交配的技术，称为AI技术。一、人工受精技术l人工授精技术是由：l 采精技术（包括采精技术和采精频度）l 精液处理技术（包括精液品质检查、稀释和保存）l 输精技术（包括输精的准备、要求和 方法）l三部分组成。一、人工受精技术l2.1采精技术l常用的采精方法是：假阴道假阴道法法l此外还有按摩法与手握法。l采精频度是指每周对公畜的采精次数。l对公牛而言，2-3次/周是较合理的。一、人工受精技术l2.2精液处理技术精液品质检查的内容有：1)精液的感官检查2)精子密度3)精子活率4)每头份有效精子数5)精子畸形率6)顶体完整率7)精子存活时间及存活指数8)伊红低渗溶液试验9)细菌学检查一、人工受精技术l精液稀释应在采出的精液经品质检查合格，湿度下降之前及时稀释。lAI操作规定每头份输精量中应含有效精子数为：l牛1000万-1200万l羊5000万-6000万l猪1.5亿-2.0亿一、人工授精技术l液态精液的保存依保存温度可分为：常温保存（15-25）低温保存（0-5）l冷冻精液的保存温度为-196一、人工授精技术l2.3输精技术输精技术l输精前的准备：凡是接触精液及母畜生殖道的器械使用之前均须洗涤干净并作消毒灭菌处理。l精液的准备：用于输精的精液必须按常规进行品质检查，符合AI输精标准。l输精母畜的准备：经发情鉴定需要的母畜，一般均采用站立保定。l输精方法：牛一般采用直肠把握法，而羊均采用开膣器输精法。一、人工授精技术l3、人工授精技术的发展前景1)建立精液基因库2)普及和研究各种动物的AI技术3)冷冻精液的生产和使用应规范化4)加强精液冷冻保存的基础研究二、二、MOET技术技术Multiple ovulation and Embryo TransferMultiple ovulation and Embryo Transfer超数排卵与胚胎超数排卵与胚胎移移l 胚胎移植胚胎移植又称为受精卵移植，它的简单含义是：从一头母畜（供体）的输卵管或子宫内取出早期胚胎，移植到另一头母畜（受体）的输卵管或子宫。“借腹怀胎”，以达到产生供体后代的目的。l 基本过程包括:供体(donor)和受体(recipient)的选择、供体的超排处理及配种、受体同期发情处理、胚胎回收、检卵和移植。二、二、MOET技术技术l历史研究历史研究：二、二、MOET技术技术l1、供体和受体的选择、供体和受体的选择l1.1供体的选择1)首先要考虑其经济价值,只有具有高生产性能的牛才可做为供体2)供体牛具有稳定的遗传能力,没有遗传疾病,繁殖机能 旺盛,体质健壮没有任何传染疾病,发情周期正常,发情症状明显,没有流产史和其它一些繁殖机能疾病。3)年龄选择在15个月龄到10岁以内的供体牛,老龄、太肥、太瘦、长期空怀的母牛不能使用。两次超排处理反映不良的不能使用。4)分娩6个月以内、3个月以上的母牛繁殖机能旺盛,可以做为主要的供体牛选择对象。二、二、MOET技术技术l1.2受体的选择1)受体牛一般选用价格低廉的土种牛2)拥有两个以上正常的发情周期,无繁殖疾病,体格健壮,耐病性良好,哺育犊牛能力强3)体格标准,符合品种要求4)分娩后60天以上的母牛。二、二、MOET技术技术l2、供体的超排处理及配种、供体的超排处理及配种l2.1供体的超排处理l(1)+法:l 根据供体牛体重的大小,在发情后912天肌注25003500,48小时后肌注或宫注2,48小时后观察母牛发情情况,在发情后18小时肌注与等量的,并同时进行人工授精,时隔12小时再输精一次。缺点是供体牛个体反映变异范围较大。二、二、MOET技术技术(2)法:天数时间超排处理天数时间超排处理第1天早8:00放CIDR第11天早8:00肌注FSH 2ml，PG 4ml晚8:00晚8:00肌注FSH 2ml，PG 4ml第9天早8:00肌注FSH 2.5ml第12天早8:00肌注FSH 2ml，撤CIDR晚8:00肌注FSH 2.5ml晚8:00肌注FSH 2ml第10天早8:00肌注FSH 2ml第13天早8:00发情观察、配种晚8:00肌注FSH 2ml晚8:00发情观察、配种第14天早8:00发情观察、配种第14天冲胚（加拿大FSH340）晚8:00 发情观察、配种二、二、MOET技术技术l2.22.2人工授精人工授精l 两次授精,以增加获得受精卵母细胞的机会。动物一般在停药后24-48h内有95%的母畜均表现发情。一般上、下午各输1次,因母畜为超排处理.有多个卵子排出，而需加大输精量.用原精的0.2 ml(含4亿精子)/次。如第二次授精时供体牛仍处于发情状态,则须在812h后再进行第三次授精。二、二、MOET技术技术l3、受体同期发情处理、受体同期发情处理l 同期发情是利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法,也称同步发情。l 当前常用的激素药物有PMSG、GnRH、LHRH、FSH、LH、hCG、PGF2、P4及类似物等。在牛上常用二次PGF2,一般注射后36-48h,有45%60%母牛均表现发情。二、二、MOET技术技术l4、胚胎的收集胚胎的收集l 目前在牛上常用非手术采集胚胎。用专用的二通或三通硅胶管制品前端有一气囊。冲气后阻止冲胚液流出。l 冲胚液大多用杜氏磷酸缓冲液(PBS)加5%一10%牛血清白蛋白(BSA)也有加TCM-199的组织培养液的。l 胚胎采集方法以发情日为第0d,在第7d以手术子宫冲洗法采集胚胎。在此时期,胚胎朝向子宫推进。当冲胚时,将特地配制的冲卵液经导管注入子宫,如此则子宫内的胚胎都集合于冲胚液中,随后再导出于贮液器内,并保存在37条件下,尽量减少体外环境,如温度和灰尘等不良因素的影响。二、二、MOET技术技术非手术采集胚胎非手术采集胚胎二、二、MOET技术技术胚胎的收集胚胎的收集二、二、MOET技术技术l5、胚胎检测胚胎检测 l在显微镜根据胚胎的形态,将胚胎分为四级：lA A级级:胚胎形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,结构紧凑,色调和透明度适中,无附着的细胞和液胞;lB B级级:轮廓清晰,色调和细胞密度良好,可见到少量附着的细胞和液胞,变性细胞约占10%30%;lC C级级:轮廓不清楚,色调发暗,结构较松散,游离的细胞和液胞较多,变性细胞约占30%50%;lD D级级:轮廓模糊,色调暗,结构松散,碎片细胞和液胞很多,变性细胞约占50%80%。二、二、MOET技术技术八八细细胞胞二二细细胞胞四四细细胞胞十十六六细细胞胞二、二、MOET技术技术桑椹胚桑椹胚囊胚致密桑椹胚致密桑椹胚二、二、MOET技术技术正在孵化的胚胎正在孵化的胚胎有空泡的退化胚胎有空泡的退化胚胎二、二、MOET技术技术l6、胚胎移植胚胎移植l 受体牛在发情后68天之间均可进行移植。移植前对受体进行直肠触摸,检查黄体是否合格。合格受体实行12尾椎间硬膜外麻醉,擦拭外阴部。对照胚龄和受体牛发情阶段,选择适宜的胚胎,将胚胎(冻胚解冻后)装入0.25ml麦管,麦管装入移植枪,将胚胎移植到有黄体一侧子宫角小弯处。二、二、MOET技术技术羊手术移植牛非手术移植三三、IVP技术In Vitro Embryo Production胚胎体外生产技术l主要技术环节包括：OPU-IVM-IVF-IVC-ETl卵母细胞获取：屠宰场或活体采卵（OVUM PICK-UP,OPU）l卵母细胞体外成熟（IN VITRO MATURITION,IVM）l精子体外获能（IN VITRO CAPACITITION OF SPERMOTOZA）l体外受精（IN VITRO FERTILIZATION,IVF)l体外培养（IN VITRO CULTURE）IVP技术 是指雌雄配子在体外认为操作条件下完成成熟、获能和受精并发育成可移植胚胎的过程。是动物胚胎工程的一项重要技术。人们通过长期研究，已深刻了解到子宫和输卵管的环境，可以模拟该环境建立体外受精条件，从而使卵子和精子在体外能完成受精。这项技术不仅对揭示卵母细胞成熟和受精机理具有重要的理论意义，而且对畜牧业的发展具有广泛的应用前景。三三、体外受精技术l历史研究：l 哺乳动物体外受精研究已有一百多年历史，自1959张明觉首先把体外受精的兔受精卵移植给受体母兔获得世界上第一个“试管哺乳动物”以来，体外受精技术逐步完善，已相继在30余种哺乳动物上获得成功。三三、体外受精技术l体外受精技术包括四个主要步骤及路线：体外受精技术包括四个主要步骤及路线：l卵母细胞体外成熟（IVM)l精子体外获能（capacitation）l体外受精（IVF)l早期胚胎发育（IVC）三三、体外受精技术体体外外受受精精主主要要技技术术路路线线三三、体外受精技术l1、精子体、精子体外获能（外获能（capacitation）l定义：定义：哺乳动物的精子在刚射入雌性生殖道时,或从附睾取出时,并不具备受精能力,必需在雌性生殖道内经过一段时间,发生生理及形态学的变化才能获得受精能力,这一现象是被美籍华人科学家张明觉和澳大利亚科学家Austin发现的,后来被Austin称为精子获能(Sperm capacitation)三三、体外受精技术精子获能机制：1)有能力到达卵母细胞并穿过透明带;2)有能力进行获能和顶体反应;3)成熟过程中获得的蛋白结合位点，能适时暴露给卵母细胞以结合透明带;4)可以与卵母细胞膜融合并且将遗传物质注入到卵子的细胞质中。精子通过附睾时已经获得上述大部分能力。三三、体外受精技术l精子体外获能一般分为两步：l一是精子的洗涤：l 经一次或多次离心后除去杂质、精清、死精子、低活力的精子、冻精保护液及稀释液等;l二是精子的获能处理：l 主要是使用高离子强度液，钙离子载体，肝素和BSA等，以促使Ca2+进入精子顶体并刺激精子内部pH升高，从而诱发精子获能。三三、体外受精技术l2、卵母细胞体外成熟（、卵母细胞体外成熟（IVM)l 卵母细胞体外成熟是哺乳动物体外受精技术的关键步骤之一,它直接关系到体外受精技术的成功与否。l 卵母细胞在体外条件下，可自发地完成核成熟，并且可以明显地观察和记录。为了提高卵母细胞在体外成熟的效率，研究者们研究了许多与卵母细胞体外成熟相关的因素：三三、体外受精技术l2.1卵母细胞类型卵母细胞类型l一般以卵母细胞周围卵丘细胞形态对卵母细胞进行分类：lA 类:由致密多层卵丘细胞层包裹的卵母细胞;lB 类:卵丘细胞层不完全的卵母细胞;lC 类:完全裸露的卵子;lD 类:卵丘细胞层呈蜘蛛网状附着的卵母细胞。l 其中A、B类卵母细胞胞浆均匀并充满于透明带内，在IVM中一般选用这两类卵母细胞作为体外培养的对象。三三、体外受精技术卵母细胞类型卵母细胞类型Required Factors For Oocyte Growth In VitroCulture System Mammalian Oocyte三三、体外受精技术l2.2基础培养基基础培养基l目前，在卵母细胞的基础培养体系中的最为广泛的是TCM199，其缓冲体系以Hepes或碳酸氢盐(Earles salts)为好，磷酸盐缓冲系(Hanks)较差。应用TCM199对牛、猪、绵羊、山羊的卵母细胞进行体外培养依据实验设计及条件等多方面的影响，均有60%90%的成熟率。三三、体外受精技术l2.3基础培养体系的添加物基础培养体系的添加物l 现在研究者一般都通过向成熟培养液中添加一种或几种适当的成分，如激激素素、血血清清、卵卵泡泡液液、生生长长因因子子及颗颗粒粒细细胞胞等，以模拟卵母细胞体内成熟时的环境及各种成分间的相互作用，改善体外培养条件，达到获得正常受精率和发育率的目的。三三、体外受精技术l2.4其他因素其他因素l卵巢所处性周期的影响 l年龄的影响l卵巢运输时间和温度的影响 l不同季节的影响l卵母细胞成熟培养温度和时间的影响l水质的影响 三三、体外受精技术l2.5卵母细胞成熟的特征卵母细胞成熟的特征 l染色体凝集（GVBD）l第一极体排出l透明带软化l卵丘细胞扩展 成熟的卵母细胞成熟的卵母细胞三三、体外受精技术l2.6亟需解决的问题亟需解决的问题l 目前亟需解决的问题是卵母细胞核质成熟同步化。减数分裂的完成标志着卵母细胞核的成熟。而卵母细胞质的成熟不仅有细胞器超微结构的改变，而且还发生了诸多、渐变的细胞质内部的生理生化变化。l 卵母细胞体外成熟的核心问题是如何实现核质成熟的同步化。体外核成熟完成并不能保证细胞质的正常成熟，细胞核和细胞质的成熟具有协调性。三三、体外受精技术l3、体外受精（、体外受精（IVF）l 成功的体外受精不仅依赖卵母细胞的成熟和精子的获能,而且精子浓度、精卵相互作用时间、培养液和温度也是重要的影响因素。三三、体外受精技术l3.1精子浓度精子浓度l 在IVF中精子密度通常为0.5106-5.0106/ml。受精过程一般在石蜡油或硅酮油覆盖下的微滴中进行，微滴以50100l为宜。l 密度超过1.6106个/ml则多精受精现象增加。三三、体外受精技术l3.2精卵相互作用时间精卵相互作用时间l 精卵作用时间与受精体系有关，BO液中需68h，而TALP中则需1824h，时间太短受精率下降，时间太长则多精受精数增多。精卵共同孵育不足16h则会降低受精率。三三、体外受精技术l3.3受精液和温度受精液和温度l 最常用的牛精子洗涤液为BO液和改良的台氏液（m-Tyrodes，TALP）两大类液。l 培养条件是5%CO2的空气、37-38.5、100%的相对湿度。三三、体外受精技术l3.4多精受精多精受精l 长期以来多精子受精问题一直是体外受精的一个难点。(尤其在猪)据研究分析其卵子在体外受精时不能有效地阻止多精子穿入的主要原因,是体外受精卵子分泌的皮质颗粒,在卵黄隙之间不能象在输卵管内那样很好的扩散。l 所以,如何使体外受精环境更类似于体内,还有待于进一步探讨。三三、体外受精技术l4、早期胚胎体外发育（、早期胚胎体外发育（IVC)l 受精卵须在培养液(或输卵管)中发育到桑椹胚或囊胚后移植到受体,才能获得较高的妊娠率。l早期胚胎体外发育中的主要问题：l早期胚胎体外发育培养系统l早期胚胎体外发育阻滞 三三、体外受精技术l4.1早期胚胎体外发育培养系统早期胚胎体外发育培养系统l 目前，体外早期胚胎培养系统可以分为两种：即合成液培养系统和共同培养系统。l 合成培养系统l 利用成分确定的合成培养液，如TCM199，CRlaa或SOF等，添加血清、BSA、维生素、氨基酸、抗氧化剂等物质。该系统成分明确，便于研究胚胎发育过程中每一种物质对胚胎的作用机制，有助于了解胚胎早期发育的机理，但桑椹胚和囊胚发育率不高。三三、体外受精技术l 共同培养系统l 利用体细胞在体外与受精卵共同培养，促进胚胎发育，可以获得较高的囊胚发育率。目前用于共同培养的体细胞主要有：输卵管上皮细胞（BOEC）颗粒/卵丘细胞（GCs），子宫内膜细胞，成纤维细胞和水牛大鼠肝细胞（BRL）等。其中以颗粒细胞，输卵管细胞共培养应用最为普遍。三三、体外受精技术l4.2早期胚胎发育阻滞早期胚胎发育阻滞l 早期胚胎发育阻滞是一个普遍存在的现象，与胚胎基因组的启动或激活密切相关。因动物种类不同，早期胚胎发育阻滞时间有所差异。牛和绵羊发生在816细胞期;兔发生在16细胞期;人发生在48细胞期。三三、体外受精技术l目前，克服早期胚胎发育阻滞主要采用以下三个方法:1)改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足胚胎发育物质需求，确定并消除对发育不利的因素;2)利用与体细胞或体细胞条件液共同培养，以提供胚胎发育所需的物质条件。3)利用临时中间受体,即把体外受精卵放入结扎的中间受体兔或绵羊的输卵管中,培养至桑椹胚或囊胚,再移植到受体或冷冻保存。三三、体外受精技术l体外受精技术的应用前景：l 通过卵母细胞体外培养成熟和体外受精，可望获得大量体外生产的胚胎;l利用体外受精技术，可说不定家畜精子的质量，了解精子受精潜力;l通过体外受精程序，可研究无法从体内观察到的配子发育、成熟、获能和受精等一系列受精生物现象，具有重要的科学意义;l与其他胚胎工程技术相结合，会加快动物繁殖和育种的进程;l在拯救濒危动物和开发珍稀动物方面也具有实际的应用价值。四、胚胎工程技术 Embryo Bio-engineeringl胚胎工程是胚胎移植的延伸技术发展到一定程度而出现的名词，又称为胚胎生物工程（embryo bio-engineering)。这些技术自20世纪80年代以来，赋予了胚胎移植技术以更大的活力与发展潜力。l其主要技术有：胚胎及卵母细胞冷冻保存、胚胎分割、性别鉴定、细胞核移植和基因导入等。以下就对其方法做简要介绍:四、胚胎工程技术l1、胚胎及卵母细胞冷冻保存技术、胚胎及卵母细胞冷冻保存技术l 胚胎及卵母细胞冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎或卵母细胞在-196的条件下停止代谢，而升温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存胚胎和卵母细胞的技术。l 对卵母细胞冷冻保存的研究，可分为卵巢卵母细胞和输卵管卵母细胞两个方面。四、胚胎工程技术卵母细胞冷冻装管四、胚胎工程技术l1.1冷冻方法冷冻方法1)慢速冷冻法：慢速冷冻法：使用渗透性较慢的低温保护剂,一般以低于1/min的速度降温到-30-80,再投入液氮;解冻速度不超过25/min2)快速冷冻法：快速冷冻法：这是将胚胎部分脱水后以高于1250/min的速度快速冷冻胚胎的方法。3)一步细管法：一步细管法：一步细管法就是胚胎解冻后,不需脱除保护剂而直接移植的方法。4)玻璃化法：玻璃化法：1995年Rall开发了玻璃化冷冻法.该法采用约7mol/L的抗冻保护剂，将在0以上的抗冻保护液中平衡后的胚胎直接投入液氮中保存。四、胚胎工程技术l1.2冷冻保护剂及选择原则l冷冻保护剂可分为四类：冷冻保护剂可分为四类：1)低分子量可渗透性保护剂：如甘油、乙二醇、二甲基亚砜(SMSO)等。2)低分子不可渗物质：如海藻糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖等。3)大分子保护剂：如聚乙烯吡咯()、聚乙烯醇()等。4)混合保护剂:如甘油和乙二醇、甘油和丙二醇、丙二醇和乙二醇、乙二醇和二甲基亚砜()等,再辅以糖类。l低温保护剂的选择原则：低温保护剂的选择原则：1)使胚胎在降温和复温过程中损伤降至最低,解冻后成活率高;2)便于洗脱,对胚胎无毒或低毒;3)价廉易得四、胚胎工程技术l2、胚胎分割技术、胚胎分割技术l 胚胎分割(embryo cutting)是80年代发展起来的一种胚胎生物学新技术,它借助于显微外科手术或徒手操作方法,切割早期胚胎(2分,4分)制造同卵多仔后代。迄今为止,该技术已在小鼠、家兔、绵羊,山羊,牛等动物试验成功。1985年德国不莱梅吕凯尔奶牛胚胎移植站切割奶牛胚胎39枚,将其78枚半胚移植受体,44头受体怀孕成功,成功率56.4%,其中有15头孪生犊牛。四、胚胎工程技术l胚胎分割的方法：胚胎分割的方法：l 胚胎分割的方法有多种,用于致密桑椹胚之后的胚胎方法可归纳为五类:1)显微玻璃针去带分割法：显微玻璃针去带分割法：在显微操作仪下,一臂固定吸住胚胎,另一臂用显微玻璃针摘除透明带并将裸胚对半分割。2)显微手术刀直接分割法：显微手术刀直接分割法：在显微操作仪下,一臂固定吸住胚胎,另一臂用特制的显微手术刀直接将胚胎分割为二分胚。四、胚胎工程技术四、胚胎工程技术3)酶消化透明带显微玻璃针分割法：酶消化透明带显微玻璃针分割法：先用含0.5%链酶蛋白酶的Hanks液孵育胚胎,得到裸胚,然后用显微手术刀将其一分为二。4)酶酶-机械去带分割法：机械去带分割法：在用酶软化透明带的基础上,用一支玻璃管除去透明带,然后用显微手术刀将裸胚分割为二。5)徒手刀片分割法：徒手刀片分割法：一般在胚胎分割前,先用0.25%的链酶蛋白酶软化1min,用2%的洗2次,作成0.2ml小滴,使用专用小刀片或自制刀片徒手将胚胎一分为二,或直接切割胚胎为二分胚。四、胚胎工程技术l3、性别鉴定技术、性别鉴定技术(sexingofembryo)l胚胎性别鉴定技术是指依据胚胎中存在的染色体类型、雄性胚胎中X染色体相差酶的活性、雄性胚胎存在的H-Y抗原以及SRY基因等特征对附植前胚进行性别鉴定。四、胚胎工程技术l目前胚胎性别鉴定主要采用四种研究方法：1)细胞学方法：细胞学方法：主要是通过核型分析对胚胎进行性别鉴定;2)生物化学方法：生物化学方法：通过测定与X染色体相关的酶活性来鉴定雌性胚胎的一种方法;3)免疫学方法：免疫学方法：利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，从而进行胚胎性别鉴定的一种方法;4)分子生物学方法：分子生物学方法：从胚胎取下少量细胞，将其DNA与Y染色体特异标记的DNA序列（探针）杂交，杂交结果如为阳性，则胚胎雄性，反之，则为雌性。四、胚胎工程技术四、胚胎工程技术l细胞核移植技术细胞核移植技术l细胞核移植技术是通过显微操作和细胞融合的方法,将单细胞核供体(卵裂球或体细胞的核)移入去核的胞质受体(卵母细胞或受精卵)中,构成重组胚,再对重组胚进行激活、培养和移植,最后产生1个与核供体亲本基因型相同的后代的过程。四、胚胎工程技术l细胞核移植技术有两种：lMcGrath-Solter的一步法：采用磨斜再拉尖的去核吸管，刺透供核卵的透明带，直接吸取细胞核，然后再以同样方法，将核移入去核的受核卵的卵周隙中lTsunoda等的两步法：用微细玻璃针切开供核卵和受核卵透明带的一部分，然后再插入钝圆的吸管，吸出供核卵细胞核，并移入受核卵中。l目前在哺乳动物核移植中多采用电融合法，效果较好。四、胚胎工程技术l细胞核移植技术的方法是：细胞核移植技术的方法是：1)供体核的获得：供体核的获得：可以是早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞2)受体细胞的获得及其去核：受体细胞的获得及其去核：去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎3)核卵重组核卵重组：在显微操作仪操纵下,用一直径接近卵裂球大的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球,注入去核的受体卵母细胞的间隙中,根据移入的部位不同,可分为带下移植和细胞质内注射。四、胚胎工程技术4)融合与激活：融合与激活：将注入卵裂球的去核和电融合液移入电融合槽进行融合5)重构胚的培养与移植：重构胚的培养与移植：按各种动物的胚胎培养方法培养与移植。Courtney L.RileyCloning LivestockHistory of Nuclear Transferl1901 Hans Spemann 2 cell embryo=2 tadpolesl1938 Hans Spemann proposed cloning with adult cellsl1952 Robert Briggs and Thomas King clone frog,rana pipensHistory of Nuclear Transferl1979 Steen Willadsen embryo splitting to produce sheep and cattle l1981 Karl Illmensee and Peter Hoppe clone mice l1986 Steen Willadensen clones sheep l1987 Randy Prather clones cattle lLimitations:Limited numbers possible and clones are unprovenHistory of Nuclear TransferlSomatic cell cloning with adult cells,1997 Dolly with Ian Wilmut History of Nuclear TransferWakayama et al.1998Shin et al.2002Meng et al.1997 Baguisi et al.1999 Polejaeva et al.2000 Chesne et al.2002 Nuclear TransferlEnucleation of donor oocytelTransfer somatic cell from animal to be cloned to enucleated oocytelFusion of somatic cell to cytoplasm via electrical pulselActivation of oocyte somatic cell complex lCulture embryo to blastocyst stage then transfer to synchronized recipient Nuclear TransferTraditional MethodThe Piezo Method is an alternative.It requires lysis of the donor cell then recovery of nucleus for transfer to enucleated oocyte.Why Clone?lProduce Sets of Genetically Superior AnimalsDesired Sex Disease resistance Improved Production Ease of Management Improved ProfitslUniformity of Crop and Improved Herd Management Nutrition Health Reproduction MarketingGenetically Engineered LivestockDisease Resistance and Heat ToleranceHigh Nutritional EfficiencyMilk production High level of production Milk produced has better chemical characteristics Improving the digestibility and nutritional properties Production of oral vaccines and biopharmaceuticalsXenotransplants andDisease ModelsModification of Muscle MassHigh Reproductive Capacity KNOCK OUT-Disrupt gene function KNOCK IN-Replace gene with another 1231selectablex x 1selectable33Gene TargetingE EES cell ScellScellTargeting VectorCell with one targeted locusSelectionCreating Genetic ModificationsElectroporationDr.Karen Moore Using the lab micromanipulatorMicromanipulatorUsed for enucleation and cloningChallenges in CloninglInefficiencies in nuclear transfer embryo productionlFusion 60-90%lEmbryo development 20%lEarly embryonic and fetal losslLarge Offspring Syndrome and DystociaLarge Offspring SyndromelExtended gestationlEnlarged birth weight(8-50%)lDystocia resulting in Caesarian sectionlHigh prenatal losslPostnatal weaknesslHypoxia,hypothermia,hypoglycemialHigh plasma insulin(up to 4 times higher than normal)lIncreased muscle mass,oversized organs,skeletal malformationslPlacental abnormalitiesLarge Offspring SyndromeNormal Bovine PlacentaAbnormal Bovine PlacentaAborted CloneLarge Offspring SyndromelPossible Causes includelIn vitro culture systemslAsynchronous transferlIncreased maternal progesterone levels during first six days of pregnancylImprintedgenesBeckwith-Wiedemann SyndromelLarge newborn lLarge,protruding tongue and prominent eyes lPinna abnormalities and low set earslAbdominal wall defect:umbilical hernia or omphalocelelLow blood sugar or hypoglycemialEnlargement of some organs and tissues Prader-Willi SyndromelSkeletal and limb abnormalitieslSmall size for gestational agelAlmond-shaped eyes and narrow bifrontal skull lSmall hands and feet compared to bodylSlow mental development lGrowing child exhibits slow mental and increasing obesityGene ImprintinglEpigenetic regulation of gene expressionlGenes in which expression is dependent upon parent of origin lPlay key roles in fetal growth and developmentlIGF-2 and its receptor are both imprinted genes that impact fetal developmentlFetal overgrowth is associated with over expression of IGF-IIImprinting MechanismslMethylation can silence genes by:linducing DNA folding=heterochromatinlinhibiting transcription factor binding or recruitment of other proteins which inhibit transcription factor bindinglInactive allele is replicated later in the cell cycleImprintinglIGF-2 paternally expressedlH19 maternally expressedlImprinted allele is silencedConclusion lFuture uses of cloning will include the use of transgenesis and gene targeting to improve production traits in cattlelCurrent research around the world should improve cloning efficiencies to make this technology economically feasible to all cattlemenAnimal CloningMelissa Schultz And Sally Dean DollylIn 1997,first viable offspring derived from differentiatedcells of an adult.lThis was achieved by nuclear transferl Dolly was genetically identical to the donor ewe.How is it Done?So:Science Explainedwww.synapses.co.uk/science/Gene the cloned calfAugust 1997lUsed primordial stem cells from 30-day old calf fetuslHow is this different than Dolly?lPossibilities of using cloned cattle to improve meat anddairy qualityCc:lThe first successful companion animal clone-paving the way for commercial pet cloninglCloned in the same way as Dolly but instead using cumulus and fibroblast cells of an adult female donorlCoat color not exactly like donor but genetic material isCommercial Pet CloninglGenetic Savings and Clone-company advertising cloning of pets-Price list for skin sample storage:$895 for standard service and$1395 foremergency servicelTexas A&M-estimated cost of$250,000 for a pet cloneMissyplicity ProjectlGSC along with Missys wealthy owners are funding this projectlSame researchers that cloned Cc are working on this projectlIf successful,this will be the first dog clonelDog cloning will be more difficult than cat.Why Clone?lFOOD ANIMALS(Ruminants)lIncrease quality and consistency of milk and meat productslHuman pharmaceutical interest-transgenic animals yield human proteinsWhy Clone?lFOOD ANIMALS(Pigs)lPotential for being a hot commoditylXenotransplantation into human recipients-Transgenic pig organs will hopefully have less of an effect on the human immune system.lParkinsons DiseaseWhy Clone?lCatslResearch Human AIDS using the feline AIDS(FIV)as a model.lPoultrylCurrently developing a method to clone poultry eggsWhy Clone?lGoats-Spider Silk ProteinlRabbits-Valuable for studying human cardiovascular diseaseWhy Clone?lPrimates(Non-Human)lNot a practice run for human cloninglGoal is to create identical animals to study human diseases(ex.Hepatitis)Why Clone?lEndangered Species lResearchers in China are trying the cloning method on the Giant Panda.What mammals have been cloned thus far?lIn order of cloning difficulty1.Others:cat and primate-most challenging 2.Goat 3.Pig4.Cow 5.Mouse6.Sheep furthest developmentProblems with CloninglThere is a major efficiency problem in all cloning procedures.lIn Ccs case:-188 fertilized eggs that underwent nuclear transfer.-Of those,82 cloned embryos were successfully implanted-Of those 82 cloned embryos,we only got Cc!lThere are hundreds of attempts for every animal clonedProblems with CloninglEfficiency rate is less than 2%lNuclear transferFertilizationEmbryodevelopmentEmbryo implantPregnancy Birth Life after birthlSomething can go wrong at any of these steps.Problems with CloninglCows-Large Calf Syndrome,“Granada Ghost”-lethal potassium levelslPigs-embryos are extremely fragile-must have at least 4 fetuses per uteruslResearchers are having a difficult time with the cats and primates as well.Problems with CloninglResearchers have turned back to the drawing board.-DNA retrograde growth into the inactivated state.lCurrently putting genes randomly into the genomes.-lengthy process of gene targeting decreases the chance of division.lResearchers arent sharing information.Ethical/Moral IssueslReligious and political concernslNABC-National Bioethical Advisory Commission-religious lobbyists-strong and influential opponent to cloninglUS ban on human cloning research-Clinton,1997-also banned human embryo researchEthical/Moral IssueslLong term effects of cloning?-Dolly has shown signs of premature aging(arthritis).lPets-already have animal overpopulationEthical/Moral IssueslWhat if they are able to clone outstanding racehorses?lWill this take away any competition?Triple Crown WinnerSecretariatConclusionlLots of benefits and pitfalls to cloning.lMake your own decision!WebsiteslGenetic Savings and Clone:lRoslin Institute:www.roslin.ac.uklMissyplicity Project:Questions?REFERENCESlWilmut,I.,Schnieke,A.E.,et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.Nature.385,810-813.lShin,T.,Kraemer,D.,et al.Cell Biology:A cat cloned by nuclear transplantation.Nature,415,859-861.lPennisi,E.,&Vogel,G.,Clones:A hard act to follow.Science.288,1722-1726.lRuse,M.,&Sheppard,A.,Responsible Science or Technomadness?Cloning.Prometheus Books,Amherst,NY.2001.p1-25.四、胚胎工程技术l5、基因导入（Transgene）l基因导入或转基因是指将体外重组的结构基因导入受精卵，培育出转基因动物（transgenic animal)的技术。整合到动物基因组上的外来结构基因称为转基因，由转基因编码的蛋白质称为转基因产品。四、胚胎工程技术l哺乳动物胚胎基因导入的方法包括：1)显微注射法：显微注射法：最早是由Cordon等1980年建立的。其基本过程是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中,使外源基因整合到受体细胞基因组内,再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育,从而获得转基因动物。2)反转录病毒载体法：反转录病毒载体法：将外源目的基因整合到反转录病毒（RNA病毒）的原病毒上，然后直接注入胚胎，或给动物的培养组织接毒后与胚胎共同培养，使病毒感染胚胎。四、胚胎工程技术3)精子载体法：精子载体法：是将外源目的基因与精子共同培育,再通过电穿孔或脂质体介导等方法将外源基因导入成熟的精子,使精子携带外源目的基因进入卵子中受精,从而使外源基因整合到受体细胞的染色体上。4)胚胎干细胞胚胎干细胞(细胞细胞)转染法：转染法：胚胎干细胞(细胞)是早期胚胎(囊胚期)的内细胞团分离出的没有分化的全能性细胞,这种细胞与胚胎细胞相似,具有无限繁殖和高度分化的潜能。当将胚胎干细胞注入到受体胚胎时,能够参与各种组织、器官的发育,形成嵌合体。当将外源基因转移到细胞中,重新导入囊胚或经筛选后将转入外源基因的细胞进行克隆,可培育出转基因动物。四、胚胎工程技术5)体细胞核移植法：体细胞核移植法：是以动物体细胞为受体,将外源目的基因转移到体外培养的动物体细胞,再将这些体细胞的核移植到去核的卵母细胞中,进行动物克隆,从而获得转基因动物。附录lIVF试验液体的配制试验液体的配制l1、BO原液的配制（原液的配制（50ml）：）：lNaCl：3.2726glKCl：0.149845glNaH2PO42H2O：0.064745glMgCl26H2O：0.05286glCaCl22H2O：0.1654glG：1.37728g（GH2O：3.00148g）lPn：0.0158gl酚红：酚红：0.0050gl定容定容50ml，抽滤抽滤10ml分装，分装，4摄氏度保存用摄氏度保存用1月。月。l2、BO液的配制（液的配制（100ml）：）：lNaHCO3：0.310837gl丙酮酸钠：丙酮酸钠：0.013755g（先溶于水）先溶于水）lBO原液：原液：10ml（90ml水定容）水定容）l3、肝素贮备液：、肝素贮备液：l肝素：肝素：0.001g（浓度：浓度：0.0001g/ml）lBO液：液：10mll1ml分装冷冻保存分装冷冻保存l4、精子洗涤液：、精子洗涤液：lBO液：液：80mll咖啡因：咖啡因：0.15536gl15ml分分装装，用用时时加加0.3%BSA（0.045g）4摄摄氏氏度保存度保存l5、受精液：、受精液：l去脂的去脂的BSA：0.018gl肝素贮备液：肝素贮备液：0.6ml（20微克微克/ml）lBO液：液：2.4mll用用时时加加等等量量的的精精子子洗洗涤涤液液所所以以肝肝素素的的实实际际浓浓度度为：为：10微克微克/mll6、FSH贮备液：贮备液：l FSH：0.005glTCM-199：5mll60微升分装冷冻保存l7、LH贮备液：贮备液：l LH：0.005glTCM-1