第十五章 甾体激素类药物的分析

第十五章第十五章 甾体激素类药甾体激素类药物的分析物的分析第一节第一节基本结构和分类基本结构和分类基本结构基本结构：A环环:多数为脂环，多数为脂环，有有4-3-酮，少数为苯环酮，少数为苯环C3:可能有酮基或烃基可能有酮基或烃基;C10、C13:多数均有角甲基多数均有角甲基少数少数C10上无角甲基上无角甲基Cll:可能有酮基或羟基可能有酮基或羟基;C17:可可能能有有羟羟基基、酮酮基基、甲甲酮酮基基、-醇醇酮酮基基、甲甲基基、乙炔基、乙炔基等等;基本结构：环戊烷骈多氢菲基本结构：环戊烷骈多氢菲分类分类甾体激素甾体激素肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素雄性激素及雄性激素及蛋白同化激素蛋白同化激素性激素性激素孕激素孕激素雌激素雌激素一、一、肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素(简称皮质激素简称皮质激素)如氢化可的松、曲安西龙、醋酸地塞米松等。如氢化可的松、曲安西龙、醋酸地塞米松等。结构特点：结构特点：具有具有2121个个C C原子原子 A A环环:具有具有4 4-3-3-酮基酮基 C C1717:具有具有-醇酮基并醇酮基并多数有多数有-羟基羟基 C10 C10、C13:C13:具有角甲基具有角甲基 C11:C11:具有羟基或酮基具有羟基或酮基具有紫外吸收具有紫外吸收氢化可的松氢化可的松肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素醋酸地塞米松醋酸地塞米松C1、C2和和C4、C5之间双键之间双键9抗炎作用增强抗炎作用增强16羟基形成醋酸酯，肌注时可延长作用时间羟基形成醋酸酯，肌注时可延长作用时间二、雄性激素及蛋白同化激素二、雄性激素及蛋白同化激素 雄雄性性激激素素：睾睾酮酮的的衍衍生生物物，如如甲甲睾睾酮酮、丙丙酸酸睾酮、十一酸睾酮等睾酮、十一酸睾酮等 蛋白同化激素有苯丙酸诺龙蛋白同化激素有苯丙酸诺龙 结构特点：结构特点：雄雄性性激激素素母母核核有有1919个个C C原子原子 蛋蛋白白同同化化激激素素母母核核有有1818个个C C原子原子 AA环环:具有具有4 4-3-3-酮基酮基C17:C17:无无侧侧链链，多多数数是是一一个个羟羟基基，有有些些是由它形成的酯是由它形成的酯具有紫外吸收具有紫外吸收雄性激素：雄性激素：丙酸睾酮丙酸睾酮蛋白同化激素：蛋白同化激素：苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙Cl0Cl0上无上无角甲基角甲基三、孕激素三、孕激素 黄体激素或孕酮。典型药物为黄体酮。黄体激素或孕酮。典型药物为黄体酮。中中国国药药典典收收载载有有:黄黄体体酮酮、醋醋酸酸甲甲地地孕孕酮原料及制剂等。酮原料及制剂等。结构特点：结构特点：母母核核具具有有2121个个C C原原子子;AA环环:具具 有有 4 4-3-3-酮酮基基C17:C17:具具有有甲甲酮酮基基，有有些些具具有有-羟羟基基，与与醋醋酸酸、己己酸酸等等形形成酯成酯黄体酮黄体酮醋酸甲地孕酮醋酸甲地孕酮四、雌激素（卵泡激素）四、雌激素（卵泡激素）收载有：雌二醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇等收载有：雌二醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇等结构特点：结构特点：母核具有母核具有1818个个C C原子原子;AA环环:为苯环，为苯环，C3C3：具有酚羟基且有些形：具有酚羟基且有些形成了酯或醚成了酯或醚;Cl0:Cl0:无角甲基无角甲基C17:C17:具有具有-羟基，有些羟基，有些烃基形成了酯，还有些具有烃基形成了酯，还有些具有乙炔基。乙炔基。炔雌醇炔雌醇雌二醇雌二醇第二节第二节 鉴别试验鉴别试验一、物理常数的测定：熔点、比旋度、吸收系数等一、物理常数的测定：熔点、比旋度、吸收系数等二、化学鉴别法二、化学鉴别法（一）与强酸的呈色反应（一）与强酸的呈色反应 许许多多甾甾体体激激素素（母母核核）能能与与硫硫酸酸、磷磷酸酸、高高氯氯酸酸、盐盐酸酸等等呈呈色色，其其中中以以与与硫硫酸酸的的呈呈色色反反应应应应用用较广。较广。甾体激素甾体激素类药物类药物呈色呈色H2SO4H3PO4HClO4HCl与硫酸显色反应与硫酸显色反应显显色色荧光荧光加水稀释加水稀释泼尼松龙泼尼松龙深红深红絮状絮状灰灰泼尼松泼尼松橙橙黄黄蓝绿蓝绿炔雌醚炔雌醚橙红橙红黄绿黄绿红色红色炔雌醇炔雌醇橙红橙红黄绿黄绿絮状絮状玫红玫红醋酸可的松醋酸可的松黄或微黄或微褪色并澄褪色并澄带橙带橙清清（二）官能团的反应（二）官能团的反应1 1、C17-C17-醇酮基醇酮基肾上腺肾上腺皮质激皮质激素药物素药物呈色呈色四氮唑盐四氮唑盐OH具还原性氧化剂此外还有斐林试此外还有斐林试液、多伦试液液、多伦试液甾酮类甾酮类激素药激素药物物腙腙（黄色）（黄色）羰基试剂羰基试剂2.酮基的呈色反应酮基的呈色反应:C3酮基和酮基和C20酮基酮基常用的羰基试剂：常用的羰基试剂：2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼具有甲酮具有甲酮基或活泼基或活泼亚甲基的亚甲基的甾体激素甾体激素类药物类药物呈色呈色亚硝基铁氰化钠亚硝基铁氰化钠（间二硝基酚、芳香醛）（间二硝基酚、芳香醛）3、甲酮基的呈色反应甲酮基的呈色反应黄体酮黄体酮蓝紫色蓝紫色亚硝基铁亚硝基铁氰化钠氰化钠其他甾体其他甾体淡橙色淡橙色或不显色或不显色专属的鉴别专属的鉴别反应反应有机氟有机氟F有机破坏有机破坏有机氯有机氯Cl4 4、有机卤素的呈色反应有机卤素的呈色反应茜素氟蓝茜素氟蓝硝酸亚铈硝酸亚铈硝酸硝酸硝酸银硝酸银AgCl呈色呈色5 5、酚羟基的呈色反应、酚羟基的呈色反应雌激素雌激素类药物类药物红色偶红色偶氮染料氮染料重氮苯磺酸重氮苯磺酸含炔基的含炔基的甾体激素甾体激素银盐沉淀银盐沉淀硝酸银硝酸银6、乙炔基的沉淀反应乙炔基的沉淀反应三、制备衍生物测定其熔点三、制备衍生物测定其熔点 与一些试剂反应生成与一些试剂反应生成酯、肟、缩氨脲酯、肟、缩氨脲 利利用用醇醇制制碱碱液液水水解解甾甾体体酯酯类类生生成成相相应应的母体，然后测定其熔点进行鉴别。的母体，然后测定其熔点进行鉴别。本本法法虽虽繁繁琐琐费费时时，但但专专属属性性强强，目目前前仍为一些国家药典采用。仍为一些国家药典采用。盐酸氨基脲盐酸氨基脲盐酸氨基脲盐酸氨基脲苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙缩氨基脲衍生物缩氨基脲衍生物1.缩氨基脲的生成缩氨基脲的生成m.p.约约182（分解）（分解）2.酯的水解酯的水解丙酸睾酮丙酸睾酮碱性条件碱性条件睾酮睾酮m.p.为为150150156四、紫外分光光度法四、紫外分光光度法 分分子子中中有有，不不饱饱和和酮酮、苯苯环环和和其其他他的的共共轭轭结结构构，在在紫紫外外光光区区有有特特征征吸吸收收-3-酮酮240nm苯环苯环280nm曲安息龙曲安息龙丙酸倍氯米松丙酸倍氯米松 溶剂溶剂甲醇甲醇乙醇乙醇20g/ml20g/ml浓度浓度20g/ml20g/ml结果判断结果判断在在238nm238nm处有处有最大吸收最大吸收在在在在239nm239nm239nm239nm处有最大处有最大处有最大处有最大吸收，吸收，吸收，吸收，A A A A为为为为 0.570.570.570.570.600.600.600.60，在，在，在，在239nm239nm239nm239nm与与与与263nm 263nm 263nm 263nm 处的吸收度比值为处的吸收度比值为处的吸收度比值为处的吸收度比值为2.252.252.252.252.452.452.452.45五、红外分光光度法五、红外分光光度法 甾甾体体激激素素类类药药物物结结构构复复杂杂，红红外外吸吸收收光光谱谱是是 鉴鉴 别别 该该 类类 药药 物物 有有 效效 而而 可可 靠靠 的的 方方 法法 中中国国药药典典 载载的的甾甾体体激激素素原原料料，其其中中大大多多采采用该法鉴别。用该法鉴别。结构特征：酚羟基、结构特征：酚羟基、C C17 17 OHOH C C17 17 乙炔基乙炔基炔雌醇炔雌醇1505cm-13505cm-13300cm-11590cm-13610cm-1酚羟基酚羟基醇羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨苯环的骨架振动架振动六、六、TLC TLC法法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别方法：对照品法方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的要求供试品溶液所显主斑点的颜色颜色和和位置位置与与对照品溶液的主斑点相同。对照品溶液的主斑点相同。炔诺酮炔诺酮TLC图图注意点：注意点：供供试试品品要要作前处理；作前处理；显显色色后后要要立即检视立即检视七、高效液相色谱法七、高效液相色谱法 在在一一定定的的色色谱谱条条件件下下，比比较较甾甾体体激激素素样样品品与与其对照品峰的保留时间进行鉴别。其对照品峰的保留时间进行鉴别。一一般般都都规规定定在在含含量量测测定定项项下下的的高高效效液液相相色色谱谱图图中中，供供试试品品峰峰的的保保留留时时间间应应与与对对照照品品峰峰的的保保留时间一致。留时间一致。第三节特殊杂质检查第三节特殊杂质检查一、其他甾体一、其他甾体1 1、定义、定义 与标示药物结构不同的甾体化合物都称为与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其其他甾体他甾体”其他甾体与甾体激素药物结构相似，也有一定其他甾体与甾体激素药物结构相似，也有一定其他甾体与甾体激素药物结构相似，也有一定其他甾体与甾体激素药物结构相似，也有一定的药理作用而又互不相同的药理作用而又互不相同的药理作用而又互不相同的药理作用而又互不相同.2 2、来源、来源 原料、中间体、异构体、降解产物原料、中间体、异构体、降解产物 3 3、特点、特点 （1 1）可能存在多个甾体杂质）可能存在多个甾体杂质 （2 2）结构类似）结构类似 4 4、方法（具有一定分离能力）、方法（具有一定分离能力）TLC TLC法（主成分自身稀释对照法）法（主成分自身稀释对照法）HPLC HPLC法（不加校正因子的法（不加校正因子的主成分自身稀释对照法主成分自身稀释对照法）、薄层色谱法：中国药典、薄层色谱法：中国药典 (1)(1)薄层板薄层板 ：硅胶硅胶G G板板，硅胶，硅胶254254或硅胶或硅胶254254。(2)(2)供供试试液液和和对对照照液液的的制制备备 ：分分别别用用溶溶剂剂(如如氯氯仿仿-甲甲醇或甲醇或氯仿或丙酮醇或甲醇或氯仿或丙酮)配成一定浓度的溶液。配成一定浓度的溶液。(3)(3)展展开开剂剂系系统统：各各种种不不同同比比例例的的二二氯氯甲甲烷烷-乙乙醚醚-甲甲醇醇-水混合溶剂用得较多，水混合溶剂用得较多，(4)(4)显色剂：显色剂：碱性四氮唑蓝试液，碱性四氮唑蓝试液，硫酸硫酸-乙醇乙醇(2:8(2:8或或1:11:1或或3:7),3:7),20 20硫酸，硫酸，10 10磷钼酸磷钼酸-乙醇液。乙醇液。(5)(5)检出法：检出法：碱性四氮唑蓝试液碱性四氮唑蓝试液 晾晾干干，烘烘分分钟钟放放冷冷，喷喷以以碱碱性性四四氮挫蓝试液，立即检氮挫蓝试液，立即检硫酸硫酸-乙醇乙醇 晾干后，先喷显色剂，再在晾干后，先喷显色剂，再在烘分钟烘分钟 20 20硫酸硫酸 晾干后，先喷显色剂，再在晾干后，先喷显色剂，再在烘分钟烘分钟 10 10磷钼酸磷钼酸-醋酸醋酸 晾干，喷显色剂，在晾干，喷显色剂，在1OO1OO加热加热1010一一l5min,l5min,(6)(6)判定法：按规定的斑点数目和颜色判断判定法：按规定的斑点数目和颜色判断2 2、高效液相色谱法、高效液相色谱法中国药典中国药典(2005(2005年版年版)所列的色谱条件如下所列的色谱条件如下:(1)(1)色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶。色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶。(2)(2)流动相：流动相：各种不同比例的甲醇各种不同比例的甲醇-水混合溶剂。水混合溶剂。(3)(3)检检测测器器：紫紫外外吸吸收收检检测测器器 (241nm(241nm、254 254 nmnm、28 28 nmnm、218 218 nmnm、230 230 nmnm、288 288 nmnm等等，视品种而定视品种而定)。(4)(4)供供试试液液和和对对照照液液的的制制备备：高高浓浓度度者者为为溶溶液液，低浓度者为溶液，低浓度者为溶液。(5)(5)判判定定法法：溶溶液液显显示示的的杂杂质质峰峰数数不不得得超超过过1 1个个或或数数个个;各各杂杂质质峰峰面面积积或或其其总总和和不不得得大大于于溶溶液液主峰面积的一定分数。主峰面积的一定分数。即即按按各各药药品品项项下下规规定定的的杂杂质质峰峰的的数数目目和和面面积积的的要求进行判定。要求进行判定。例如，黄体酮中例如，黄体酮中 其他甾体其他甾体 的检查方法如下的检查方法如下:取取本本品品适适量量，精精密密称称定定，以以甲甲醇醇为为溶溶剂剂，配配制成制成8mg/lm18mg/lm1的溶液的溶液与与0.02mg/lml0.02mg/lml的溶液的溶液。用用含含量量测测定定项项下下的的方方法法和和溶溶液液，取取5u15u1注注入入液液相相色色谱谱仪仪，调调整整仪仪器器灵灵敏敏度度，使使主主成成分分峰峰高高度度达记录仪的满标度。达记录仪的满标度。再分别取溶液再分别取溶液和和各各10 u110 u1进样。进样。记录色谱图至主成分峰保留时间的记录色谱图至主成分峰保留时间的1.51.5倍。倍。溶溶液液显显示示的的杂杂质质峰峰数数不不得得超超过过1 1个个，其其面面积积不得大于溶液不得大于溶液主峰面积的主峰面积的3/43/4。图图A A中峰中峰1 1面积的四分之三面积的四分之三二、硒的检查二、硒的检查 来源来源 合成中用二氧化硒合成中用二氧化硒(SeO(SeO2 2)脱氢脱氢毒毒方法方法原理：原理：三、甲醇和丙酮三、甲醇和丙酮 药药典典规规定定采采用用气气相相色色谱谱法法测测定定时时不不得得出出现现甲甲醇峰。该法测定甲醇时检测限为醇峰。该法测定甲醇时检测限为3.1ng3.1ng。甲醇甲醇 0.3 0.3丙酮丙酮 5.0%5.0%内标法内标法+校正因子校正因子四、游离磷酸四、游离磷酸 目目的的：地地塞塞米米松松磷磷酸酸钠钠在在生生产产和和贮贮存存过过程程中中可可能能引引入入磷磷酸酸盐盐，需需对对游游离离磷磷酸酸盐盐进进行检查。行检查。原理：原理：方法：方法：钼蓝钼蓝 地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠 检查检查 游离磷酸游离磷酸 精密称取本品精密称取本品20mg20mg，置，置25ml25ml量瓶中，加水量瓶中，加水15ml15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml2.5ml与与1-1-氨基氨基-2-2-萘酚萘酚-4-4-磺酸溶液磺酸溶液1ml1ml，加水至刻度，摇匀，在，加水至刻度，摇匀，在2020放置放置30305050分钟，照分光光度法，在分钟，照分光光度法，在740nm740nm处处测定吸收度，与对照液测定吸收度，与对照液4 4.0ml.0ml同法处理的吸收度比同法处理的吸收度比较，不得更大。较，不得更大。（对照液对照液0.0035%KH2PO4）第四节第四节 含量测定含量测定一、高效液相色谱法（一、高效液相色谱法（48%48%）以以反反相相分分配配色色谱谱用用于于甾甾体体激激素素的的含含量量测定最为广泛。测定最为广泛。固定相：十八烷基硅烷键合硅胶固定相：十八烷基硅烷键合硅胶;流动相：甲醇和水组成的混合液，流动相：甲醇和水组成的混合液，紫紫外外检检测测器器：具具有有4 4-3-3-酮酮基基和和苯苯环环，在在240nm240nm或或280nm280nm附近有吸收附近有吸收示例：黄体酮的含量测定示例：黄体酮的含量测定示例：黄体酮的含量测定示例：黄体酮的含量测定色谱条件：固定相色谱条件：固定相色谱条件：固定相色谱条件：固定相 ODS ODS ODS ODS，流动相，流动相，流动相，流动相 甲醇甲醇甲醇甲醇-水水水水 （65:3565:3565:3565:35），检测波长），检测波长），检测波长），检测波长254nm254nm254nm254nm，内标物内标物内标物内标物 己烯雌酚己烯雌酚己烯雌酚己烯雌酚系统适用性试验：系统适用性试验：系统适用性试验：系统适用性试验：n1000n1000n1000n1000，R R R R符合规定。符合规定。符合规定。符合规定。测定样品：黄体酮原料、注射液。测定样品：黄体酮原料、注射液。定量方法：内标法定量方法：内标法A、对照品B、供试品二、紫外分光光度法（二、紫外分光光度法（30%30%）分分子子中中存存在在4 4-3-3酮酮基基、苯苯环环和和其其他他共共轭轭系统，因而在紫外光区有特征吸收。系统，因而在紫外光区有特征吸收。-3-酮酮240nm（）肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素孕激素 苯环苯环280nm（）雌激素雌激素例：例：例：例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查醋酸地塞米松片的含量均匀度检查醋酸地塞米松片的含量均匀度检查醋酸地塞米松片的含量均匀度检查（1 1 1 1）配制供试液，取）配制供试液，取）配制供试液，取）配制供试液，取10101010片分别进行测片分别进行测片分别进行测片分别进行测（2 2 2 2）测定：）测定：）测定：）测定：240nm240nm240nm240nm（3 3 3 3）计算）计算）计算）计算规格：规格：0.75 mg/0.75 mg/片片 吸收系数吸收系数357357 计算每片以标示量为计算每片以标示量为100100的含量的含量X X，求出平均值和标准差求出平均值和标准差S S，差值，差值A AA+1.80S15.0合格合格A+S15.0不合格不合格A+1.80S15.0且且A+S15.0 复试复试三、比色法三、比色法（一）异烟肼比色法（一）异烟肼比色法1 1、原理、原理HClHCl（缩合）（缩合）肾上腺皮质激素、肾上腺皮质激素、雄性激素和蛋白同雄性激素和蛋白同化激素、孕激素化激素、孕激素420nm暗暗45对照品法对照品法2 2、测定方法、测定方法例：醋酸地塞米松软膏的含量测定为例：例：醋酸地塞米松软膏的含量测定为例：对对照照品品溶溶液液的的制制备备：精精密密称称取取醋醋酸酸地地塞塞米米松松对对照照品品25mg25mg，置置1OOml1OOml量量瓶瓶中中，加加无无水水乙乙醇醇适适量量使使溶溶解解并并稀稀释释至至刻刻度度，摇摇匀匀。精精密密量量取取5m15m1，用用无无水乙醇稀释至水乙醇稀释至5Oml5Oml，摇匀，甚可得。，摇匀，甚可得。供供试试品品溶溶液液的的制制备备：取取本本品品适适量量 (约约相相当当于于醋醋酸酸地地塞塞米米松松25mg)25mg)，精精密密称称定定，置置烧烧杯杯内内，加加无无水水乙乙醇醇约约25m125m1，置置水水浴浴中中加加热热，搅搅拌拌，使使醋醋酸酸地地塞塞米米松松溶溶解解，再再置置冰冰浴浴中中冷冷却却;滤滤过过，滤滤液液置置1OOml1OOml量量瓶瓶中中，同同法法提提取取3 3次次，滤滤液液并并入入量量瓶瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。测测定定方方法法：精精密密量量取取对对照照品品溶溶液液及及供供试试品品溶溶液液各各lOmIlOmI，分分别别置置具具塞塞容容器器中中，置置水水浴浴中中蒸蒸去去乙乙醇醇，残残渣渣中中加加氯氯仿仿lOmIlOmI，振振摇摇，使使残残渣渣溶溶解解，各各精精密密加加0.1%0.1%异异烟烟肼肼甲甲醇醇溶溶液液lOml(lOml(取取异异烟烟肼肼05g05g，加加盐盐酸酸063m1063m1，加加甲甲醇醇使使溶溶解解成成5OOml5OOml，即即得得)，摇摇匀匀，置置5555暗暗处处保保温温45min45min，取取出出、放放冷冷至至室室温温，用用氯氯仿仿稀稀释释至至25ml25ml，摇摇匀匀，在在415nm415nm分分别别测测定定吸吸收收度度，计计算算，即得。即得。本本法法主主要要用用于于甾甾体体激激素素制制剂剂的的测测定定，如如倍倍他他米米松松软软膏膏、哈哈西西奈奈德德软软膏膏、倍倍他他米米松松磷磷酸酸钠钠及及其其注注射射液液等等的含量测定。的含量测定。3 3、讨论、讨论(1)(1)溶剂的选择：溶剂的选择：异烟肼盐酸盐异烟肼盐酸盐甲醇、乙醇甲醇、乙醇无水乙醇无水乙醇一般多选用一般多选用无水无水乙醇乙醇无水甲醇无水甲醇稳定性好稳定性好呈色强度高呈色强度高对植物油的溶解度较小对植物油的溶解度较小（2 2）酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：酸酸:异烟肼异烟肼=2:1=2:1 酸度酸度 异烟肼盐异烟肼盐 酸度酸度 A A异烟肼试液（异烟肼试液（0.5mg/ml0.5mg/ml，000365mol/L 000365mol/L）盐酸浓度为盐酸浓度为00074mol/L 00074mol/L 硫酸用硫酸用00037 mol/L00037 mol/L 醋酸醋酸 为为25%25%（V/VV/V）(约约44mol/L)44mol/L)。（3 3）水分、温度、光线和氧的影响）水分、温度、光线和氧的影响 含水量含水量腙水解腙水解A%A%不挥发溶剂、不吸收水分时不挥发溶剂、不吸收水分时OO2 2与光线无影响与光线无影响t（4 4）关于反应的专属性：）关于反应的专属性：具具有有4 4-3-3酮酮基基的的甾甾体体激激素素在在室室温温不不到到lhlh即即可可定量地与酸性异烟肼反应。定量地与酸性异烟肼反应。其其他他甾甾酮酮化化合合物物需需在在长长时时间间放放置置或或加加热热后后方方可可反反应完全，例如黄体酮，可的松等反应就很慢应完全，例如黄体酮，可的松等反应就很慢C17-C17-酮化合物也可发生反应并形腙，酮化合物也可发生反应并形腙，具有共轭双键的另一些甾酮化合物，如具有共轭双键的另一些甾酮化合物，如5 5-7-7-酮酮醋酸胆甾醇，在相当长的时间内反应仍不能完全醋酸胆甾醇，在相当长的时间内反应仍不能完全Cll-Cll-酮在上述条件下不发生反应。酮在上述条件下不发生反应。C3=OC17=O、C20=O，C11=O不反应不反应 本法本法反应专属性反应专属性 C C3 3酮基。酮基。（5 5）雌激素类药物不能用异烟肼比色法测定含量：）雌激素类药物不能用异烟肼比色法测定含量：A A环为苯环，不具有环为苯环，不具有，不饱和酮基。不饱和酮基。（二）四氮唑比色法（二）四氮唑比色法1 1、四氮唑盐的种类、四氮唑盐的种类最常用的四氮唑盐有两种最常用的四氮唑盐有两种:第第一一种种：2 2，3 3，5-5-三三苯苯基基氯氯化化四四氮氮唑唑（TTCTTC），其其还还原原产产物物为为不不溶溶于于水水的的深深红红色色三三苯苯甲甲臢臢，mm在在48048049Onm49Onm，第第二二种种：蓝蓝四四氮氮唑唑(BT)(BT)，还还原原产产物物为为暗暗蓝蓝色色的的双双甲臢，甲臢，mm在在525nm525nm左右。左右。肾上腺皮质激素类肾上腺皮质激素类C17-醇酮基醇酮基强还原性强还原性2、原理、原理OH-还原还原OOH-分子重排分子重排三苯甲三苯甲臢臢深红深红氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑（TTC）红四氮唑（红四氮唑（RT）3 3、测定方法、测定方法对照品法对照品法4045暗暗4 4、讨论讨论（1 1）基团对反应速度的影响基团对反应速度的影响C C1111=O=O C C1111OHOHC C2121OHOH C C2121-酯酯（2 2）溶剂、水分的影响溶剂、水分的影响含水量含水量5%5%含水含水10%10%A10%A10%含水含水30%30%几无反应几无反应无醛无水乙醇无醛无水乙醇醛醛 A A 无水乙醇无水乙醇具有一定还原性具有一定还原性（3 3）碱的种类及加入顺序）碱的种类及加入顺序反应应在强碱性（反应应在强碱性（pH13.75pH13.75）条件下进行）条件下进行以以氢氧化四甲基铵氢氧化四甲基铵的结果最佳的结果最佳加入顺序：加入顺序：（4 4）O O2 2与光线的影响与光线的影响反应过程反应过程反应产物反应产物怕光怕光避光、快速避光、快速O O2 2影响颜色影响颜色强度和稳定强度和稳定性性隔绝空气、隔绝空气、快速、充快速、充N N2 2甲臢对空臢对空气中的氧气中的氧敏感敏感（5 5）温度与时间温度与时间t甲甲臢臢分解分解%ChP254045（6 6）特点：特点：缺点缺点 影响因素太多影响因素太多 优点优点 测定结果能指示药品的稳定性测定结果能指示药品的稳定性 （氧化及降解产物无此反应）（氧化及降解产物无此反应）1.1.原理原理maxmax=465=465maxmax=515=515雌激素雌激素（三）（三）KoberKober反应比色法反应比色法雌二醇雌二醇-3-甲醚甲醚max=465max=5152.2.特点：特点：优点优点 较高的灵敏度较高的灵敏度 具有一定的选择性具有一定的选择性 缺点缺点 非化学计量反应非化学计量反应 反应应控制条件、反应应控制条件、注意平行原则注意平行原则四、四、HPLC法法USP、BP、JP均采用均采用RPRPHPLCHPLC（大多内标法）（大多内标法）特点特点 ：用样量少，灵敏度高，分离效果好，测定：用样量少，灵敏度高，分离效果好，测定速度快速度快（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）对利用结构特征设计的比色法有干扰）结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！73