离心技术与细胞器分离

离心技术与细胞器分离离心技术与细胞器分离一一 实验目的实验目的1 1、以分离叶绿体、细胞核为例、以分离叶绿体、细胞核为例,掌握掌握离心机离心机的操作的操作技术及两种不同的离心方法：技术及两种不同的离心方法：差速离心法、密度梯差速离心法、密度梯度离心法度离心法;2 2、光镜鉴定各种细胞器的提取情况及了解、光镜鉴定各种细胞器的提取情况及了解叶绿体、叶绿体、细胞核细胞核的形态。的形态。二二 实验原理实验原理 离心技离心技术（centrifugal technique）是根据）是根据颗粒在作匀速粒在作匀速圆周运周运动时都会受到一个向都会受到一个向外的力外的力这一原理而一原理而发展起来的一种分离技展起来的一种分离技术。离心力离心力（centrifugal force，Fc）相相对离心力离心力（relative centrifugal force，RCF）离心力（离心力（centrifugal force，Fc）离心力是离心力是颗粒在一定角度速度下作粒在一定角度速度下作圆周运周运动时受到的一个向外的力。受到的一个向外的力。离心力（离心力（Fc）的大小取决于）的大小取决于角速度角速度与与旋旋转半径半径，即：，即：Fc=m2r 其中其中是旋是旋转角速度，以弧度角速度，以弧度/秒秒为单位；位；r是是颗粒离开旋粒离开旋转中心的距离，以中心的距离，以cm为单位；位；m是是质量，以量，以g为单位。位。相相对离心力（离心力（relative centrifugal force，RCF）又称相又称相对离心加速度，是指离心加速度，是指离心力相当于离心力相当于重力加速度的倍数重力加速度的倍数。在文献中常用。在文献中常用“相相对离离心力心力”或或“数字数字g”表示。表示。RCF=(m2r)/(mg)=1.11910-5 n2r 式中式中r为离心离心转子的半径距离，指离心管的子的半径距离，指离心管的重心至重心至转轴中心中心间的距离，以的距离，以cm为单位；位；g为地球重力加速度（地球重力加速度（980cm/sec2）；）；n为转子每分子每分钟的的转数（数（rpm）。）。离心力的转换列线图离心力的转换列线图 离心机离心机制备性制备性分析性分析性分析性超速离心机分析性超速离心机普通离心机普通离心机冰冻离心机冰冻离心机台式（或地台式（或地面式）普通面式）普通离心机离心机大容量冰大容量冰冻离心机冻离心机小于小于0.6万万转转/分分高速冰冻高速冰冻离心机离心机0.6-2.5万万超速冰冻超速冰冻离心机离心机2.5-8万或万或更高更高 概述概述台式高、超台式高、超速离心机速离心机0.6-100.6-10万转万转/分以上分以上 离心机的基本分类离心机的基本分类离心机的结构离心机的结构 离心机的主要部件为离心机的主要部件为转头转头、主轴、电动机、主轴、电动机和传动装置、制动器、外壳和机座。和传动装置、制动器、外壳和机座。离心机的离心机的转头主要有：主要有：角度角度转头（angle-headed rotors）、甩平式水平）、甩平式水平转头（swing-out rotors）/吊桶式吊桶式转头（swinging bucket rotors）水平转头水平转头 角度转头角度转头离心技术类型离心技术类型 常用离心技常用离心技术一般包括：一般包括：差速离心法（差速离心法（differential velocity centrifugation）密度梯度离心法密度梯度离心法(density gradient centrifugation)。差速离心法差速离心法（differential velocity centrifugation）采用采用逐渐增加离心速度逐渐增加离心速度或或低速和高速交替低速和高速交替进行离心进行离心，使沉降系数不同的颗粒在不同，使沉降系数不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。的方法，称为差速离心法。常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。Figure 8-9 Molecular Biology of the Cell(Garland Science 2008)The preparative ultracentrifuge差速离心法差速离心法（differential velocity centrifugation）密度梯度离心密度梯度离心原理：当不同原理：当不同颗粒存在粒存在浮力密度差浮力密度差时，在离心力，在离心力场下，在密度梯度介下，在密度梯度介质中，中，颗粒或向下沉降，或粒或向下沉降，或向上浮起，一直移向上浮起，一直移动到与它到与它们各自的密度恰好相各自的密度恰好相等的位置，在等的位置，在这里里颗粒没有重量，不管离心多粒没有重量，不管离心多长时间，它，它们再也不移再也不移动了，形成一系列密度区。了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物从而使不同浮力密度的物质得到分离。得到分离。等密度梯度离心一般常用等密度梯度离心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘、蔗糖、甘油等做介油等做介质。此法一般此法一般应用于物用于物质的的大小相近，而密度差异大小相近，而密度差异较大大时。常用来分离提取核酸、。常用来分离提取核酸、亚细胞器和胞器和质粒。粒。Density gradient centrifugation Density gradient centrifugation 实验步骤实验步骤1将材料用蒸馏水洗净。用滤纸吸干水后将材料用蒸馏水洗净。用滤纸吸干水后,去叶脉去叶脉,称取称取2克叶片克叶片,用剪刀剪碎后放入研钵。用剪刀剪碎后放入研钵。2量取量取10ml 匀浆匀浆buffer，先向研钵中倒入，先向研钵中倒入5ml后开后开始研磨。始研磨。3四层纱布过滤，收集四层纱布过滤，收集过滤液过滤液到到10ml离心管中，离心管中，再将剩下的再将剩下的5ml匀浆匀浆buffer 冲洗研钵后也过滤到管冲洗研钵后也过滤到管中，中，5000rpm离心离心5分钟分钟,去上清。去上清。4加入加入 0.5%TritonX-100 2.5ml,混匀，振荡后静混匀，振荡后静置置3分钟分钟.5000rpm离心离心5分钟，去上清。分钟，去上清。5加入加入1ml CSK buffer 振荡混匀振荡混匀,可以用枪头轻轻可以用枪头轻轻吹打沉淀使其溶解吹打沉淀使其溶解.6滤膜过滤（滤膜过滤（300目）目）,去掉未裂解的原生质体及裂解的细去掉未裂解的原生质体及裂解的细胞膜内溶物等大块杂质，收集胞膜内溶物等大块杂质，收集过滤液过滤液。以上步骤所提到的细胞核不纯以上步骤所提到的细胞核不纯,其中混杂有原生质体、线粒其中混杂有原生质体、线粒体、叶绿体体、叶绿体,下面采用蔗糖密度梯度离心分离细胞核和叶绿下面采用蔗糖密度梯度离心分离细胞核和叶绿体。体。7.把含有把含有2.3M蔗糖蔗糖的的CSK buffer 3ml加至于离心管底部加至于离心管底部.8.再把再把3ml 60%percoll CSK buffer 轻轻的平铺于轻轻的平铺于7的溶液上的溶液上方方,用移液枪加时一定要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一用移液枪加时一定要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一溶液之上溶液之上.这时应该能观察到溶液明显的分层现象这时应该能观察到溶液明显的分层现象.9.然后把然后把6中过滤溶液轻轻的平铺于中过滤溶液轻轻的平铺于8的溶液上方。观察分的溶液上方。观察分层现象。层现象。10.3200g离心离心32分钟，溶液梯度层重新分布。分钟，溶液梯度层重新分布。11.分别吸取一些各层的溶液进行改良品红苯酚染色、镜检。分别吸取一些各层的溶液进行改良品红苯酚染色、镜检。观察不同大小不同密度的细胞器的分布情况以及他们的形观察不同大小不同密度的细胞器的分布情况以及他们的形态特征。态特征。试剂匀匀浆buffer：5mM MES,6.8mM CaCl2,11mM KH2PO4,0.3M 山梨醇山梨醇,0.3 M甘露醇甘露醇,0.4PVP-30CSK buffer:100mM KCl,3mM MgCl2,1mM EGTA(PH8.0),10mM PIPES(PH6.8),300mM sucrose.60%percoll CSK buffer：60%percoll,100mM KCl,3mM MgCl2,1mM EGTA(PH8.0),10mM PIPES(PH6.8),300mM sucrose.2.3M sucroseCSK buffer:100mM KCl,3mM MgCl2,1mM EGTA(PH8.0),10mM PIPES(PH6.8),2.3M sucrose.实验结果记录实验结果记录细胞核细胞核叶绿体叶绿体